Name: assessing the age-specific phagocytic ability of adult drosophila melanogaster hemocytes using an in vivo phagocytosis assay
Uploaded: 2020-06-11T13:30:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Ce travail a été appuyé par des subventions des National Institutes of Health R03 AG061484-02 et de l’UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.

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	<li>Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+DNA/RNA+methyltransferase+contributes+to+robust+host+defense+in+ageing+animals+by+regulating+sphingolipid+metabolism.">Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+and+aging:+the+enemy+within.">Immunity and aging: the enemy within.</a> Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).</li><li>Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumu+is+required+for+circulating+hemocyte+differentiation+and+phagocytosis+in+Drosophila.">Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95 (2018).</li><li>Petraki, S., Alexander, B., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+blood+cell+populations+of+the+Drosophila+melanogaster+larva.">Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva.</a> Journal of Visualized Experiments. 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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit ici est un moyen fiable de quantifier différents aspects de la phagocytose, dans des conditions expérimentales contrôlées. Nous notons que nous avons seulement testé cette procédure avec des particules bactériennes gram négatives et les résultats peuvent différer si des particules bactériennes gram positives sont utilisées. En effet, il serait intéressant de comparer les réponses phagocytiques aux bactéries gram négatives et gram positives dans différentes conditions expérimentales. L’utilisation d’un nano-injecteur permet un contrôle précis des volumes d’injection, assurant que chaque mouche est injectée avec le même volume de particules. L’une des limites au protocole vient des incohérences dans les préparations de particules. Les particules s’agrégent une fois congelées, de sorte que de petites variations dans les volumes de dilution, ou l’absence de vortex, peuvent affecter la concentration des particules entre les expériences. Pour minimiser les variations possibles des concentrations de particules entre les âges, il est avantageux d’injecter des mouches âgées de 1 à 5 semaines le même jour, à l’aide de la même solution d’aiguille et de particules. Un autre inconvénient potentiel est que pendant les dissections, le récipient dorsal et /ou la cuticule peuvent facilement être endommagés si les broches ne sont pas manipulées correctement. Pour éviter de perturber le récipient dorsal, réduisez au minimum le nombre de broches utilisées par dissection. L’avantage de cette méthode de dissection est que toutes les étapes de fixation, de lavage et de coloration peuvent être effectuées dans la plaque de dissection. Parce que les cuticules sont épinglées, cela empêche les cuticules d’être perdues entre les étapes.
Par rapport aux méthodes existantes18,19,25,26,27,28,29, le protocole décrit a ses avantages et ses limites. En disséquant le vaisseau dorsal, nous sommes en mesure de visualiser et de quantifier les hémocytes individuels à cet endroit. Cela permet de détecter des variations subtiles de l’activité phagocytique entre les groupes expérimentaux. D’autres méthodes visualisent les particules étiquetées fluorescentement en recueillant des hémocytes à l’aide d’un essai de bleed/scrape19,25,26,27, ou par une cuticule ventrale intacte18,19,28,29; cependant, les hémocytes individuels ne peuvent pas être évalués lorsqu’ils sont visualisés à travers la cuticule dorsale. L’avantage de ce protocole, par rapport à la méthode Bleed/Scrape est que notre méthode nous permet d’évaluer uniquement les hémocytes associés au vaisseau dorsal, et ne tenir compte des cellules circulantes ou ceux le long de la paroi du corps, qui peut être fonctionnellement différent. Disséquer le récipient dorsal supprime également la nécessité d’inclure une deuxième série d’injections avec un quencher de fluorescence, comme Trypan bleu19,26. C’est parce que toutes les particules non liées ou englouties par une cellule seront emportées pendant les étapes de lavage. Inversement, d’autres méthodes peuvent être plus faciles à exécuter parce qu’elles ne nécessitent pas de dissections. Bien que la dissection du vaisseau dorsal soit facile à apprendre, cette étape ajoute un niveau de complexité qui peut ne pas être faisable dans certaines conceptions expérimentales.
Bien que l’utilisation décrite de ce test de phagocytose in vivo soit d’évaluer et de quantifier les événements phagocytiques entre différents âges, ce protocole est très adaptable et peut être utilisé pour analyser différents aspects de la phagocytose entre le génotype, le sexe, ou le type de tissu. Avec la phagocytose étant d’une importance centrale pour la plupart des animaux multicellulaires, comprendre comment ce processus diminue avec l’âge pourrait conduire à de meilleurs traitements thérapeutiques pour la population vieillissante. Cette approche offre un potentiel à long terme pour élucider les aspects des changements liés à l’âge dans la réponse immunitaire, avec un accent particulier sur la phagocytose.

Le système immunitaire inné, qui se compose de barrières physiques et chimiques à l’infection ainsi que les composants cellulaires, est évolutif conservé à travers les organismes multicellulaires1,2. En tant que première ligne de défense, le système immunitaire inné joue un rôle essentiel dans la lutte contre les pathogènes envahissants chez tous les animaux1,2,3. Les composants de la réponse immunitaire innée comprennent un large éventail de types de cellules qui sont classés sur la base qu’ils manquent de spécificité et de mémoire immunologique2,3,4. Chez l’homme, ces types de cellules incluent les monocytes et les macrophages phagocytiques, les neutrophiles et les cellules tueuses naturelles cytotoxiques4,5. Bien qu’avoir un système immunitaire fonctionnel est impératif pour la survie de l’hôte, il est clair que la fonction des cellules immunitaires diminue avec l’âge, un phénomène connu sous le nom d’immunosénescence5,6. Être en mesure d’évaluer les changements liés à l’âge dans la réponse immunitaire, y compris les différents aspects du processus de phagocytose, pourrait aider à notre compréhension de l’immunosénescence. La procédure que nous décrivons ici fournit une approche efficace et répétable pour évaluer et quantifier les événements phagocytiques par les hémocytes dans Drosophila melanogaster.
Drosophila est un modèle idéal pour étudier la réponse immunitaire pour de nombreuses raisons. D’une part, il existe un ensemble complet d’outils génétiques qui permettent de manipuler facilement l’expression des gènes d’une manière dépendante des tissus7. Ces outils comprennent une collection de mutants, des stocks d’interférence d’ARN, des stocks GAL4/UAS, et le panneau de référence génétique de Drosophila qui contient 205 lignes différentes consanguines pour lesquelles les séquences entières du génome sont cataloguées8. Le court cycle de vie de Drosophila et le grand nombre d’individus produits permettent aux chercheurs de tester plusieurs individus dans un environnement contrôlé, dans un court laps de temps. Cela améliore grandement la capacité d’identifier les différences subtiles dans les réponses immunitaires à l’infection chez les génotypes, entre les sexes ou à travers les âges. Fait important, de nombreux composants et fonctions génétiques de la réponse immunitaire innée, y compris la phagocytose, sont conservés évolutionnellement entre la Drosophila et les mammifères1,2.
Dans Drosophila, le processus de phagocytose qui suit l’infection est effectué par des hémocytes phagocytiques appelés plasmatocytes, qui sont équivalents aux macrophages mammifères9. Les hémocytes sont essentiels pour reconnaître un large éventail de particules et éliminer les agents pathogènes microbiens9,10,11,12,13. Ces cellules expriment une variété de récepteurs qui doivent se différencier de non-soi, et d’initier les événements de signalisation nécessaires pour effectuer le processus phagocytique10,11,12,13,14,15. Une fois qu’une particule est liée, elle commence à être intériorisée par la réorganisation du cytosquelette actine et le remodelage de la membrane plasmatique pour se développer autour de la particule, formant une tasse phagocytique11,12,13,14. Au cours de ce processus, un autre ensemble de signaux indique à la cellule d’intérioriser davantage la particule en fermant la tasse phagocytique, formant un phagosome11,12,13,14,15. Le phagosome subit alors un processus de maturation, s’associant à différentes protéines et fusionnant avec des lysosomes, formant un phagolysome acide11,12,13,14,15. À ce stade, les particules peuvent être efficacement dégradées et éliminées11,12,13,14,15. Drosophila études ont révélé que les mouches plus âgées (4 semaines d’âge) ont une capacité réduite pour effacer une infection par rapport aux mouches plus jeunes (1 semaine), probablement due, au moins en partie, à une baisse dans certains aspects de la phagocytose16,17.
La méthode décrite ici utilise deux particules distinctes d’E. coli, l’une portant un fluorophore standard et l’autre sensible au pH, pour évaluer deux aspects différents de la phagocytose : l’engorgement initial des particules et la dégradation des particules dans le phagolysome. Dans ce test, la fluorescence des particules fluorées est observable lorsque les particules sont liées et englouties par les hémocytes, tandis que les particules sensibles au pH fluorent uniquement dans les conditions de pH bas du phagosome. Des événements fluorescents peuvent alors être observés dans les hémocytes qui se localisent le long du récipient dorsal. Nous nous concentrons sur les hémocytes localisés au vaisseau dorsal, qui fournissent un repère anatomique pour localiser les hémocytes qui sont connus pour contribuer au dégagement bactérien, et de les isoler uniformément. Cependant, les hémocytes dans d’autres parties du corps et l’hémolymphe sont également importants pour le dégagement. Bien que nous n’ayons pas étudié cette population cellulaire, notre procédure générale pourrait être applicable pour les essais phagocytiques de ces cellules aussi bien. Un avantage de notre approche est que nous pouvons quantifier les événements phagocytes dans les hémocytes individuels, nous permettant de détecter la variation subtile dans les processus phagocytiques. D’autres études qui visualisent les événements fluorescents à travers la cuticule18,19 ne tiennent pas compte des différences dans le nombre d’hémocytes présents, ce qui est particulièrement important à considérer dans notre cas que le nombre total d’hémocytes devraient changer avec l’âgede 17ans .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:531px;" width="531">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">0.10 mm Insect pins</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">26002-10</td>
			<td style="width:159px;">Here: pins are cut in half, and the sharp end is used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">1 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:96px;">Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td style="width:159px;">Filled with mineral oil to load needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">15% Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:96px;">Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td style="width:159px;">for dissection media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">16 % Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:159px;">EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">1x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">3 mL Trasnfer Pipet</td>
			<td style="width:96px;">Falcon</td>
			<td>357524</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">3.5&#34; Glass Capillaries</td>
			<td style="width:96px;">Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td style="width:159px;">1.14mm O.D X 3.5&#34; length X 0.53&#34; I.D</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">35x10 mm Petri dishes</td>
			<td style="width:96px;">Becton Dickinson</td>
			<td>351008</td>
			<td style="width:159px;">Used as dissection plate, filled half way with Sylgard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">6x penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:159px;">for dissection media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">70% Glycerol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Analog Vortex mixer</td>
			<td style="width:96px;">VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Biological point forceps, Dumont No. 5</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td style="width:159px;">Diluted 1:1000 in 1x PBST</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Drosophila strain</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:159px;">w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">E. coli (K-12 strain) BioParticles&#8482;, Alexa Fluor&#8482; 594 conjugate</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>E23370</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Glass slides</td>
			<td style="width:96px;">Premiere</td>
			<td>D17026102</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Live cell imaging solution</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td style="width:159px;">preferred buffer for particle preparation and dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:96px;">Mpbio</td>
			<td>194836</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Nanoject II automatic nanoliter injector</td>
			<td style="width:96px;">Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials</td>
			<td style="width:96px;">Genesee</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td style="width:159px;">Size: 25 X 95 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Nutating Mixer</td>
			<td style="width:96px;">Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-043</td>
			<td style="width:159px;">Speed used: 20 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">pHrodo&#8482; Red E. coli BioParticles&#8482; Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>P35361</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Schneider&#39;s Drosophila cell culture media (1x)</td>
			<td style="width:96px;">Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td style="width:159px;">Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:96px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:159px;">2mM (or 20%) working</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Sylgard 184 Silicone elastomer</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td style="width:159px;">Prepare according to provided protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Tween 20</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td style="width:159px;">For PBS + 0.1% tween</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Vertical Pipette Puller Model 700C</td>
			<td style="width:96px;">David Kopf Instruments</td>
			<td>812368</td>
			<td style="width:159px;">Heater: 55&#8451; Solenoid: 45</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope</td>
			<td style="width:96px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:159px;">Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the age-specific phagocytic ability of adult drosophila melanogaster hemocytes using an in vivo phagocytosis assay

La phagocytose est une fonction essentielle de la réponse immunitaire innée. Ce processus est effectué par des hémocytes phagocytiques dont la fonction principale est de reconnaître un large éventail de particules et de détruire les pathogènes microbiens. À mesure que les organismes vieillissent, ce processus commence à diminuer, mais on sait peu de choses sur les mécanismes sous-jacents ou sur la base génétique de l’immunosénescence. Ici, une injection basée sur l’essai in vivo phagocytose est utilisée pour évaluer les changements liés à l’âge dans différents aspects de la phagocytose, tels que la liaison, l’engloutissement, et la dégradation des particules intériorisées, en quantifiant les événements phagocytiques dans les hémocytes chez les adultes Drosophila. Drosophila melanogaster est devenu un modèle idéal pour étudier les changements liés à l’âge dans la fonction immunitaire innée pour de nombreuses raisons. D’une part, de nombreux composants et fonctions génétiques de la réponse immunitaire innée, y compris la phagocytose, sont conservés évolutionnellement entre la Drosophila et les mammifères. Pour cette raison, les résultats obtenus à partir de l’utilisation de ce protocole sont susceptibles d’être largement pertinents pour comprendre les changements liés à l’âge dans la fonction immunitaire dans une variété d’organismes. En outre, nous notons que cette méthode fournit des estimations quantitatives de la capacité phagocytique des hémocytes, qui pourrait être utile pour une variété de sujets de recherche, et ne doit pas être limitée à des études sur le vieillissement.

Pour illustrer les méthodes d’injection décrites, la figure 1A montre le site d’injection sur Drosophila melanogaster, ainsi que la façon dont le colorant alimentaire permet une confirmation visuelle que la mouche a été injectée (figure 1B). L’ajout de colorant alimentaire contribue également à la reconnaissance d’une aiguille obstruée. Les injections peuvent être effectuées dans l’abdomen, mais gardez le site d’injection cohérent entre les expériences. Cela permettra de minimiser les variations possibles entre chaque expérience.
Pour visualiser les particules étiquetées fluorescentes dans les hémocytes résidents le long du récipient dorsal, nous avons disséqué le vaisseau dorsal et la cuticule abdominale attachée. La figure 2A-F décrit les méthodes de dissection.
Pour évaluer la capacité par âge des mouches jeunes et âgées à effectuer la phagocytose, les hémocytes le long du récipient dorsal sont visualisés à l’aide d’un microscope fluorescent. Pour s’assurer que seules les cellules le long du vaisseau dorsal sont comptées, les anticorps ou les gènes marqués par GFP pour certains marqueurs de cellules sanguines ou collagènes spécifiques au cœur, tels que l’hémolectine, ou la péricardine (figure 3), respectivement, peuvent être utilisés22,23,24. Les particules fluorescentes D’E. coli mesurent 1 mm de longueur, tandis que les hémocytes mesurent 10 mm de diamètre17. Seuls les événements fluorescents situés dans un diamètre de 10 mm centré sur un noyau positif à la DAPI sont comptés (figure 4). Pour quantifier les événements fluorescents, le logiciel ImageJ est utilisé (Figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig1.jpg"> Figure 1 : Site d’injection et vérification visuelle. (A) Le côté latéral du thorax est percé d’une aiguille à capuchon tiré. (B) Les injections sont vérifiées visuellement en ajoutant du colorant alimentaire vert à la solution de particules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig2.jpg"> Figure 2 : Dissection des vaisseaux dorsaux. (A) Les broches sont placées dans le thorax et l’abdomen postérieur (flèches noires). (B-C) Deux incisions horizontales (flèches vertes) sont faites à l’extrémité postérieure de l’abdomen (B), et l’extrémité antérieure (C). (D) Une incision verticale (flèche verte) est faite au milieu de l’abdomen, reliant les deux coupes horizontales. (E) Broches facultatives (*) sont utilisées pour filet ouvrir la cavité abdominale, exposant les tissus internes. (F) Les tissus internes (culture, intestin, utérus, ovaires, corps gras) sont enlevés, exposant le vaisseau dorsal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig3.jpg"> Figure 3 : Vue ventrale d’un récipient dorsal disséqué d’une femelle de 5 semaines injectée de particules sensibles au pH, tachée d’anticorps dirigé contre la péricardine (A). La ligne blanche pointillée trace le côté latéral du récipient dorsal, avec une flèche pointant vers la région antérieure. (B) Image agrandie de (A): grappes d’hémocytes (flèche bleue) qui dégradent activement les bactéries, dans la première chambre aortique du récipient dorsal. (C) Image agrandie de (A) décrivant la matrice extracellulaire (ECM) protéine de collagène-comme, Pericardine (flèche verte), qui maintient le récipient dorsal en place24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig4.jpg"> Figure 4 : Vaisseau dorsal disséqué et hémocytes associés d’une mouche femelle injectée de particules sensibles au pH, ou particules fluoro. (A) Le vaisseau dorsal et les hémocytes associés à des particules E. coli sensibles au pH englouties (rouge), ou (E) fluoro-étiquetés particules E. coli (rouge), isolés d’une mouche vieille d’une semaine, après avoir récupéré pendant 60 min. (B,F) Magnifié inset de (A) et (E) (boîte blanche), respectivement, montrant deux hémocytes individuels avec des événements dénommables. (C) Le vaisseau dorsal et les hémocytes associés avec des particules E. coli sensibles au pH englouties (rouge), ou ( G) des particules E. coli (rouge) étiquetées fluoro, isolées d’une mouche vieille de 5 semaines, après avoir récupéré pendant 60 min. (D,H) Encastrés de (C) et (G) (boîte blanche), respectivement, montrant deux hémocytes individuels avec des événements dénommables. La ligne blanche pointillée trace le côté latéral du récipient dorsal, avec une flèche pointant vers la région antérieure. Noyaux tachés de DAPI (bleu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig5.jpg"> Figure 5 : Quantification des événements phagocytiques dans un hémocyte de 10 mm à l’aide du compteur cellulaire dans ImageJ. (A) Après ouverture de l’image(s) dans ImageJ, l’outil d’avis de compteur de cellules peut être utilisé pour suivre les événements phagocytiques par cellule. (B) Cet outil attribuera une couleur différente à chaque cellule sélectionnée à compter, chaque point correspondant à un événement fluorescent dans cette cellule. En appuyant sur 'alt+y' affiche une table indiquant le nombre d’événements comptés par cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Ce protocole décrit un test in vivo de phagocytose utilisé pour évaluer et quantifier la capacité des jeunes et âgés Drosophila melanogaster hémocytes aux bactéries phagocytose.

Évaluation de la capacité phagocytique spécifique à l’âge des hémocytes adultes de Drosophila melanogaster à l’aide d’un test de phagocytose in vivo

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Notre protocole fournit une approche efficace et reproductible pour évaluer et quantifier les événements phagocytiques chez les oursocytes. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons quantifier les événements phagocytiques dans les hémocytes individuels qui nous permet de détecter les variations des processus phagocytiques chez les génotypes chez les mouches individuelles. Effectuer des dissections peut être difficile, donc lors de l’exécution de cette technique pour la première fois, la pratique des dissections autant que possible avant d’effectuer la procédure complète.Commencez par préparer des aiguilles en verre pour l’injection. Remplissez une seringue d’un millimètre d’huile minérale et fixez l’aiguille hypodermique de calibre 30 fournie avec le nano-injecteur. Insérez l’aiguille de calibre 30 dans l’extrémité émoussée d’une aiguille capillaire tirée et remplissez-la d’huile minérale.Retirez lentement l’aiguille de calibre 30 en vous assurant qu’aucune bulle d’air n’est formée. Retirer le collet et placer l’anneau O scellé avec l’indentation vers le haut. Placez le plus grand anneau O sur le piston en métal, puis rattachez le collet sans serrer.Insérez le piston métallique dans l’extrémité émoussée de l’aiguille en verre remplie d’huile et poussez-le doucement vers le bas en l’insérant dans le plus grand anneau O. Serrez ensuite le collet jusqu’à ce qu’il soit bien sûr. Après avoir rempli l’aiguille de particules fluoro ou sensibles au pH, injecter les mouches dans la plaque sternopleural du thorax.L’injection est réussie si le colorant vert va dans la mouche. Placez les mouches injectées dans un nouveau flacon de nourriture en notant l’heure à l’injection de la première et de la dernière mouche. Mentez le flacon sur le côté jusqu’à ce que toutes les mouches se soient rétablies pour les empêcher de rester coincées dans la nourriture.Orientez le côté ventral de mouche vers le haut sous un stéréomicroscope disséquant. Puis insérez une épingle à insectes dans le thorax et une autre à travers l’extrémité la plus postérieure de l’abdomen près des organes génitaux. Une fois que toutes les mouches ont été épinglées, utilisez un pipet de transfert pour ajouter suffisamment de supports de dissection pour couvrir les mouches.Retirez la tête avec des ciseaux cuticules, et faire une incision horizontale directement au-dessus de la broche postérieure dans l’abdomen, puis un autre à l’extrémité la plus antérieure de l’abdomen. Faire une incision verticale reliant les deux incisions horizontales qui ouvrira la cavité abdominale. Utilisez des forceps pour enlever les organes et les tissus internes, en vous assurant d’éviter le vaisseau dorsal.Si nécessaire, utilisez des broches supplémentaires pour fixer les extrémités coupées de la cuticule. Retirez ensuite le thorax avec les ciseaux cuticules. Jetez le média de dissection et remplacez-le par un millilitre de 4%PFA, protégeant les dissections de la lumière autant que possible.Fixer les dissections pendant 15 minutes à température ambiante tout en basculant à 20 rpm. Retirez ensuite le fixatif et ajoutez un millilitre de 1X PBST. Si désiré, tacher les dissections avec des anticorps.Après avoir monté les cuticules sur une lame de microscope, utilisez des forceps pour les orienter vers le haut du côté ventral et assurez-vous que le vaisseau dorsal est visible. Les mouches jeunes et âgées ont été évaluées pour la capacité spécifique à l’âge d’effectuer la phagocytose par imagerie fluorescente des hémocytes le long du vaisseau dorsal. Un anticorps contre la péricardine a été utilisé pour s’assurer que seules les cellules le long du vaisseau dorsal ont été comptées.Étant donné que les particules E.coli étiquetées fluorescentes ont une longueur d’un micromètre et que les hémocytes ont 10 micromètres de diamètre, seuls les événements fluorescents d’un diamètre de 10 micromètres centrés sur un noyau positif au DAPI ont été comptés. Le logiciel ImageJ a ensuite été utilisé pour quantifier les événements. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de visualiser que la mouche a été effectivement injectée et de se rappeler que le moment est critique.L’achèvement des injections et des dissections en temps opportun aidera à minimiser les erreurs expérimentales et les variations possibles du taux phagocytique. Cette technique permettra aux chercheurs d’explorer une variété de sujets de recherche, y compris les questions concernant l’immunité cellulaire, les différentes populations de cellules sanguines ou la distinction phagocytose de la production de AMP lors d’une réponse immunitaire réussie.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

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