Name: assessing the age-specific phagocytic ability of adult drosophila melanogaster hemocytes using an in vivo phagocytosis assay
Uploaded: 2020-06-11T13:30:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health R03 AG061484-02 e dall'UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.

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	<li>Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+DNA/RNA+methyltransferase+contributes+to+robust+host+defense+in+ageing+animals+by+regulating+sphingolipid+metabolism.">Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+and+aging:+the+enemy+within.">Immunity and aging: the enemy within.</a> Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).</li><li>Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumu+is+required+for+circulating+hemocyte+differentiation+and+phagocytosis+in+Drosophila.">Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95 (2018).</li><li>Petraki, S., Alexander, B., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+blood+cell+populations+of+the+Drosophila+melanogaster+larva.">Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva.</a> Journal of Visualized Experiments. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+of+adult+Drosophila+do+not+expand,+but+control+survival+after+bacterial+infection+by+induction+of+Drosocin+around+their+reservoir+at+the+respiratory+epithelia.">Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia.</a> BioRxiv. 578864, (2019).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto è un modo affidabile per quantificare diversi aspetti della fagocitosi, in condizioni sperimentali controllate. Notiamo che abbiamo testato questa procedura solo con particelle batteriche negative grammo e i risultati possono differire se vengono utilizzate particelle batteriche grampositive positive. In effetti, sarebbe interessante confrontare le risposte fagocitiche con batteri negativi al grammo e grammo positivi in diverse condizioni sperimentali. L'uso di un nano-iniettore consente un controllo preciso sui volumi di iniezione, assicurando che ogni mosca venga iniettata con lo stesso volume di particelle. Una limitazione al protocollo deriva dalle incoerenze nei preparati delle particelle. Le particelle si aggregano una volta congelate, quindi piccole variazioni nei volumi di diluizione, o mancanza di vortice, possono influenzare la concentrazione di particelle tra gli esperimenti. Per ridurre al minimo le possibili variazioni delle concentrazioni di particelle tra le età, è utile iniettare mosche di 1 e 5 settimane nello stesso giorno, utilizzando la stessa soluzione di ago e particelle. Un altro potenziale inconveniente è che durante le dissezioni, il recipiente dorsale e/o la cuticola possono essere facilmente danneggiati se i perni non vengono maneggiati correttamente. Per evitare di interrompere il recipiente dorsale, ridurre al minimo il numero di pin utilizzati per dissezione. Il vantaggio di questo metodo di dissezione è che tutti i passaggi di fissazione, lavaggio e colorazione possono essere eseguiti nella piastra di dissezione. Poiché le cutiche sono bloccate, ciò impedisce che le cutichevenga vengano perse tra un passo e l'altro.
Rispetto ai metodi esistenti18,19,25,26,27,28,29, il protocollo descritto ha i suoi vantaggi e limitazioni.29 Sezionando il vaso dorsale, siamo in grado di visualizzare e quantificare i singoli emociti in questa posizione. Ciò consente di rilevare sottili variazioni nell'attività fagocitica tra gruppi sperimentali. Altri metodi visualizzano particelle etichettate fluorescenti raccogliendo emociti utilizzando un saggio di Bleed/Scrape19,25,26,27, o attraverso una cuticola ventrale intatta18,19,28,29;29 tuttavia, gli emociti individuali non possono essere valutati quando vengono visualizzati attraverso la cuticola dorsale. Il vantaggio di questo protocollo, rispetto al metodo Bleed/Scrape è che il nostro metodo ci permette di valutare solo gli emociti associati al vaso dorsale, e tiene conto delle cellule circolanti o di quelle lungo la parete del corpo, che possono essere funzionalmente diverse. Dissezione del vaso dorsale rimuove anche la necessità di includere un secondo ciclo di iniezioni con un quencher a fluorescenza, come Trypan blu19,26. Questo perché le particelle non legate o inghiottite da una cellula saranno lavate via durante i passaggi di lavaggio. Al contrario, i metodi alternativi possono essere più facili da eseguire perché non richiedono dissezioni. Mentre sezionare la nave dorsale è facile da imparare, questo passo aggiunge un livello di complessità che potrebbe non essere fattibile in alcuni progetti sperimentali.
Anche se l'uso descritto di questo saggio di fagocitosi in vivo è quello di valutare e quantificare gli eventi fagocitici tra diverse età, questo protocollo è altamente adattabile e può essere utilizzato per analizzare diversi aspetti della fagocitosi tra genotipo, sesso o tipo di tessuto. Con la fagocitosi di importanza centrale per la maggior parte degli animali multicellulari, capire come questo processo diminuisce con l'età potrebbe portare a migliori trattamenti terapeutici per la popolazione che invecchia. Questo approccio offre un potenziale a lungo termine per chiarire aspetti dei cambiamenti legati all'età nella risposta immunitaria, con particolare attenzione alla fagocitosi.

Il sistema immunitario innato, che consiste in barriere fisiche e chimiche alle infezioni e componenti cellulari, è evoluzionario conservato tra gli organismi multicellulari1,2. Come prima linea di difesa, il sistema immunitario innato svolge un ruolo fondamentale nella lotta contro gli agenti patogeni invasori in tutti gli animali1,2,3. I componenti della risposta immunitaria innata includono una vasta gamma di tipi di cellule che sono classificati sulla base del fatto che mancano di specificità e memoria immunologica2,3,4. Nell'uomo, questi tipi di cellule includono monociti fagociti ciofetici e macrofagi, neutrofili e cellule killer naturali citotossiche4,5. Pur avendo un sistema immunitario funzionale è imperativo per la sopravvivenza dell'ospite, è chiaro che la funzione delle cellule immunitarie diminuisce con l'età, un fenomeno noto come immunosenescenza5,6. Essere in grado di valutare i cambiamenti legati all'età nella risposta immunitaria, compresi i diversi aspetti del processo di fagocitosi, potrebbe aiutare nella nostra comprensione dell'immunosenescenza. La procedura che descriviamo qui fornisce un approccio efficace e ripetibile per valutare e quantificare gli eventi fagocitici da emociti in Drosophila melanogaster.
La drosophila è un modello ideale per studiare la risposta immunitaria per molte ragioni. Per uno, c'è una vasta serie di strumenti genetici disponibili che consentono di manipolare facilmente l'espressione genica in modo dipendente dai tessuti7. Questi strumenti includono una raccolta di mutanti, stock di interferenze di RNA, stock di GAL4/UAS e il pannello di riferimento genetico di Drosophila che contiene 205 diverse linee inbred per le quali le sequenze di genoma sono catalogate8. Il breve ciclo di vita della Drosophila e il gran numero di individui prodotti consentono ai ricercatori di testare più individui in un ambiente controllato, in un breve periodo di tempo. Questo migliora notevolmente la capacità di identificare sottili differenze nelle risposte immunitarie all'infezione tra genotipi, tra i sessi o tra le età. È importante sottolineare che molti componenti genetici e funzioni della risposta immunitaria innata, tra cui la fagocitosi, sono evolutivamente conservati tra la Drosophila e i mammiferi1,2.
Nella Drosophila, il processo di fagocitosi che segue l'infezione è effettuato da emociti fagociti chiamati plasmatociti, che sono equivalenti ai macrofagi dei mammiferi9. Gli emociti sono essenziali per riconoscere una vasta gamma di particelle e cancellare i patogeni microbici9,10,11,12,13. Queste cellule esprimono una varietà di recettori che devono differenziarsi da se stessi e avviare eventi di segnalazione necessari per eseguire il processo fagocitico10,11,12,13,14,15. Una volta che una particella è legata, inizia ad essere interiorizzata dalla riorganizzazione del citoscheletro actina e dal rimodellamento della membrana plasmatica per espandersi intorno alla particella, formando una coppa fagocitica11,12,13,14. Durante questo processo, un altro insieme di segnali dice alla cellula di internalizzare ulteriormente la particella chiudendo la coppa fagocitica, formando un fagosoma legato alla membrana11,12,13,14,15. Il fagosoma segue quindi un processo di maturazione, associandosi a diverse proteine e fondendosi con lisosomi, formando un fagolisosoma acido11,12,13,14,15. A questo punto, le particelle possono essere efficacemente degradate ed eliminate11,12,13,14,15. Studi sulla Drosophila hanno rivelato che le mosche più anziane (4 settimane di età) hanno una ridotta capacità di eliminare un'infezione rispetto alle mosche più giovani (1 settimana di età), probabilmente a causa, almeno in parte, di un declino in alcuni aspetti della fagocitosi16,17.
Il metodo qui descritto utilizza due particelle separate di E. coli, etichettate a calore, una con un fluoroforo standard e una sensibile al pH, per valutare due diversi aspetti della fagocitosi: l'inghiottimento iniziale delle particelle e la degradazione delle particelle nel fagolofosoma. In questo saggio, la fluorescenza fluoro-particella è osservabile quando le particelle sono legate e inghiottite da emociti, mentre le particelle sensibili al pH fluorescenza solo nelle condizioni di basso pH del fagosoma. Gli eventi fluorescenti possono quindi essere osservati negli emociti che si localizzano lungo la nave dorsale. Ci concentriamo sugli emociti localizzati nel vaso dorsale, che forniscono un punto di riferimento anatomico per individuare gli emociti che sono noti per contribuire alla distanza batterica e per isolarli costantemente. Tuttavia, gli emociti in altre parti del corpo e l'emolinfa sono anche importanti per la clearance. Anche se non abbiamo studiato questa popolazione cellulare, la nostra procedura generale potrebbe essere applicabile anche per i saggi fagocitici di queste cellule. Un vantaggio del nostro approccio è che possiamo quantificare gli eventi fagocitici all'interno di singoli emociti, permettendoci di rilevare sottili variazioni nei processi fagocitici. Altri studi che visualizzano eventi fluorescenti attraverso la cuticola18,19 non tengono conto delle differenze nel numero di emociti presenti, il che è particolarmente importante da considerare nel nostro caso in quanto si prevede che i conteggi totali degli emociti cambino all'etàdi 17anni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:531px;" width="531">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">0.10 mm Insect pins</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">26002-10</td>
			<td style="width:159px;">Here: pins are cut in half, and the sharp end is used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">1 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:96px;">Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td style="width:159px;">Filled with mineral oil to load needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">15% Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:96px;">Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td style="width:159px;">for dissection media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">16 % Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:159px;">EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">1x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">3 mL Trasnfer Pipet</td>
			<td style="width:96px;">Falcon</td>
			<td>357524</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">3.5&#34; Glass Capillaries</td>
			<td style="width:96px;">Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td style="width:159px;">1.14mm O.D X 3.5&#34; length X 0.53&#34; I.D</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">35x10 mm Petri dishes</td>
			<td style="width:96px;">Becton Dickinson</td>
			<td>351008</td>
			<td style="width:159px;">Used as dissection plate, filled half way with Sylgard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">6x penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:159px;">for dissection media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">70% Glycerol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Analog Vortex mixer</td>
			<td style="width:96px;">VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Biological point forceps, Dumont No. 5</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td style="width:159px;">Diluted 1:1000 in 1x PBST</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Drosophila strain</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:159px;">w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">E. coli (K-12 strain) BioParticles&#8482;, Alexa Fluor&#8482; 594 conjugate</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>E23370</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Glass slides</td>
			<td style="width:96px;">Premiere</td>
			<td>D17026102</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Live cell imaging solution</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td style="width:159px;">preferred buffer for particle preparation and dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:96px;">Mpbio</td>
			<td>194836</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Nanoject II automatic nanoliter injector</td>
			<td style="width:96px;">Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials</td>
			<td style="width:96px;">Genesee</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td style="width:159px;">Size: 25 X 95 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Nutating Mixer</td>
			<td style="width:96px;">Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-043</td>
			<td style="width:159px;">Speed used: 20 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">pHrodo&#8482; Red E. coli BioParticles&#8482; Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>P35361</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Schneider&#39;s Drosophila cell culture media (1x)</td>
			<td style="width:96px;">Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td style="width:159px;">Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:96px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:159px;">2mM (or 20%) working</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Sylgard 184 Silicone elastomer</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td style="width:159px;">Prepare according to provided protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Tween 20</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td style="width:159px;">For PBS + 0.1% tween</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Vertical Pipette Puller Model 700C</td>
			<td style="width:96px;">David Kopf Instruments</td>
			<td>812368</td>
			<td style="width:159px;">Heater: 55&#8451; Solenoid: 45</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope</td>
			<td style="width:96px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:159px;">Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the age-specific phagocytic ability of adult drosophila melanogaster hemocytes using an in vivo phagocytosis assay

La fagocitosi è una funzione essenziale della risposta immunitaria innata. Questo processo viene eseguito da emociti fagociti la cui funzione primaria è quella di riconoscere una vasta gamma di particelle e distruggere gli agenti patogeni microbici. Con l'invecchiamento degli organismi, questo processo inizia a declinare, ma si sa poco sui meccanismi sottostanti o sulla base genetica dell'immunosenescenza. Qui, un'iniezione a base di analisi della fagocitosi in vivo viene utilizzata per valutare i cambiamenti legati all'età in diversi aspetti della fagocitosi, come il legame, l'inghiottimento e la degradazione delle particelle interiorizzate, quantificando gli eventi fagocitici negli emociti nella dott.ssa Drosophila. Drosophila Per prima cosa, molti componenti genetici e funzioni della risposta immunitaria innata, tra cui la fagocitosi, sono conservate evolutivamente tra la Drosophila e i mammiferi. Per questo motivo, i risultati ottenuti dall'utilizzo di questo protocollo sono probabilmente ampiamente rilevanti per comprendere i cambiamenti legati all'età nella funzione immunitaria in una varietà di organismi. Inoltre, notiamo che questo metodo fornisce stime quantitative della capacità fagocitica emocite, che potrebbe essere utile per una varietà di argomenti di ricerca e non deve essere limitato agli studi di invecchiamento.

Per illustrare i metodi di iniezione descritti, la figura 1A mostra il sito di iniezione sulla Drosophila melanogaster, nonché il modo in cui il colorore alimentare consente una conferma visiva dell'inserimento della mosca (Figura 1B). L'aggiunta di coloralimentare aiuta anche nel riconoscimento di un ago ostruito. Le iniezioni possono essere eseguite nell'addome, ma mantenere il sito di iniezione coerente attraverso gli esperimenti. Ciò consentirà di ridurre al minimo le possibili variazioni tra ogni esperimento.
Per visualizzare le particelle fluorescenti etichettate all'interno di emociti residenti lungo la nave dorsale, abbiamo sezionato il vaso dorsale e attaccato la cuticola addominale. Figura 2A-F delinea i metodi di dissezione.
Per valutare la capacità specifica dell'età delle mosche giovani e anziane di effettuare la fagocitosi, gli emociti lungo il vaso dorsale vengono visualizzati utilizzando un microscopio fluorescente. Per garantire che vengano conteggiate solo le cellule lungo la nave dorsale, gli anticorpi o i geni marcati TGF per alcuni marcatori di cellule del sangue o collagene specifico del cuore, come Hemese e Hemolectin, o Pericardin (Figura 3), possono essere utilizzati rispettivamente22,23,,24. Le particelle di E. coli etichettate fluorescenti hanno una lunghezza di 1 mm, mentre gli emociti hanno undiametrodi 10 mm . Vengono conteggiati solo gli eventi fluorescenti situati all'interno di un diametro di 10 mm centrato su un nucleo POSITIVO a DAPI (Figura 4). Per quantificare gli eventi fluorescenti, viene utilizzato il software ImageJ (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig1.jpg"> Figura 1: Sito di iniezione e verifica visiva. (A) Il lato laterale del torace è trafitto con un ago tirato-capillare. (B) Le iniezioni vengono verificate visivamente aggiungendo colorante alimentare verde alla soluzione delle particelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig2.jpg"> Figura 2: Dissezione della nave dorsale. (A) I Pin sono collocati nel torace e nell'addome posteriore (frecce nere). (B-C) Due incisioni orizzontali (frecce verdi) vengono effettuate all'estremità posteriore dell'addome (B) e all'estremità anteriore (C). (D) Un'incisione verticale (freccia verde) è fatta al centro dell'addome, collegando i due tagli orizzontali. (E) Perni opzionali (-) vengono utilizzati per presentare la cavità addominale, esponendo il tessuto interno. (F) Il tessuto interno (coltivazione, intestino, utero, ovaie, corpi grassi) viene rimosso, esponendo il vaso dorsale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig3.jpg"> Figura 3: vista ventrale di un vaso dorsale sezionato da una femmina di 5 settimane iniettata con particelle sensibili al pH, macchiata di anticorpo diretto contro Pericardin (A). La linea bianca punteggiata delinea il lato laterale del recipiente dorsale, con una freccia rivolta verso la regione anteriore. (B) Immagine ingrandita di (A): grappoli di emociti (freccia blu) che stavano attivamente degradando i batteri, all'interno della prima camera aortica della nave dorsale. (C) Immagine ingrandita di (A) che delinea la proteina simile al collagene a matrice extracellulare (ECM), Pericardin (freccia verde), che tiene la nave dorsale in posizione24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig4.jpg"> Figura 4: Vaso dorsale dissected e emociti associati da una mosca femminile iniettata con particelle sensibili al pH, o particelle di fluoro. (A) Il recipiente dorsale e gli emociti associati con particelle E. coli sensibili al pH inghiottite (rosso), o (E)con etichettatura fluoro e particelle di E. coli (rosso), isolate da una mosca vecchia di 1 settimana, dopo essersi recuperate per 60 min. ( (B,F) Insetficato di (A) e (E) (scatola bianca), rispettivamente, mostrando due emociti individuali con eventi numerabili. (C) Il recipiente dorsale e gli emociti associati con particelle E. coli sensibili al pH inghiottite (rosso) o ( G) particelle di E. coli con etichettatura fluoro (rosso), isolate da una mosca vecchia di 5 settimane, dopo essersi recuperate per 60 m. ( ( (D,H) Insetficato di (C) e (G) (scatola bianca), rispettivamente, mostrando due emociti individuali con eventi numerabili. La linea bianca punteggiata delinea il lato laterale del recipiente dorsale, con una freccia rivolta verso la regione anteriore. Nuclei macchiati con DAPI (blu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig5.jpg"> Figura 5: Quantificare gli eventi fagocitici all'interno di un emocito da 10 mm utilizzando il contatore cellulare in ImageJ. (A) Dopo l'apertura di immagini in ImageJ, lo strumento Cell Counter Notice può essere utilizzato per tenere traccia degli eventi fagocitici per cella. (B) Questo strumento assegnerà un colore diverso a ogni cella selezionata per essere conteggiata, con ogni punto corrispondente a un evento fluorescente all'interno di quellacella. Premendo 'alt-y' verrà visualizzata una tabella che mostra il numero di eventi conteggiati per cella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Questo protocollo descrive un saggio in vivo di fagocitosi usato per valutare e quantificare la capacità degli emociti di Drosophila melanogaster giovani e invecchiati di batteri fagocitosi.

Valutare la capacità fagocitica specifica per età degli emociti di Drosophila melanogaster adulto utilizzando un in vivo Phagocitosis

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Il nostro protocollo fornisce un approccio efficace e ripetibile per valutare e quantificare gli eventi fagocitici negli emociti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo quantificare gli eventi fagocitici all'interno dei singoli emociti che ci consente di rilevare variazioni nei processi fagocitici tra i genotipi nelle singole mosche. Eseguire le dissezioni può essere impegnativo, quindi quando si esegue questa tecnica per la prima volta, praticare le dissezioni il più possibile prima di eseguire l'intera procedura.Inizia preparando aghi di vetro per iniezione. Riempire una siringa di un millimetro con olio minerale e attaccare l'ago ipodermico calibro 30 fornito con il nano-iniettore. Inserire l'ago calibro 30 nell'estremità smussata di un ago capillare tirato e riempirlo con olio minerale.Rimuovere lentamente l'ago calibro 30 assicurandosi che non si formino bolle d'aria. Rimuovere la pinza e posizionare l'O-ring sigillato con l'indentazione rivolta verso l'alto. Posizionare l'O-ring più grande sullo stantuffo metallico, quindi riattaccare la pinza senza stringere.Inserire lo stantuffo metallico nell'estremità smussata dell'ago di vetro riempito d'olio e spingerlo delicatamente verso il basso inserendolo nell'O-ring più grande. Quindi stringere la pinza fino a quando non è sicuro. Dopo aver riempito l'ago con particelle sensibili al fluoro o al pH, iniettare le mosche nella piastra sternopleurale del torace.L'iniezione ha successo se il colorante verde sta andando al volo. Posizionare le mosche iniettate in una nuova fiala alimentare notando il momento in cui la prima e l'ultima mosca sono state iniettate. Posare la fiala su un lato fino a quando tutte le mosche non si sono riprese per evitare che si blocchino nel cibo.Orientare il lato ventrale della mosca verso l'alto sotto uno stereomicroscopio sezionato. Quindi inserire una spilla insetto nel torace e un'altra attraverso l'estremità più posteriore dell'addome vicino ai genitali. Una volta che tutte le mosche sono state appuntate, utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere abbastanza mezzi di dissezione per coprire le mosche.Rimuovere la testa con le forbici della cuticola e fare un'incisione orizzontale direttamente sopra il perno posteriore nell'addome, quindi un'altra all'estremità più anteriore dell'addome. Fai un'incisione verticale che collega le due incisioni orizzontali che apriranno la cavità addominale. Utilizzare le forcelle per rimuovere gli organi e i tessuti interni, assicurandosi di evitare il vaso dorsale.Se necessario, utilizzare perni aggiuntivi per fissare le estremità tagliate della cuticola. Quindi rimuovere il torace con le forbici della cuticola. Scartare il supporto di dissezione e sostituirlo con un millilitro del 4%PFA, proteggendo il più possibile le dissezioni dalla luce.Fissare le dissezioni per 15 minuti a temperatura ambiente mentre si dondola a 20 giri/min. Quindi rimuovere il fissatore e aggiungere un millilitro di 1X PBST. Se lo si desidera, macchiare le dissezioni con anticorpi.Dopo aver montato le cuticole su uno scivolo al microscopio, utilizzare le forcep per orientarle sul lato ventrale verso l'alto e assicurarsi che il vaso dorsale sia visibile. Le mosche giovani e invecchiate sono state valutate per la capacità specifica dell'età di effettuare la fagocitosi mediante imaging fluorescente di emociti lungo il vaso dorsale. Un anticorpo contro la pericardina è stato usato per garantire che fossero contate solo le cellule lungo il vaso dorsale.Poiché le particelle E.coli etichettate fluorescentmente hanno una lunghezza di un micrometro e gli emociti hanno un diametro di 10 micrometri, sono stati contati solo eventi fluorescenti all'interno di un diametro di 10 micrometri centrato su un nucleo positivo a DAPI. Il software ImageJ è stato quindi utilizzato per quantificare gli eventi. Quando si tenta questa procedura, è importante visualizzare che la mosca è stata effettivamente iniettata e ricordare che la tempistica è fondamentale.Completare le iniezioni e le dissezioni in modo tempestivo aiuterà a ridurre al minimo l'errore sperimentale e le possibili variazioni del tasso fagocitico. Questa tecnica consentirà ai ricercatori di esplorare una varietà di argomenti di ricerca tra cui domande riguardanti l'immunità cellulare, diverse popolazioni di cellule del sangue o la fagocitosi distintiva dalla produzione amp durante una risposta immunitaria di successo.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

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