Name: in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay at JoVE.com

Algunas cepas de nematodos utilizadas en este estudio fueron proporcionadas por el Centro de Genética Caenorhabditis financiado por el NIH (P40OD010440). La microscopía confocal se realizó en el Laboratorio de Investigación Core de la Universidad de Montana BioSpectroscopy operado con el apoyo de los NIH Awards P20GM103546 y S10OD021806. Este trabajo fue apoyado en parte por la concesión de NIH GM109053 a E.V., American Heart Association Fellowship 18PRE34070028 a X.W., y montana Academy of Sciences award a X.W. Los funders no participaron en el diseño del estudio ni en la redacción del informe. Agradecemos a M. Ellenbecker por su discusión.

NOTA: Este protocolo utiliza cepas de C. elegans en las que se etiquetan socios potenciales que interactúan. Se recomienda encarecidamente que se utilice una cepa de control negativo, en la que no se espera que una proteína etiquetada interactúe con otro compañero de interacción candidato etiquetado. Aquí, GFP solo se utilizó como un control negativo para evaluar el fondo, ya que no se espera que EL DLC-1 interactúe con GFP en el gusano. Se utilizó OMA-1 con la etiqueta GFP como cepa experimental, ya qu...

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Cuando se estudian los IBP en la línea germinal de C. elegans, la mayor resolución ofrecida por el ELA en comparación con la inmunoinserización permite la visualización y cuantificación de lugares donde se producen interacciones en la línea germinal. Anteriormente se informó que el DLC-1 interactúa directamente con OMA-1 utilizando un ensayo desplegable in vitro del GST26; sin embargo, esta interacción no fue recuperada por un pulldown in vivo. La co-inmunoinseración f...

Se estima que más del 80% de las proteínas tienen interacciones con otras moléculas1,lo que hace hincapié en la importancia de los IBP para la ejecución de funciones biológicas específicas en la célula2. Algunas proteínas funcionan como centros que facilitan el montaje de complejos más grandes que son necesarios para la supervivencia celular1. Estos concentradores median múltiples IBP y ayudan a organizar las proteínas en una red que facilita funciones específicas en una celda3. La formación de complejos proteicos también se ve afectada por el contexto biológico, como la presencia o ausencia de socios interactuadores específicos4,eventos de señalización celular y la etapa de desarrollo de una célula.
C. elegans se utiliza comúnmente como un organismo modelo para una variedad de estudios, incluyendo el desarrollo. La simple anatomía de este animal se compone de varios órganos, incluyendo la gónada, el intestino y la cutícula transparente, que facilita el análisis del desarrollo del gusano. La germlina que reside en la gónada es una gran herramienta para estudiar cómo las células madre germinales maduran en gametos5 que se convierten en embriones y, finalmente, en la próxima generación de progenie. La región de la punta distal de la línea germinal contiene un grupo de células madre autonuevas(Figura 1). A medida que las células madre salen del nicho, progresan hacia el paquiteno meiótico y finalmente se convierten en ovocitos en la etapa adulta joven(Figura 1). Este programa de desarrollo en la línea germinal está estrechamente regulado a través de diferentes mecanismos, incluyendo una red reguladora post-transcripción facilitada por proteínas de unión al ARN (RBP)6. Los IBP son importantes para esta actividad regulatoria, ya que los PBP se asocian con otros cofactores para ejercer sus funciones.
Hay varios enfoques que se pueden utilizar para sondear los IBP en el gusano, pero cada uno tiene limitaciones únicas. La inmunoprecipitación in vivo (IP) se puede utilizar para aislar complejos de proteínas y proteínas de extractos de gusanos enteros; sin embargo, este enfoque no indica dónde se produce el IBP en el gusano. Además, los complejos proteicos que son transitorios y sólo se forman durante una etapa específica de desarrollo o en un número limitado de células pueden ser difíciles de recuperar por co-inmunoprecipitación. Por último, los experimentos de IP deben abordar las preocupaciones del reordenamiento complejo de proteínas después de la lisis y la retención no específica de proteínas en la matriz de afinidad.
Los enfoques alternativos para la detección in situ de IBP son la co-inmunoingestión, la transferencia de energía por resonancia de Farster (FRET) y la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC). La inmunoinserción se basa en la detección simultánea de dos proteínas de interés en el tejido de gusano fijo y la medición del alcance de la colocalización de la señal. El uso de la microscopía de superresolución, que ofrece un mayor detalle que la microscopía estándar7,ayuda a probar más rigurosamente la colocalización de proteínas más allá de la barrera limitada por difracción de 200-300 nm8. Sin embargo, la co-inmunomancha utilizando micromicroscopía convencional y de superresolución funciona mejor para proteínas con patrones de localización bien definidos. Por el contrario, se vuelve mucho menos informativo para los socios que interactúan distribuidas difusamente. La medición para la colocalización de señales basadas en la superposición no proporciona información precisa sobre si las proteínas están en complejo entre sí9,10.
Además, la co-inmunoprecipitación y la co-inmuno-inmunoinactividad de los complejos proteína-proteína no son cuantitativas, por lo que es difícil determinar si tales interacciones son significativas. FRET y BiFC son técnicas fluorescentes. FRET se basa en el etiquetado de proteínas de interés con proteínas fluorescentes (FP) que tienen superposición espectral en la que la energía de un FP (donante) se transfiere a otro FP (aceptador)11. Esta transferencia no radiativa de energía da lugar a la fluorescencia del FP aceptador que se puede detectar en su respectiva longitud de onda de emisión. BiFC se basa en la reconstitución de una proteína fluorescente in vivo. Implica dividir GFP en dos fragmentos complementarios, como hélices 1-10 y hélice 1112,que luego se fusionan en dos proteínas de interés. Si estas dos proteínas interactúan, los fragmentos complementarios de GFP se vuelven lo suficientemente cercanos como para plegarse y ensamblarse, reconstituyendo el fluoróforo de GFP. La GFP reconstituida se observa directamente como fluorescencia e indica dónde se ha producido un IBP.
Como tal, tanto FRET como BiFC dependen de grandes etiquetas fluorescentes que pueden alterar la función de la proteína etiquetada. Además, FRET y BiFC requieren una expresión abundante y comparable de las proteínas etiquetadas para obtener datos precisos. FRET puede no ser adecuado para experimentos en los que un socio es superior al otro, lo que puede conducir a un fondo alto13. También se debe evitar la sobreexpresión en experimentos DeFC, ya que esto puede inducir un ensamblado no específico14 que da lugar a un mayor fondo. Ambas técnicas requieren la optimización de las condiciones de expresión e imagen de las proteínas etiquetadas, lo que puede prolongar el tiempo necesario para completar los experimentos.
El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) es un enfoque alternativo que puede abordar las limitaciones de las técnicas mencionadas anteriormente. PLA aprovecha los anticuerpos primarios que reconocen las proteínas de interés (o sus etiquetas). Estos anticuerpos primarios están enlazados por anticuerpos secundarios que contienen sondas de oligonucleótidos que pueden hibridarentrelazados entre sí cuando están dentro de una distancia de 40 nm (o más corta)15. El ADN hibridado resultante se amplifica a través de una reacción PCR, que es detectada por sondas que complementan el ADN. Esto da como resultado focos que son visualizados por un microscopio. Esta tecnología puede detectar IBP in situ en tejidos complejos (es decir, la gónada de gusano), que se organiza como una línea de ensamblaje que contiene células en varias etapas de desarrollo y diferenciación. Con PLA, los IBP se pueden visualizar directamente en una gónada de gusano fija, lo que es ventajoso para investigar si los IBP se producen durante una etapa específica de desarrollo. PLA ofrece una mayor resolución de los IBP en comparación con los ensayos basados en la colocalización, que es ideal para realizar mediciones precisas. Si se utiliza, la microscopía de superresolución tiene el potencial de proporcionar detalles más finos sobre la ubicación de los focos de PLA dentro de una célula. Otra ventaja es que los focos resultantes de las reacciones PLA pueden ser contados por un flujo de trabajo de análisis basado en ImageJ, haciendo que esta técnica sea cuantitativa.
La familia LC8 de cadenas ligeras de dynein fue descrita por primera vez como una subunidad del complejo de motores de dinin16 e hipotetizado para servir como adaptador de carga. Desde su descubrimiento inicial, LC8 se ha encontrado en múltiples complejos proteicos además del complejo motor de dinina17,,18,,19,,20. El escaneo de secuencias de proteínas que contienen el motivo de interacción LC819 sugiere que LC8 puede tener muchas interacciones con una amplia gama de diferentes proteínas17,,18,19,20,21,22. Como resultado, las proteínas de la familia LC8 ahora se consideran centros que ayudan a promover el ensamblaje de complejos proteicos más grandes19,,22, como ensamblajes de proteínas intrínsecamente desordenadas21.
Una proteína de la familia C. elegans LC8, cadena de luz de dinneina-1 (DLC-1), se expresa ampliamente en muchos tejidos y no se enriquece en estructuras subcelulares específicas23,24. En consecuencia, la identificación de socios in vivo biológicamente relevantes de DLC-1 en C. elegans es difícil por varias razones: 1) la coinmunoprecipitación no indica la fuente de tejido donde se produce la interacción; 2) la expresión limitada de socios particulares o las interacciones transitorias pueden obstaculizar la capacidad de detectar una interacción por coinmunoprecipitación; y 3) la distribución difusa de DLC-1 conduce a una superposición no específica con las proteínas potenciales asociadas mediante la inmunoingestión. Basado en estos desafíos, PLA es un enfoque ideal para probar interacciones in vivo con DLC-1.
Se ha informado previamente que DLC-1 interactúa directamente con y sirve como cofactor para las proteínas de unión al ARN (RBP) FBF-223 y GLD-125. Nuestro trabajo apoya el modelo de DLC-1 sirviendo como proteína de cubo y sugiere que DLC-1 facilita una red de interacción que abarca más allá de la dinin19,,22. Usando un ensayo desplegable GST, se ha identificado un nuevo RBP de interacción con DLC-1 denominado OMA-126. OMA-1 es importante para el crecimiento de ovocitos y la maduración meiótica27 y funciona en conjunto con una serie de represores y activadores traslacionales28. Mientras que FBF-2 y GLD-1 se expresan en las células madre y las regiones meioticas de paquiteno, respectivamente, OMA-1 se expresa difusamente en la línea germinal del paquiteno meiotico a través de los ovocitos27 (Figura 1). Esto sugiere que el DLC-1 forma los complejos con los RBP en las diversas regiones de la gónada. También se ha encontrado que la interacción directa entre DLC-1 y OMA-1 observada in vitro no se recupera mediante una IP in vivo. El PLA se ha utilizado con éxito como un enfoque alternativo para estudiar más a fondo esta interacción en la línea germinal de C. elegans, y los resultados sugieren que el PLA se puede utilizar para sondear muchos otros IBP en el gusano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy services</td>
			<td>15710</td>
			<td>used to make 4% working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td>Prepare a 1M working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x M9</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>various</td>
			<td>various</td>
			<td>see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26.5 Gauge Needle</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26402</td>
			<td>Needles used for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Lampire</td>
			<td>7500802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>05-529C</td>
			<td>50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>PolyLab</td>
			<td>62101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Freeze Sample</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1411-10</td>
			<td>22x40mm, No. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip to Seal Slide</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1404-15</td>
			<td>22x22mm, No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82029</td>
			<td>Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplification red buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82011</td>
			<td>Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82009</td>
			<td>Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody Diluent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82008</td>
			<td>Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82007</td>
			<td>Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium for PLA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td>Duolink In Situ mounting medium with DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MINUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLUS Probe</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td>Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82046</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82048</td>
			<td>Duolink In Situ wash Buffer B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82030</td>
			<td>Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DFC300G camera, DM5500B microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa 594</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>115-585-146</td>
			<td>Use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>111-545-144</td>
			<td>Use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7095B-5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>187870100</td>
			<td>Prepare a 250mM working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-FLAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td>Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nailpolish</td>
			<td>L.A. colors</td>
			<td>CNP195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>See wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>135030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td>Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>PD7060</td>
			<td>60 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GFP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>G10362</td>
			<td>Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>30-2066A-Brown</td>
			<td>Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>task wipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>34120</td>
			<td>4.4x8.4 inch task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays (242x241x20mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>240845</td>
			<td>Used to make humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>327372500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td>Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watchglass</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 strain E. coli</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode strains used in this study (both available upon request)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]</td>
			<td></td>
			<td>UMT 376</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td>
			<td></td>
			<td>UMT 422</td>
			<td>dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3&#39;UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3&#39;UTR + unc-119(+); Reference: this study</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of ribonucleoprotein complex assembly in the c. elegans germline using proximity ligation assay

Comprender cuándo y dónde se producen las interacciones proteína-proteína (IPP) es fundamental para comprender la función proteica en la célula y cómo se ven afectados procesos más amplios como el desarrollo. La línea germinal Caenorhabditis elegans es un gran sistema modelo para estudiar los IBP relacionados con la regulación de las células madre, la meiosis y el desarrollo. Existen una variedad de técnicas bien desarrolladas que permiten etiquetar proteínas de interés para su reconocimiento por anticuerpos estándar, lo que hace que este sistema sea ventajoso para las reacciones de ensayo de ligadura de proximidad (PLA). Como resultado, el PLA es capaz de mostrar dónde los IBP se producen de manera espacial y temporal en líneas germinales de manera más eficaz que los enfoques alternativos. Aquí se describe un protocolo para la aplicación y cuantificación de esta tecnología para sondear los IBP en la línea germinal c. elegans.

Co-inmunomanchado de ambos 3xFLAG::DLC-1; GFP y 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP germlíneas con anticuerpos FLAG y GFP revelaron sus patrones de expresión en la línea germinal(Figura 3Aii-iii,3Bii-iii). Mientras que la GFP se expresó a lo largo de la línea germinal(Figura 3Aiii), la expresión OMA-1::GFP se limitó al paquiteno tardío y a los ovocitos(Figura 3...

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In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Este protocolo demuestra el uso del ensayo de ligadura de proximidad para sondear las interacciones proteína-proteína in situ en la línea germinal de C. elegans.

Detección en situ del conjunto del complejo de ribonucleoproteína en la línea germinal de C. elegans utilizando el ensayo de ligadura de proximidad

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

El ensayo de ligadura de proximidad permite a los usuarios detectar interacciones proteína-proteína in situ, revelando patrones espaciales y temporales de las interacciones. Esta técnica puede ayudar a responder preguntas importantes sobre la regulación del desarrollo de C.elegans. Esta técnica ofrece una sensibilidad comparable para la detección de interacciones proteína-proteína sin la complejidad de otras técnicas, como FRET y BiFC.Individuos que nunca han diseccionado gusanos para liberar las gónadas pueden luchar con este paso. Practique gusanos diseccionados y utilícelos para la inmunofluorescencia para perfeccionar las técnicas de manipulación y disección antes de pasar al PLA. Para empezar, escoge de 30 a 40 gusanos adultos jóvenes en un plato de cristal de reloj que contenga 500 microlitros de 1x M9 y levamisol.Después de recoger los gusanos, retire y deseche cuidadosamente la mayoría de los medios para eliminar las bacterias que se transfieren junto con los gusanos. Añadir 500 microlitros frescos de 1x M9 y levamisol, y utilizar la pipeta para extraer y dispensar suavemente el medio para enjuagar los gusanos. Retire y deseche cuidadosamente la mayoría de los medios.Repita el lavado de dos a tres veces. Después de los lavados, deje los gusanos en unos 100 microlitros de medios durante no más de ocho minutos. Usando una pipeta de vidrio o polietileno, transfiera los gusanos a un portaobjetos de microscopio de 25 milímetros por 75 milímetros recubierto con 001%poli-L-lisina.Retire el exceso de medios para que permanezcan aproximadamente 15 microlitros de medios en la diapositiva. La eliminación del exceso de búfer es fundamental para garantizar que los gusanos diseccionados y las gónadas se adhieran a la diapositiva. Bajo un microscopio de disección, con dos agujas de calibre 26 de 1/2, coloque una aguja sobre la otra para que los extremos formen un par de tijeras.Usando las agujas orientadas de esta manera, cortar los gusanos detrás de la faringe para liberar las líneas germinales. Disecciona todos los gusanos en cinco minutos. Después de diseccionar todos los gusanos, coloque suavemente un cubreobjetos de 22 milímetros por 40 milímetros sobre la diapositiva para que sea perpendicular a la diapositiva.Los extremos del cubreobjetos deben colgarse de la corredera. Congele los portaobjetos en un bloque de aluminio pre-refrigerado mantenido sobre hielo seco durante al menos 20 minutos. Coloque suavemente un lápiz frío en la parte superior del cubreobjetos para evitar que el cubreobjeto se afloje debido a la expansión del hielo.Cuando esté listo para la fijación, deslice los cubreobjetos con un lápiz e inmediatamente sumerja la diapositiva en un frasco que contenga metanol fresco y helado durante un minuto. A continuación, limpie suavemente los bordes de la diapositiva que rodea la muestra y aplique 150 microlitros de fijador de formaldehído a temperatura ambiente para fijar durante cinco minutos. Toque la diapositiva en una toalla de papel en un ángulo perpendicular de 90 grados para dejar que el fijador se salga de la diapositiva y absorberlo en la toalla de papel.Bloquee los portaobjetos dos veces durante 15 minutos a temperatura ambiente en un frasco de Coplin con 50 mililitros de PBT/BSA. A continuación, bloquee los portaobjetos con una solución PBT/BSA que contenga un 10% de suero de cabra normal. Limpie suavemente los bordes que rodean la diapositiva y aplique 100 microlitros de la solución a cada diapositiva.Y agitar suavemente la diapositiva para ayudar a extender la solución. Incubar durante una hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Coloque la diapositiva sobre una toalla de papel para dejar que la solución se escale y limpie suavemente los bordes.Para bloquear las diapositivas, aplique una gota del reactivo de bloqueo al espacio de 14 milímetros por 14 milímetros. Incubar los toboganes durante una hora a 37 grados centígrados en una cámara húmeda. Coloque las diapositivas en una toalla de papel para dejar que el reactivo de bloqueo salga corriendo de la diapositiva y limpie suavemente los bordes.Utilice el diluyente de anticuerpos para diluir los anticuerpos primarios. Aplique 40 microlitros de la solución de anticuerpos primarios diluidos por espacio de 14 por 14 milímetros en las diapositivas. Coloque los portaobjetos en una cámara húmeda e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados.Por la mañana, lave los portaobjetos dos veces durante cinco minutos, cada uno con 50 mililitros de 1x tampón de lavado A a temperatura ambiente en un frasco de Coplin. Ajuste el frasco de Coplin en un agitador orbital establecido en 60 rpm. Coloque las diapositivas en una toalla de papel para dejar que el tampón de lavado se escalda de la diapositiva y limpie suavemente los bordes.Prepare una solución de 40 microlitros que contenga sondas más y menos. Agregue la solución a cada espacio de 14 por 14 milímetros. Incubar los toboganes en una cámara húmeda durante una hora a 37 grados centígrados.Lave los portaobjetos dos veces durante cinco minutos cada uno con 50 mililitros de 1x tampón de lavado A a temperatura ambiente en un frasco de Coplin. Ajuste el frasco de Coplin en un agitador orbital establecido en 60 rpm. Diluir el buffer de ligadura uno a cinco con agua ultrapura.Utilice este búfer para diluir la ligasa de uno a 40 para preparar un stock de trabajo de solución de ligadura. Coloque la diapositiva sobre una toalla de papel para dejar que el tampón de lavado se salga de los lados y limpie suavemente los bordes. Agregue 40 microlitros de la solución de ligadura a cada espacio de 14 por 14 milímetros.Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de lavar y secar los portaobjetos como se describió anteriormente, agregue 40 microlitros de solución de amplificación recién preparada, protegidos de la luz, a cada espacio de 14 por 14 milímetros. Incubar los toboganes en la cámara húmeda y oscura durante una hora y 40 minutos a 37 grados centígrados.Lave los portaobjetos dos veces durante 10 minutos cada uno con 50 mililitros de tampón de lavado B, y lave las diapositivas una vez durante un minuto con 50 mililitros de tampón de lavado 01x B.Después de secar el perímetro recubierto de epoxi de la corredera, agregue 10 microlitros de montaje medio a cada muestra y coloque suavemente un cubreobjetos en la parte superior, lo que permite que el medio de montaje se extienda. Pinta alrededor del borde del cubreobjetos con esmalte de uñas para sellar el cubreobjetos y deslizarlo. Evite mover las cubiertas.Deje que el esmalte de uñas se endurezca durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. La co-inmunostaining de las líneas germinales con anticuerpos FLAG y GFP reveló su patrón de expresión en la línea germinal. Mientras que la GFP se expresaba a lo largo de la línea germinal, la expresión OMA-1:GFP se limitaba al paquiteno tardío y a los ovocitos.La inmunostaining FLAG muestra que 3xFLAG:DLC-1 se expresó a través de la línea germinal en ambas cepas. La región de interés para la cuantificación del PLA en la línea germinal abarcó el paquiteno tardío a través de los ovocitos en todas las líneas germinales. Esta es la región de la expresión OMA-1.3xFLAG:DLC-1, OMA-1:Las líneas germinales GFP parecían tener una mayor cantidad de focos PLA dentro de esta región en comparación con las líneas germinales 3xFLAG:DLC-1, GFP. Asegúrese de que haya suficiente agua para elevar la humedad en la cámara. Además, asegúrese de que los portaobjetos estén nivelados dentro de la cámara para evitar la escorrentía de reactivos.Tras el ensayo de ligadura de proximidad, las gónadas extruidas se pueden ver en un microscopio confocal y cuantificarse utilizando el flujo de trabajo de Fiji, ImageJ. Esta cuantificación puede ayudar a determinar si la interacción es estadísticamente significativa. PLA nos permitió evaluar las interacciones in situ entre los reguladores críticos del desarrollo de la línea germinal de los nematodos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridación en<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Evaluación completa de la línea germinal Química de toxicidad de los nematodos<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Análisis espacial y temporal de ERK en el Activo<em&gt; C. elegans</em&gt; línea germinal

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

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El poder de la simplicidad: Erizo de mar como embriones<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelos de desarrollo para el estudio celular de la célula-a-complejo de señalización de red Interacciones

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Análisis de ciclo celular en la línea germinal de C. elegans con la EdU de análogo de la timidina

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...