Name: in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Некоторые штаммы нематод, используемые в этом исследовании, были предоставлены Центром генетики Канеорхаблита, финансируемым NIH (P40OD010440). Конфокальная микроскопия была проведена в Университете Монтаны BioSpectroscopy Core Research Laboratory работал при поддержке NIH Награды P20GM103546 и S10OD021806. Эта работа была частично поддержана грантом NIH GM109053 для E.V., Стипендией Американской ассоциации сердца 18PRE34070028 до X.W., и Монтана Академия наук награда XW. Спонсоры не участвовали в разработке исследования или написании доклада. Мы благодарим М. Элленбекера за обсуждение.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует штаммы C. elegans, в которых помечены потенциальные взаимодействующие партнеры. Настоятельно рекомендуется использовать отрицательный контрольный штамм, в котором один помеченный белок не должен взаимодействовать с другим помеченным партнером ?...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Nooren, I. M., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+protein-protein+interactions.">Diversity of protein-protein interactions.</a> EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).</li><li>Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hub+promiscuity+in+protein-protein+interaction+networks.">Hub promiscuity in protein-protein interaction networks.</a> International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).</li><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+essentials:+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks.">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807 (2010).</li><li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+germ+cell+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).</li><li>Nousch, M., Eckmann, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line.">Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).</li><li>Vangindertael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+optical+super-resolution+microscopy+for+the+adventurous+biologist.">An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).</li><li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+(STORM-RLA)+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization.">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li><li>Thymiakou, E., Episkopou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+signaling+effector-complexes+downstream+of+bmp4+using+PLA,+a+proximity+ligation+assay.">Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+in+situ+protein-protein+complexes+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+using+proximity+ligation+assay.">Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), 52139 (2015).</li><li>Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+as+a+biomolecular+research+tool+-+understanding+its+potential+while+avoiding+pitfalls.">FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls.</a> Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).</li><li>Kodama, Y., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC):+a+5-year+update+and+future+perspectives.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives.</a> Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans.">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45 (3), 185-191 (2008).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+chains+of+mammalian+cytoplasmic+dynein:+identification+and+characterization+of+a+family+of+LC8+light+chains.">Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains.</a> Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).</li><li>Erd&#337;s, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+linear+motif+filtering+protocol+reveals+the+role+of+the+LC8+dynein+light+chain+in+the+Hippo+pathway.">Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway.</a> PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885 (2017).</li><li>Navarro-L&#233;rida, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+of+brain+proteins+that+interact+with+dynein+light+chain+LC8.">Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8.</a> Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).</li><li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DYNLL/LC8:+a+light+chain+subunit+of+the+dynein+motor+complex+and+beyond.">DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond.</a> FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).</li><li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+reveals+the+binding+motif+preference+of+the+LC8/DYNLL+hub+protein+and+predicts+large+numbers+of+novel+binders+in+the+human+proteome.">Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18818 (2011).</li><li>Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+IDP+assemblies:+Unique+properties+of+LC8-associated,+IDP+duplex+scaffolds.">Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds.</a> FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).</li><li>Jespersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+recognition+motifs+for+the+hub+protein+LC8.">Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8.</a> Life Science Alliance. 2 (4), (2019).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+light+chain+DLC-1+promotes+localization+and+function+of+the+PUF+protein+FBF-2+in+germline+progenitor+cells.">Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells.</a> Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).</li><li>Dorsett, M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+dynein+in+the+inhibition+of+germ+cell+proliferative+fate.">A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).</li><li>Ellenbecker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+Light+Chain+DLC-1+Facilitates+the+Function+of+the+Germline+Cell+Fate+Regulator+GLD-1+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).</li><li>Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+DLC-1+associates+with+ribonucleoprotein+complexes+to+promote+mRNA+regulation.">Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation.</a> FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).</li><li>Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+zinc+finger+proteins,+OMA-1+and+OMA-2,+are+redundantly+required+for+oocyte+maturation+in+C.+elegans.">Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans.</a> Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).</li><li>Spike, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+the+oogenic+program+by+components+of+OMA+ribonucleoprotein+particles+in+Caenorhabditis+elegans.">Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).</li><li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK+in+the+C.+elegans+Germline.">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li><li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+staining+in+C.+elegans+using+"freeze-cracking".">Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking".</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Crittenden, S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+immunolabeling+of+Caenorhabditis+elegans.">Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).</li></ol>

При изучении ИЦП в зародышевой линии C. elegans более высокое разрешение, предлагаемое PLA, по сравнению с коиммуностоированием, позволяет визуализировать и количественно оценивать места, где взаимодействия происходят в зародышевой линии. Ранее сообщалось, что DLC-1 напрямую взаимодейст...

Более 80% белков, по оценкам, имеют взаимодействия с другими молекулами1, что подчеркивает, насколько важны ИЦП для выполнения конкретных биологических функций в клетке2. Некоторые белки функционируют как концентраторы, облегчающие сборку более крупных комплексов, необходимых для выживания клеток1. Эти концентраторы посредничают в нескольких ИЦП и помогают организовать белки в сеть, которая облегчает конкретные функции в ячейке3. Формирование белковых комплексов также зависит от биологического контекста, такого как наличие или отсутствие конкретных взаимодействующих партнеров4,события клеточной сигнализации и стадия развития клетки.
C. elegans обычно используется в качестве образцового организма для различных исследований, включая развитие. Простая анатомия этого животного состоит из нескольких органов, в ключая гонад, кишечник и прозрачную кутикулу, которая облегчает анализ развития червя. Зародышевая линия, проживающая в гонаде, является отличным инструментом для изучения того, как зародышевые стволовые клетки созревают в гаметы5, которые превращаются в эмбрионы и, в конечном итоге, следующее поколение потомства. Дистальная область кончика зародышевой линии содержит пул самообновляющихся стволовых клеток(рисунок 1). Как стволовые клетки покидают нишу, они прогрессируют в мейотический пахитен и в конечном итоге превращаются в яйцеклетки в стадии молодых взрослых (Рисунок 1). Эта программа развития в зародышевой плотно регулируется с помощью различных механизмов, в том числе после транскрипционной регуляторной сети при содействии РНК-связывающих белков (RBPs)6. ИЦП имеют важное значение для этой регулятивной деятельности, поскольку ОРП связываются с другими кофакторами для осуществления своих функций.
Есть несколько подходов, которые могут быть использованы для зондирования Для ИЦП в червя, но каждый из них имеет уникальные ограничения. In vivo immunoprecipitation (IP) может быть использован для изоляции белково-белковых комплексов из экстрактов цельного червя; однако этот подход не указывает, где происходит ИЦП у червя. Кроме того, белковые комплексы, которые являются преходящими и только образуются на определенном этапе развития или в ограниченном количестве клеток может быть трудно восстановить путем совместного иммунопреципции. Наконец, IP-эксперименты должны решать проблемы белкового комплекса reassortment после лиза и неспецифического удержания белков на матрице сродства.
Альтернативными подходами к обнаружению ИЦП на месте являются совместное иммуносохранение, рецензирование фюрстерской резонансной передачи энергии (ФРЭТ) и бимолекулярная флуоресценция (BiFC). Совместное иммуностоирование опирается на одновременное обнаружение двух белков, представляющих интерес для фиксированной ткани червя, и измерение степени колокализации сигнала. Использование микроскопии сверхразрешения, которая предлагает более подробную информацию, чем стандартная микроскопия7,помогает более строго проверить колокализацию белка за пределами дифракционно-ограниченного барьера 200-300 нм8. Тем не менее, совместное иммуноскопии с использованием как обычных, так и супер-разрешение микроскопии лучше всего подходит для белков с четко определенными шаблонами локализации. В отличие от этого, он становится гораздо менее информативным для диффузно распределенных взаимодействующих партнеров. Измерение для совместной локализации сигналов на основе перекрытия не дает точной информации о том, являются ли белки в комплексе друг с другом9,,10.
Кроме того, совместное иммунопрецитификации и совместное иммуно-дентинирование белково-белковых комплексов не являются количественными, что затрудняет определение того, являются ли такие взаимодействия значительными. FRET и BiFC являются методами флуоресцентной основе. FRET опирается на пометки белков, представляющих интерес с флуоресцентными белками (FPs), которые имеют спектральное перекрытие, при котором энергия от одного FP (донор) передается другому FP (приемору)11. Эта нерадиационная передача энергии приводит к флуоресценции принимающего FP, которые могут быть обнаружены на соответствующей длине волны выбросов. BiFC основан на восстановлении флуоресцентного белка in vivo. Это влечет за собой разделение GFP на два дополнительных фрагмента, таких как сиксы 1-10 и сугнишие 1112, которые затем сливается с двумя белками, представляющими интерес. Если эти два белка взаимодействуют, дополнительные фрагменты GFP становятся достаточно близкими в непосредственной близости к разить и собрать, воскворуя фторфор GFP. Восстановленный GFP затем непосредственно наблюдается как флуоресценция и указывает, где иЦП произошло.
Таким образом, как FRET и BiFC зависит от больших флуоресцентных тегов, которые могут нарушить функцию помечены белка. Кроме того, FRET и BiFC требуют обильного и сопоставимого выражения помеченных белков для получения точных данных. FRET не может быть пригодным для экспериментов, где один партнер превышает другой, что может привести к высокому фону13. Следует также избегать переэкспрессии в экспериментах BiFC, так как это может вызвать неспецифическую сборку14, что приводит к увеличению фона. Оба метода требуют оптимизации экспрессии и условий визуализации помеченных белков, что может продлить время, необходимое для завершения экспериментов.
Перегоняемая близость анализа (PLA) является альтернативным подходом, который может решить ограничения методов, упомянутых выше. НОАК использует первичные антитела, которые распознают белки, представляющие интерес (или их теги). Эти первичные антитела затем связаны вторичными антителами, содержащими олигонуклеотидные зонды, которые могут гибридизироваться друг с другом, когда в пределах 40 нм (или короче) расстояние15. В результате гибридизированная ДНК усиливается через реакцию ПЦР, которая обнаруживается зондами, которые дополняют ДНК. Это приводит к foci, которые визуализированы микроскопом. Эта технология может обнаружить ИЦП на месте в сложных тканях (т.е. червь гонад), который организован как сборочная линия, содержащая клетки на различных стадиях развития и дифференциации. С PLA, ИЦП могут быть непосредственно визуализированы в фиксированной гонад червя, что выгодно для расследования ли ИЦП происходят на определенном этапе развития. НОАК предлагает более четкое разрешение ИЦП в отличие от анализов на основе совместной локализации, что идеально подходит для проведения точных измерений. При использовании микроскопия сверхразрешения может обеспечить более подробную информацию о местонахождении очагов PLA в клетке. Еще одним преимуществом является то, что фокусы, возникающие в результате реакций НОАК, могут быть подсчитаны по рабочему процессу на основе анализа ImageJ, что делает этот метод количественным.
Семейство световых цепей dynein было впервые описано как подразделение динейнского моторного комплекса16 и предположило, что служит грузовым адаптером. С момента своего первого открытия, LC8 был найден в нескольких белковых комплексов в дополнение к динейн моторный комплекс17,18,19,20. Сканирование для белковыхпоследовательностей,которые содержат мотив взаимодействия LC819 предполагает, что LC8 может иметь много взаимодействий с широким спектром различных белков17,18,19,20,21,22. В результате, LC8 семейные белки в настоящее время считаются концентраторами, которые помогают содействовать сборке больших белковых комплексов19,,22, таких как сборки внутренне неупорядоченных белков21.
Один C. elegans LC8-семейный белок, динеин световой цепи-1 (DLC-1), широко выражается во многих тканях и не обогащается в конкретных подклеточных структурах23,24. Следовательно, выявление биологически значимых партнеров in vivo DLC-1 в C. elegans является сложной задачей по ряду причин: 1) совместное иммунопрецитность не указывает источник ткани, где происходит взаимодействие; 2) ограниченное выражение конкретных партнеров или переходных взаимодействий может препятствовать способности обнаруживать взаимодействие путем совместного иммунопреципции; и 3) диффуза распределения DLC-1 приводит к неспецифическому совпадению с потенциальными белками партнера путем совместного иммуносохранения. Основываясь на этих проблемах, PLA является идеальным подходом для тестирования взаимодействия in vivo с DLC-1.
Ранее сообщалось, что DLC-1 напрямую взаимодействует и служит кофактором для РНК-связывающих белков (RBPs) FBF-223 и GLD-125. Наша работа поддерживает модель DLC-1, выступающей в качестве концентратора белка и предполагает, что DLC-1 облегчает взаимодействие сети, которая охватывает за dynein19,22. Используя GST выпадение ассс, новый DLC-1-взаимодействующих RBP имени OMA-1 был определен26. OMA-1 имеет важное значение для роста яйцеклеток и мейотического созревания27 и функционирует в сочетании с рядом переводческих репрессаторов и активаторов28. В то время как FBF-2 и GLD-1 выражены в стволовых клетках и мейотических областях пахитена, соответственно, OMA-1 диффузно выражается в зародыше из мейотического пахитена через яоциты27 (Рисунок 1). Это говорит о том, что DLC-1 формирует комплексы с ОДП в разных регионах гонада. Было также установлено, что прямое взаимодействие между DLC-1 и OMA-1 наблюдается in vitro не восстанавливается in vivo IP. НОАК была успешно использована в качестве альтернативного подхода для дальнейшего изучения этого взаимодействия в Зародышевой линии C. elegans, и результаты показывают, что НОАК может быть использован для зондирования многих других ИЦП у червя.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy services</td>
			<td>15710</td>
			<td>used to make 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td>Prepare a 1M working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x M9</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26.5 Gauge Needle</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26402</td>
			<td>Needles used for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Lampire</td>
			<td>7500802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>05-529C</td>
			<td>50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>PolyLab</td>
			<td>62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Freeze Sample</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1411-10</td>
			<td>22x40mm, No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Seal Slide</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-15</td>
			<td>22x22mm, No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82029</td>
			<td>Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification red buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82011</td>
			<td>Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82009</td>
			<td>Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Diluent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82008</td>
			<td>Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82007</td>
			<td>Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium for PLA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td>Duolink In Situ mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MINUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82046</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82048</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82030</td>
			<td>Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DFC300G camera, DM5500B microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>115-585-146</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095B-5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>187870100</td>
			<td>Prepare a 250mM working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-FLAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nailpolish</td>
			<td>L.A. colors</td>
			<td>CNP195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>See wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>135030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td>Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>PD7060</td>
			<td>60 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>G10362</td>
			<td>Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>30-2066A-Brown</td>
			<td>Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>task wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>4.4x8.4 inch task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays (242x241x20mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>240845</td>
			<td>Used to make humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>327372500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watchglass</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 strain E. coli</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode strains used in this study (both available upon request)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]</td>
			<td></td>
			<td>UMT 376</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td>
			<td></td>
			<td>UMT 422</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3&#39;UTR + unc-119(+); Reference: this study</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay

Понимание того, когда и где происходят белково-белковые взаимодействия (PPI), имеет решающее значение для понимания функции белка в клетке и как затрагиваются более широкие процессы, такие как развитие. Зародышевой линии Caenorhabditis elegans является отличной модельной системой для изучения ИЦП, которые связаны с регулированием стволовых клеток, мейозом и развитием. Существуют различные хорошо разработанные методы, которые позволяют белки, представляющие интерес быть помечены для распознавания стандартными антителами, что делает эту систему выгодной для анализа перевязки близости (PLA) реакций. В результате НОАК может показать, где ИЦП происходят пространственным и временным образом в зародышевых чертах более эффективно, чем альтернативные подходы. Описано здесь протокол для применения и количественной оценки этой технологии для зондирования ИЦП в Зародыше C. elegans.

Совместное иммуносирование обоих 3xFLAG::DLC-1; GFP и 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP зародышевые линии с антителами FLAG и GFP показали свои модели экспрессии в зародышевой линии(Рисунок 3Aii-iii,3Bii-iii). В то время как GFP был выражен по всей зародыше(Рисунок 3<str...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Этот протокол демонстрирует использование проверки перевязки близости для зондирования белково-белковых взаимодействий на месте в зародышевой линии C. elegans.

В Ситу Обнаружение Рибонуклеопротеин комплекс сборки в C. elegans Germline с использованием Близость Ligation Анализ

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

Анализ перевязки близости позволяет пользователям обнаруживать белково-белковые взаимодействия на месте, выявляя пространственные и временные закономерности взаимодействий. Этот метод может помочь ответить на важные вопросы о регулировании развития C.elegans. Этот метод предлагает сопоставимую чувствительность для обнаружения белково-белковых взаимодействий без сложности других методов, таких как FRET и BiFC.Лица, которые никогда не вскрыли червей, чтобы освободить гонад может бороться с этим шагом. Практика вскрытия червей, и использовать их для иммунофторесценции для ссовершенства обработки и вскрытия методов, прежде чем перейти к НОАК. Для начала выберите от 30 до 40 молодых взрослых червей в стеклянное блюдо часов, содержащее 500 микролитров 1x M9 и левамизола.После сбора червей, тщательно удалить и отказаться от большинства средств массовой информации для удаления бактерий, которые передаются вместе с червями. Добавить в свежие 500 микролитров 1x M9 и levamisole, и использовать пипетку, чтобы аккуратно составить и обойтись средств массовой информации для полоскания червей. Тщательно удалите и отбросьте большинство средств массовой информации.Повторите стирку два-три раза. После мытья оставьте червей примерно в 100 микролитров мультимедиа не более чем на восемь минут. Используя стеклянную или полиэтиленовую пипетку, перенесите червей на слайд микроскопа 25 на 75 миллиметров, покрытый 001%-l-лизином.Удалите излишки мультимедиа так, чтобы на слайде осталось около 15 микролитров мультимедиа. Удаление избыточного буфера имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы расчлененные черви и гонады придерживались слайда. Под рассечением микроскопа, с двумя 26 1 /2-го калибра иглы, место одной иглы над другой так, что концы образуют ножницы.Используя иглы, ориентированные таким образом, вырезать червей за глотки, чтобы освободить зародыши. Рассекаете всех червей в течение пяти минут. После того, как все черви вскрыты, аккуратно поместите 22-миллиметровый на 40-миллиметровый крышку над слайдом так, чтобы он перпендикулярно слайду.Концы крышки должны свисать с горки. Заморозить слайды на предварительно охлажденной алюминиевой блок поддерживается на сухом льду, по крайней мере 20 минут. Аккуратно поместите охлажденный карандаш поверх крышки, чтобы предотвратить крышку от становится свободным из-за расширения льда.Когда вы будете готовы к фиксации, стряхните крышки карандашом и немедленно окуните слайд в банку со свежим, ледяным метанолом в течение одной минуты. Затем аккуратно протрите края слайда, окружающего образец, и нанесите 150 микролитров формальдегида фиксации при комнатной температуре, чтобы исправить в течение пяти минут. Прикоснитесь к слайду на бумажное полотенце под перпендикулярным 90-градусным углом, чтобы фиксатор убежал с горки и впитался в бумажное полотенце.Блокируйте горки дважды в течение 15 минут при комнатной температуре в банке Coplin с 50 миллилитров PBT/BSA. Затем блокируйте слайды раствором PBT/BSA, содержащим 10%-нормальную козлиную сыворотку. Аккуратно протрите края, которые окружают слайд, и нанесите 100 микролитров раствора на каждый слайд.И осторожно агитировать слайд, чтобы помочь распространить решение. Инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре во влажной камере. Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы раствор убежал слайд, и аккуратно протрите края.Чтобы заблокировать горки, нанесите одну каплю блокирующего реагента на пространство 14 на 14 миллиметров. Инкубировать горки в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию во влажной камере. Поместите слайды на бумажное полотенце, чтобы блокирующий реагент убежал с горки, и аккуратно протрите края.Используйте разбавляющие антитела, чтобы разбавить первичные антитела. Нанесите на слайды 40 микролитров разбавленного раствора первичного антитела на 14-на-14-миллиметровое пространство. Поместите горки во влажную камеру и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию.Утром мыть горки дважды в течение пяти минут, каждый с 50 миллилитров 1x мыть буфера при комнатной температуре в банке Coplin. Установите банку Coplin на орбитальный шейкер, установленный до 60 об/мин. Поместите слайды на бумажное полотенце, чтобы вымыть буфер убежать слайд, и аккуратно протрите края.Подготовь 40-микролитровый раствор, содержащий зонды плюс и минус. Добавьте раствор к каждому пространству 14 на 14 миллиметров. Инкубировать горки во влажной камере в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию.Вымойте слайды дважды в течение пяти минут каждый с 50 миллилитров 1x мыть буфер при комнатной температуре в банке Coplin. Установите банку Coplin на орбитальный шейкер, установленный до 60 об/мин. Разбавить буфер перевязки от одного до пяти с ультрапурной водой.Используйте этот буфер, чтобы разбавить лигазы от одного до 40, чтобы подготовить рабочий запас решения перевязки. Поместите слайд на бумажное полотенце, чтобы вымыть буфер убежать стороны, и аккуратно протрите края. Добавьте 40 микролитров раствора перевязки в каждое пространство 14 на 14 миллиметров.Инкубировать горки во влажной камере в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию. После мытья и сушки слайдов, как описано ранее, добавьте 40 микролитров свежеприготовленного раствора усиления, защищенного от света, в каждое пространство 14 на 14 миллиметров. Инкубировать горки во влажной темной камере в течение одного часа и 40 минут при 37 градусах по Цельсию.Вымойте слайды дважды в течение 10 минут каждый с 50 миллилитров 1x мыть буфер B, и мыть слайды один раз в течение одной минуты с 50 миллилитров 01x мыть буфер B.After сушки эпоксидной покрытием периметр слайда, добавить 10 микролитров монтажной среды для каждого образца, и аккуратно заложить крышку сверху, что позволяет для среднего монтажа распространяться. Краска вокруг края крышки с лаком для ногтей, чтобы запечатать крышку и слайд. Избегайте перемещения крышки.Пусть лак для ногтей затвердеет, по крайней мере 20 минут при комнатной температуре, защищены от света. Со-иммуностайтирование зародышей с антителами FLAG и GFP выявило их закономерность экспрессии в зародышевой линии. В то время как GFP был выражен по всей зародышевой линии, выражение OMA-1:GFP было ограничено поздним пахитеном и ооцитами.FLAG иммуностай показывает, что 3xFLAG:DLC-1 был выражен по всей зародышевой линии в обоих штаммов. Область интереса для количественной оценки НОАК в зародышевой линии охватывает поздний пахитен через ооциты во всех зародышах. Это область выражения ОМА-1.3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP зародыши, как представляется, большее количество очагов НОАК в этом регионе по сравнению с 3xFLAG:DLC-1, GFP зародышей. Убедитесь, что есть достаточно воды, чтобы поднять влажность в камере. Кроме того, убедитесь, что слайды находятся на уровне внутри камеры, чтобы предотвратить сток реагентов.После анализа перевязки близости экструдированная гонада может быть изображена на конфокальных микроскопах и количественно определена с помощью рабочего процесса Фиджи, ImageJ. Эта количественная оценка может помочь определить, является ли взаимодействие статистически значимым. НОАК позволила нам оценить взаимодействие на месте между критическими регуляторами развития зародышевой линии нематод.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Понимание начале Органогенез, используя упрощенную<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация Протокола в<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Комплексная оценка зародышевой линии химической токсичности Использование нематоды<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Пространственный и временной анализ активного ERK в<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Половые

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Сила простоты: Эмбрионы морского ежа, как<em&gt; В Vivo</em&gt; Развивающие модели для изучения сложных Cell-к-Cell Signaling сетевых взаимодействий

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Вычислительный анализ микрофлорой Caenorhabditis elegans для изучения распределения ядер, белки и Цитоскелет

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Анализ клеточного цикла в C. elegans микрофлорой с EdU аналог тимидина

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...