Name: assessing the age-specific phagocytic ability of adult drosophila melanogaster hemocytes using an in vivo phagocytosis assay
Uploaded: 2020-06-11T13:30:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

この研究は、国立衛生研究所R03 AG061484-02と自然数理科学大学ベクトンディキンソン教員研究基金からの助成金によって支えられました。

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	<li>Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+DNA/RNA+methyltransferase+contributes+to+robust+host+defense+in+ageing+animals+by+regulating+sphingolipid+metabolism.">Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+and+aging:+the+enemy+within.">Immunity and aging: the enemy within.</a> Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).</li><li>Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumu+is+required+for+circulating+hemocyte+differentiation+and+phagocytosis+in+Drosophila.">Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95 (2018).</li><li>Petraki, S., Alexander, B., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+blood+cell+populations+of+the+Drosophila+melanogaster+larva.">Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva.</a> Journal of Visualized Experiments. 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著者らは開示するものは何もない。

ここで説明するプロトコルは、制御された実験条件下で、食作用の異なる側面を定量化する信頼できる方法です。我々は、グラム陰性細菌粒子でこの手順をテストしただけであり、グラム陽性細菌粒子が使用される場合、結果が異なる可能性があることに注意してください。実際、異なる実験条件でグラム陰性菌とグラム陽性菌の両方に貪食反応を比較することは興味深いでしょう。ナノインジェクターを使用することで、注入量を正確に制御することができ、各フライに同じ粒子の量が注入されることを保証します。プロトコルの 1 つの制限は、パーティクルの準備の不整合です。粒子は凍結すると凝集するので、希釈量の小さな変動、または渦の欠如は、実験間の粒子濃度に影響を与える可能性があります。年齢間の粒子濃度の可能な変動を最小限に抑えるために、同じ針および粒子溶液を使用して、同じ日に1週および5週齢のハエを注入することが有益である。もう一つの潜在的な欠点は、解剖中に、ピンが適切に処理されない場合、背部容器および/またはキューティクルが容易に損傷を受ける可能性がある点である。下振れ容器の破壊を避けるために、解剖ごとに使用されるピンの数を最小限に抑えてください。この解剖方法に対する利点は、全ての固定、洗浄および染色の工程が解剖板で行うことができる点である。キューティックルは固定されているため、ステップ間でキューティックルが失われるのを防ぎます。
既存の方法18,19,25,26,27,2828,29,記載されているプロトコルは、その利点と制限があります。この場所で個々の血球を可視化し、定量化することで、後振れ容器を解剖することが可能です。これにより、実験群間の貪食活性の微妙な変動を検出することが可能になる。他の方法は、ブリード/スクレープアッセイ19、25、26、27、または無傷の腹側キューティクル25,26,2718、19、28、29を18,19,介して血球を収集することによって蛍光標識粒子28を29視覚化する。19しかし、個々の血球は、後側キューティクルを介して視覚化されたときに評価することはできません。このプロトコルの利点は、ブリード/スクレープ法と比較すると、我々の方法は、我々は、後部血管に関連付けられているそれらの血球のみを評価することを可能にし、循環細胞または機能的に異なる可能性があり、体壁に沿ったものを考慮するということです。また、後部血管を解剖すると、トリパンブルー19、26,26のような蛍光クエンチャーによる第2ラウンドの注射を含める必要もなくなります。これは、細胞に結合または巻き込まれていない粒子は、洗浄段階で洗い流されるためです。逆に、逆に、別の方法は、逆の部分を必要としないため、実行する方が簡単な場合があります。後部容器を解剖することは学び易いが、このステップは一部の実験計画では実現不可能かもしれない複雑さのレベルを加える。
この生体内食細胞化アッセイの使用は、異なる年齢間の貪食事象を評価および定量化することであるが、このプロトコルは高度に適応可能であり、遺伝子型、性別、または組織タイプ間の食作用の異なる側面を分析するために使用することができる。ほとんどの多細胞動物にとって食細胞性が中心的に重要であるため、このプロセスが年齢とともにどのように減少するかを理解することは、高齢化のためのより良い治療治療につながる可能性があります。このアプローチは、食性細胞症に特に焦点を当てて、免疫応答の加齢に伴う変化の側面を解明するための長期的な可能性を提供します。

自然免疫系は、感染に対する物理的および化学的障壁と細胞成分からなるが、多細胞生物11,22にわたって進化的に保存される。防衛の第一線として、自然免疫系は、すべての動物1、2、32における侵入病原体との闘いに重要1な役割を3果たす。自然免疫応答の成分は、特異性および免疫学的記憶22、3、43を欠いていることに基づいて分類される広範囲の細胞タイプを含む。ヒトにおいて、これらの細胞タイプは、貪食単球およびマクロファージ、好中球、および細胞傷害性ナチュラルキラー細胞44、55を含む。宿主生存のためには機能的免疫系が不可欠であるが、免疫細胞の機能が年齢とともに低下することは明らかであるが、免疫感覚55,66と呼ばれる現象である。食細胞化のプロセスのさまざまな側面を含む免疫応答の年齢関連の変化を評価できることは、免疫老化の理解に役立つ可能性があります。ここで説明する手順は、ショウジョウバエメラノガスターの血球による食細胞事象を評価し、定量化するための効果的かつ反復可能なアプローチを提供する。
ショウジョウバエは、多くの理由で免疫応答を研究するための理想的なモデルです。一つには、組織依存的な方法で遺伝子発現を容易に操作することを可能にする広範な遺伝的ツールのセットがあります 7.これらのツールには、変異体のコレクション、RNA干渉株、GAL4/UAS株、およびショウジョウバエ遺伝参照パネルが含まれており、ゲノム配列全体がカタログ化される205の異なる近交配ラインが含まれています。ショウジョウバエの短いライフサイクルと大量の個体が産生されるため、研究者は短期間で制御された環境で複数の個体をテストすることができます。これは、遺伝子型間の感染に対する免疫応答の微妙な違いを識別する能力を大幅に向上させます, 男女間または年齢間.重要なことに、食作用を含む自然免疫応答の多くの遺伝的構成要素および機能は、ショウジョウバエと哺乳動物11,22との間で進化的に保存される。
ショウジョウバエでは、感染後の食細胞化の過程は、哺乳類マクロファージ9と同等である血漿細胞と呼ばれる貪食性血球によって行われる。ヘモサイトは、広範囲の粒子を認識し、微生物病原体9、10、11、12、1310,11,12,13を除去するために不可欠である。9これらの細胞は、自己を非自己と区別しなければならない様々な受容体を発現し、貪食過程10、11、12、13、14、15を実行するために必要なシグナル伝達事象を開始する。10,11,12,13,14,15粒子が結合すると、粒子の周りに広がるように細胞膜のアクチン細胞骨格の再編成や再モデリングによって内部化され始め、貪食カップ11、12、13、14,13,14を形成する。11,この過程の間に、別のシグナルセットは、細胞に食細胞のカップを閉じて粒子をさらに内部化するように指示し、膜結合ファゴソーム11、12、13、14、15を形成する。11,12,13,14,15その後、ファゴソームは成熟プロセスを経て、異なるタンパク質と結合し、リソソームと融合し、酸性の貪食体11、12、13、14、1512,13,14,15を形成する。11この時点で、パーティクルを効率的に分解し、11、12、13、14、1512,13,14を15除去することができます。11ショウジョウバエ研究は、古いハエ(4週齢)が若いハエ(1週齢)と比較して感染をクリアする能力が低下していることを明らかにしたが、少なくとも部分的には、貪食症16、17,17のいくつかの側面の低下に起因する可能性が高い。
ここで説明する方法は、標準的なフルオロフォアを持つ粒子とpH感受性の2つの異なる局面(粒子の初期巻き込み、ファゴリソームにおける粒子の分解)を評価するために、2つの別々の蛍光標識熱死大腸菌粒子を利用する。このアッセイでは、粒子がヘモサイトによって結合および巻き込まれるときに蛍光粒子が観察され、pH感受性粒子はファゴソームの低pH条件でのみ蛍光を発する。蛍光事象は、その後、後ろの血管に沿って局在するヘモサイトで観察することができる。我々は、細菌クリアランスに寄与することが知られているヘモサイトを見つけ、それらを一貫して単離するために解剖学的ランドマークを提供する後部血管に局在するヘモサイトに焦点を当てる。しかし、体の他の部分の血球と血リンパもクリアランスのために重要です。この細胞集団は研究していないが、我々の一般的な手順は、これらの細胞の貪食アッセイにも適用できる。私たちのアプローチの利点の1つは、個々の血球内の食細胞事象を定量化し、食作用性プロセスの微妙な変動を検出できることです。キューティクル18,19を通して蛍光事象を可視化する他の研究では、19存在するヘモサイトの数の違いを考慮しておらず、ヘモサイトの総数が17歳とともに変化すると予想されるため、我々の場合には特に重要である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:531px;" width="531">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">0.10 mm Insect pins</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">26002-10</td>
			<td style="width:159px;">Here: pins are cut in half, and the sharp end is used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">1 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:96px;">Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td style="width:159px;">Filled with mineral oil to load needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">15% Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:96px;">Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td style="width:159px;">for dissection media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">16 % Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:159px;">EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">1x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">3 mL Trasnfer Pipet</td>
			<td style="width:96px;">Falcon</td>
			<td>357524</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">3.5&#34; Glass Capillaries</td>
			<td style="width:96px;">Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td style="width:159px;">1.14mm O.D X 3.5&#34; length X 0.53&#34; I.D</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">35x10 mm Petri dishes</td>
			<td style="width:96px;">Becton Dickinson</td>
			<td>351008</td>
			<td style="width:159px;">Used as dissection plate, filled half way with Sylgard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">6x penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:159px;">for dissection media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">70% Glycerol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Analog Vortex mixer</td>
			<td style="width:96px;">VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Biological point forceps, Dumont No. 5</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td style="width:159px;">Diluted 1:1000 in 1x PBST</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Drosophila strain</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:159px;">w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">E. coli (K-12 strain) BioParticles&#8482;, Alexa Fluor&#8482; 594 conjugate</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>E23370</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Glass slides</td>
			<td style="width:96px;">Premiere</td>
			<td>D17026102</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Live cell imaging solution</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td style="width:159px;">preferred buffer for particle preparation and dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:96px;">Mpbio</td>
			<td>194836</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Nanoject II automatic nanoliter injector</td>
			<td style="width:96px;">Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials</td>
			<td style="width:96px;">Genesee</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td style="width:159px;">Size: 25 X 95 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Nutating Mixer</td>
			<td style="width:96px;">Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-043</td>
			<td style="width:159px;">Speed used: 20 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">pHrodo&#8482; Red E. coli BioParticles&#8482; Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>P35361</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Schneider&#39;s Drosophila cell culture media (1x)</td>
			<td style="width:96px;">Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td style="width:159px;">Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:96px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:159px;">2mM (or 20%) working</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Sylgard 184 Silicone elastomer</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td style="width:159px;">Prepare according to provided protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Tween 20</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td style="width:159px;">For PBS + 0.1% tween</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Vertical Pipette Puller Model 700C</td>
			<td style="width:96px;">David Kopf Instruments</td>
			<td>812368</td>
			<td style="width:159px;">Heater: 55&#8451; Solenoid: 45</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope</td>
			<td style="width:96px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:159px;">Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the age-specific phagocytic ability of adult drosophila melanogaster hemocytes using an in vivo phagocytosis assay

食道は自然免疫応答の必須機能です。このプロセスは、その主な機能は、粒子の広い範囲を認識し、微生物病原体を破壊することである貪食性血球によって行われます。生物の年齢が重なるにつれて、このプロセスは減少し始めますが、免疫感覚の根本的なメカニズムや遺伝的基礎についてはほとんど知られていません。ここでは、生体内食細胞化アッセイに基づく注射を用いて、内在性粒子の結合、巻き込み、分解などの食作用の異なる局面における年齢関連の変化を評価するために、成人ショウジョウバエにおける血球における食細胞の食細胞イベントを定量化することによって、ショウジョウバエメラノガスターの加齢関連の変化を調査する理想的なモデルとなっている。一つには、食作用を含む自然免疫応答の多くの遺伝的構成要素および機能は、ショウジョウバエと哺乳類の間で進化的に保存されている。そのため、このプロトコルを用いて得られた結果は、様々な生物における免疫機能の年齢関連変化を理解するのに広く関連している可能性が高い。また、この方法は、血球貪食能力の定量的推定値を提供し、様々な研究テーマに有用であり、加齢の研究に限定される必要はないことに留意する。

記載された注射方法を例示するために、図1Aはショウジョウバエメラノガスター上の注射部位を示し、食品染料がハエが注入されたことを視覚的に確認する方法を示す(図1B)。食品染料の添加は、詰まった針の認識にも役立ちます。注射は腹部で行うことができますが、実験全体で一貫した注射部位を保ちます。これにより、各実験の間で起こりうる変動を最小限に抑えることができます。
内在血球内の蛍光標識粒子を、後部血管に沿って可視化するために、後部血管を解剖し、腹部キューティクルを付着させた。図 2A-Fは、解剖方法の概要を示しています。
若年ハエやハエが食道食細胞症を行う年齢特異的な能力を評価するために、背部血管に沿った血球を蛍光顕微鏡で可視化する。また、心より後部の血管に沿った細胞のみがカウントされるようにするために、ヘメスやヘモレチンなどの特定の血液細胞マーカーまたは心臓特異的コラーゲンに対する抗体またはGFPタグ付き遺伝子、または、それぞれ(図3)、22、23、2422,23,24を使用することができる。蛍光標識された大腸菌粒子は長さが1mm、ヘモサイトは直径17で10mmである。DAPI陽性核を中心とする直径10mm以内に位置する蛍光事象のみがカウントされる(図4)。蛍光イベントを定量化するために、ImageJソフトウェアが使用されています(図5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig1.jpg"> 図1:注射部位と視覚的検証。(A)胸郭の側側側は引っ張られた毛細血管の針で突き刺される。(B)注射は、粒子溶液に緑色の食品染料を添加することによって視覚的に検証される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig2.jpg"> 図2:裏容器解剖。(A) 胸郭と後腹部(黒矢印)にピンが配置されている。(B-C)2つの水平切開(緑色の矢印)は、腹部の後端(B)と前端(C)で行われる。(D) 垂直切開(緑色の矢印)は、腹部の中央に、2つの水平カットを接続して下に行われます。(E)任意ピン(*)は、腹腔を開け、内部組織を露出させるために使用される。(F)内組織(作物、腸、子宮、卵巣、脂肪体)を除去し、後部血管を露出させる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig3.jpg"> 図3:pH感受性粒子を注射した5週齢の雌由来の解剖後背血管の腹側図は、ペリカルディン(A)に対する抗体で染色された。 A点線の白い線は、後側の血管の側面を囲み、矢印は前領域を指している。(B) 拡大画像 (A): 細菌を積極的に分解した血球群 (青い矢印) , 後部血管の最初の大動脈室内.(C)細胞外マトリックス(ECM)の拡大画像は、コラーゲン様タンパク質、ペリカルディン(緑色の矢印)、24位に後回しの血管を保持する。24<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig4.jpg"> 図4:pH感受性粒子、またはフルオロ粒子を注入した雌のハエから脱剖された背後血管および関連する血球。(A)背部血管および関連するヘモサイトと巻き込まれたpH感受性標識大腸菌粒子(赤)、または(E)フルオロ標識大腸菌粒子(赤)は、生後1週間のハエから分離し、60分間回復した後(B、F)拡大差込み(A)および(E)(白いボックス)をそれぞれ示す2つの事象を示す。(C) 巻き込まれたpH感受性標識大腸菌粒子(赤)または(G)フルオロ標識大腸菌粒子(赤)を伴う背部血管および関連する血球は、生後5週間のハエから分離され、60分間(C)および(G)(白いボックス)の拡大差を回復Cした後、それぞれ個体数を示す2つの事象を示す。点線の白い線は、後側の血管の側面を囲み、矢印は前領域を指している。DAPIで染色された核(青)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig5.jpg"> 図5:ImageJの細胞カウンターを用いて10mmのヘモサイト内で食細胞イベントを定量化する。(A) ImageJ で画像を開いた後、細胞カウンター通知ツールを使用して細胞ごとの貪食事象を追跡することができます。(B) このツールは、カウント対象として選択された各細胞に異なる色を割り当て、各ドットはその細胞内の蛍光イベントに対応します。alt+y を押すと、セルごとにカウントされるイベントの数を示すテーブルが表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

このプロトコルは、若年のショウジョウバエメラノガスター血球が食細胞細菌に対する能力を評価および定量するために使用される貪食のインビボアッセイを記述する。

インビボファゴサイトーシスアッセイを用いた成人ショウジョウバエのメラノガステル血球の年齢特異的食細胞能力の評価

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

当社のプロトコルは、血球の食作用を評価し、定量化するための効果的かつ反復可能なアプローチを提供します。この技術の主な利点は、個々の血球内の食作用を定量化し、個々のハエの遺伝子型間の食作用性プロセスの変動を検出できることです。この方法を初めて実行する場合は、完全な手順を実行する前に、可能な限り多くの説明を行う必要があります。注射用のガラス針を準備して開始します。1ミリメートルの注射器にミネラルオイルを充填し、ナノインジェクターを備えた30ゲージの皮下注射針を取り付けます。引っ張られた毛細血管の端に30ゲージの針を挿入し、ミネラルオイルでそれを埋めます。30ゲージの針をゆっくりと取り外し、気泡が形成されないようにします。コレットを取り外し、インデントを上にして密封したOリングを置きます。大きなOリングを金属製のプランジャーに置き、引き締めをせずにコレットを取り付け直します。金属プランジャーを油で満たされたガラス針の鈍い端に挿入し、大きなOリングに挿入してそっと押し下げます。その後、コレットをしっかりと締めます。フルオロまたはpH感受性粒子で針を充填した後、胸郭のステロプリュールプレートにハエを注入する。緑色の染料がハエに入る場合、注射は成功します。注入されたハエを新しい食品バイアルに入れ、最初と最後のハエが注入された時間を示します。すべてのハエが回復するまでバイアルを横に置き、食べ物に詰まるのを防ぎます。解剖した立体顕微鏡の下でフライ腹側を上方向に向けます。その後、胸郭に昆虫ピンを挿入し、生殖器の近くの腹部の最も後部端を通して別の昆虫ピンを挿入します。すべてのハエが固定されたら、トランスファーピペットを使用して、ハエをカバーするのに十分な解剖媒体を追加します。キューティクルはさみで頭を取り出し、腹部の後部ピンのすぐ上に水平切開を行い、次に腹部の最も前端にもう1つ切開します。腹腔を開く2つの水平切開部を接続する垂直切開を行います。鉗子を使用して内臓や組織を取り除き、裏面血管を避けるようにしてください。必要に応じて、追加のピンを使用してキューティクルのカット端を固定します。その後、キューティクルはさみで胸郭を取り除く。解剖培地を廃棄し、4%PFAの1ミリリットルに交換し、可能な限り光から解剖を保護する。20rpmで揺れながら、室温で15分間分の切片を固定します。その後、固定液を取り除き、1X PBSTの1ミリリットルを追加します。必要に応じて、解剖を抗体で染色する。顕微鏡スライドにキューティクルを取り付けた後、鉗子を使用して腹側を上に向け、後側の容器が見えるようにします。若年ハエとは、背部血管に沿った血球の蛍光画像化によって食細胞化を行う年齢特異的能力について評価した。心膜に対する抗体を使用して、後回し血管に沿った細胞のみがカウントされるようにした。蛍光標識された大腸菌粒子は長さが1マイクロメートル、ヘモサイトの直径は10マイクロメートルであるため、DAPI陽性核を中心とする直径10マイクロメートル以内の蛍光事象のみをカウントした。その後、ImageJ ソフトウェアを使用してイベントを定量化しました。この手順を試みる場合は、ハエが実際に注入されたことを視覚化し、タイミングが重要であることを覚えておくことが重要です。注射と解剖をタイムリーに完了すると、実験エラーや貪食率の変動を最小限に抑えることができます。この技術により、研究者は、細胞性免疫、血液細胞の異なる集団、または正常な免疫応答中のAMP産生と食道細胞症の区別に関する質問を含む様々な研究トピックを探求することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

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ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

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