Name: assessing the age-specific phagocytic ability of adult drosophila melanogaster hemocytes using an in vivo phagocytosis assay
Uploaded: 2020-06-11T13:30:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde R03 AG061484-02 e do UmBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.

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	<li>Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+DNA/RNA+methyltransferase+contributes+to+robust+host+defense+in+ageing+animals+by+regulating+sphingolipid+metabolism.">Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+and+aging:+the+enemy+within.">Immunity and aging: the enemy within.</a> Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).</li><li>Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. 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Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo descrito aqui é uma maneira confiável de quantificar diferentes aspectos da faagocytose, sob condições experimentais controladas. Notamos que só testamos este procedimento com partículas bacterianas gram negativas e os resultados podem diferir se partículas bacterianas gram positivas forem usadas. De fato, seria interessante comparar as respostas fagocíticas com bactérias gram negativas e gram positivas em diferentes condições experimentais. O uso de um nano-injetor permite um controle preciso sobre os volumes de injeção, garantindo que cada mosca seja injetada com o mesmo volume de partículas. Uma limitação ao protocolo vem de inconsistências nas preparações de partículas. As partículas se agregarão uma vez congeladas, de modo que pequenas variações nos volumes de diluição, ou falta de vórtice, podem afetar a concentração de partículas entre experimentos. Para minimizar possíveis variações nas concentrações de partículas entre as idades, é benéfico injetar moscas de 1 e 5 semanas no mesmo dia, usando a mesma solução de agulha e partículas. Outra desvantagem potencial é que durante as dissecções, o vaso dorsal e/ou cutícula podem ser facilmente danificados se os pinos não forem manuseados corretamente. Para evitar interromper o vaso dorsal, minimize o número de pinos utilizados por dissecção. A vantagem deste método de dissecção é que todas as etapas de fixação, lavagem e coloração podem ser realizadas na placa de dissecção. Como as cutículas estão presas, isso evita que as cutículas se percam entre os passos.
Em comparação com os métodos existentes18,,19,,25,,26,,27,,28,,29, o protocolo descrito tem suas vantagens e limitações. Ao dissecar o vaso dorsal, somos capazes de visualizar e quantificar hemócitos individuais neste local. Isso permite detectar variações sutis na atividade fagocítica entre grupos experimentais. Outros métodos visualizam partículas fluorescentes rotuladas através da coleta de hemócitos usando um ensaio bleed/scrape19,25,26,27, ou através de uma cutícula ventral intacta18,19,28,29; no entanto, hemócitos individuais não podem ser avaliados quando visualizados através da cutícula dorsal. A vantagem deste protocolo, quando comparado ao método Bleed/Scrape é que nosso método nos permite avaliar apenas os hemócitos associados ao vaso dorsal, e explica as células circulantes ou aquelas ao longo da parede do corpo, que podem ser funcionalmente diferentes. Dissecar o vaso dorsal também remove a necessidade de incluir uma segunda rodada de injeções com uma fluorescência quencher, como trypan azul19,26. Isso ocorre porque todas as partículas não vinculadas ou engolidas por uma célula serão lavadas durante as etapas de lavagem. Por outro lado, métodos alternativos podem ser mais fáceis de executar porque não requerem dissecções. Embora dissecar o vaso dorsal seja fácil de aprender, esta etapa adiciona um nível de complexidade que pode não ser viável em alguns projetos experimentais.
Embora o uso descrito deste ensaio de fagocitose in vivo seja para avaliar e quantificar eventos fagocíticos entre diferentes idades, este protocolo é altamente adaptável e pode ser usado para analisar diferentes aspectos da fagocitose entre genótipo, sexo ou tipo de tecido. Com a fagocitose sendo de importância central para a maioria dos animais multicelulares, entender como esse processo diminui com a idade pode levar a melhores tratamentos terapêuticos para a população envelhecida. Essa abordagem oferece potencial de longo prazo para elucidar aspectos das mudanças relacionadas à idade na resposta imune, com foco especial na fagocitose.

O sistema imunológico inato, que consiste em barreiras físicas e químicas à infecção, bem como componentes celulares, é conservado evolutivo entre organismos multicelulares1,,2. Como primeira linha de defesa, o sistema imunológico inato desempenha um papel crítico no combate a patógenos invasores em todos os animais1,,2,3. Os componentes da resposta imune inata incluem uma ampla gama de tipos de células que são classificadas com base na falta de especificidade e memória imunológica2,,3,,4. Em humanos, esses tipos de células incluem monócitos fácticos e macrófagos, neutrófilos e células assassinas naturais citotóxicas4,,5. Embora ter um sistema imunológico funcional seja imperativo para a sobrevivência do hospedeiro, é claro que a função das células imunes diminui com a idade, fenômeno conhecido como imunosenescência5,,6. Ser capaz de avaliar mudanças relacionadas à idade na resposta imune, incluindo diferentes aspectos do processo de fagocitose, poderia ajudar na nossa compreensão da imunosenescência. O procedimento que descrevemos aqui fornece uma abordagem eficaz e repetível para avaliar e quantificar eventos faócticos por hemócitos em Drosophila melanogaster.
A drosophila é um modelo ideal para estudar a resposta imune por muitas razões. Por um tempo, há um extenso conjunto de ferramentas genéticas disponíveis que tornam possível manipular facilmente a expressão genética de forma dependente de tecidos7. Essas ferramentas incluem uma coleção de mutantes, estoques de interferência de RNA, estoques GAL4/UAS e o Painel de Referência Genética Drosophila que contém 205 linhas de raça diferentes para as quais todas as sequências de genoma são catalogadas8. O curto ciclo de vida da Drosophila e o grande número de indivíduos produzidos permitem aos pesquisadores testar múltiplos indivíduos em um ambiente controlado, em um curto período de tempo. Isso melhora muito a capacidade de identificar diferenças sutis nas respostas imunes à infecção entre genótipos, entre sexos ou entre idades. É importante ressaltar que muitos componentes genéticos e funções da resposta imune inata, incluindo a fagocitose, são evolutivamente conservados entre drosophila e mamíferos1,2.
Em Drosophila, o processo de fagocitose que se segue à infecção é realizado por hemócitos fagocíticos chamados plasmatócitos, que equivalem aos macrófagosmamíferos 9. Os hemócitos são essenciais para reconhecer uma ampla gama de partículas e limpar patógenos microbianos9,,10,,11,12,13. Essas células expressam uma variedade de receptores que devem diferenciar-se do não-auto, e iniciar eventos de sinalização necessários para realizar o processo fagocítico10,,11,12,,13,,14,15. Uma vez que uma partícula é amarrada, ela começa a ser internalizada pela reorganização do citoesqueleto de actina e remodelação da membrana plasmática para expandir-se em torno da partícula, formando um copo fagocítico11,,12,,13,14. Durante esse processo, outro conjunto de sinais diz à célula para internalizar ainda mais a partícula, fechando o copo fagocítico, formando um fágora ligado à membrana11,,12,13,,14,15. O fágora passa então por um processo de maturação, associando-se com diferentes proteínas e fundindo-se com lisosomos, formando um fagolico ácido11,12,13,14,15. Neste ponto, as partículas podem ser degradadas e eliminadas de forma eficiente11,12,13,14,15. Estudos de drosophila revelaram que moscas mais velhas (4 semanas de idade) têm uma capacidade reduzida de limpar uma infecção em comparação com moscas mais jovens (1 semana de idade), provavelmente devido, pelo menos em parte, a um declínio em alguns aspectos da faagocitose16,17.
O método descrito aqui utiliza duas partículas E. coli com rótulos fluorescentes separados, uma com fluorohore padrão e outra sensível ao pH, para avaliar dois aspectos diferentes da fagocitose: o engolfamento inicial das partículas e a degradação das partículas no fagoliossomo. Neste ensaio, fluorescência fluoro-partícula é observável quando as partículas são amarradas e engolidas por hemócitos, enquanto partículas sensíveis ao pH fluorescem apenas nas baixas condições de pH do fagosome. Eventos fluorescentes podem então ser observados em hemócitos que se localizam ao longo do vaso dorsal. Focamos em hemócitos localizados no vaso dorsal, que fornecem um marco anatômico para localizar hemócitos que são conhecidos por contribuir para o despejo bacteriano, e para isolá-los consistentemente. No entanto, hemócitos em outras partes do corpo e hemoglifos também são importantes para a liberação. Embora não tenhamos estudado essa população celular, nosso procedimento geral pode ser aplicável para ensaios fagocíticos dessas células também. Uma vantagem de nossa abordagem é que podemos quantificar eventos fagocíticos dentro de hemócitos individuais, permitindo detectar variações sutis nos processos fagocíticos. Outros estudos que visualizam eventos fluorescentes através da cutícula18,19 não explicam as diferenças no número de hemócitos presentes, o que é especialmente importante considerar no nosso caso como a contagem total de hemócitos deve mudar com a idadede 17 anos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:531px;" width="531">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">0.10 mm Insect pins</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">26002-10</td>
			<td style="width:159px;">Here: pins are cut in half, and the sharp end is used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">1 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:96px;">Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td style="width:159px;">Filled with mineral oil to load needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">15% Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:96px;">Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td style="width:159px;">for dissection media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">16 % Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:159px;">EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">1x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">3 mL Trasnfer Pipet</td>
			<td style="width:96px;">Falcon</td>
			<td>357524</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">3.5&#34; Glass Capillaries</td>
			<td style="width:96px;">Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td style="width:159px;">1.14mm O.D X 3.5&#34; length X 0.53&#34; I.D</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">35x10 mm Petri dishes</td>
			<td style="width:96px;">Becton Dickinson</td>
			<td>351008</td>
			<td style="width:159px;">Used as dissection plate, filled half way with Sylgard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">6x penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:159px;">for dissection media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">70% Glycerol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Analog Vortex mixer</td>
			<td style="width:96px;">VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Biological point forceps, Dumont No. 5</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td style="width:159px;">Diluted 1:1000 in 1x PBST</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Drosophila strain</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:159px;">w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">E. coli (K-12 strain) BioParticles&#8482;, Alexa Fluor&#8482; 594 conjugate</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>E23370</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Glass slides</td>
			<td style="width:96px;">Premiere</td>
			<td>D17026102</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Live cell imaging solution</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td style="width:159px;">preferred buffer for particle preparation and dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:96px;">Mpbio</td>
			<td>194836</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Nanoject II automatic nanoliter injector</td>
			<td style="width:96px;">Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials</td>
			<td style="width:96px;">Genesee</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td style="width:159px;">Size: 25 X 95 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Nutating Mixer</td>
			<td style="width:96px;">Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-043</td>
			<td style="width:159px;">Speed used: 20 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">pHrodo&#8482; Red E. coli BioParticles&#8482; Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>P35361</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Schneider&#39;s Drosophila cell culture media (1x)</td>
			<td style="width:96px;">Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td style="width:159px;">Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:96px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:159px;">2mM (or 20%) working</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Sylgard 184 Silicone elastomer</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td style="width:159px;">Prepare according to provided protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Tween 20</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td style="width:159px;">For PBS + 0.1% tween</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Vertical Pipette Puller Model 700C</td>
			<td style="width:96px;">David Kopf Instruments</td>
			<td>812368</td>
			<td style="width:159px;">Heater: 55&#8451; Solenoid: 45</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope</td>
			<td style="width:96px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:159px;">Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the age-specific phagocytic ability of adult drosophila melanogaster hemocytes using an in vivo phagocytosis assay

A fagocitose é uma função essencial da resposta imune inata. Este processo é realizado por hemócitos fagocíticos cuja função primária é reconhecer uma ampla gama de partículas e destruir patógenos microbianos. À medida que os organismos envelhecem, esse processo começa a diminuir, mas pouco se sabe sobre os mecanismos subjacentes ou a base genética da imunosenescência. Aqui, uma injeção baseada em ensaio de fagocitose in vivo é utilizada para avaliar mudanças relacionadas à idade em diferentes aspectos da fagocitose, como ligação, engolamento e degradação de partículas internalizadas, quantificando eventos fagocícitos em hemócitos em Drosophila adulto. Drosophila melanogaster tornou-se um modelo ideal para investigar mudanças relacionadas à idade na função imunológica inata por muitas razões. Por um só, muitos componentes genéticos e funções da resposta imune inata, incluindo a fagocitose, são evolutivamente conservados entre drosophila e mamíferos. Por causa disso, os resultados obtidos com o uso deste protocolo provavelmente serão amplamente relevantes para a compreensão das mudanças relacionadas à idade na função imunológica em uma variedade de organismos. Além disso, observamos que este método fornece estimativas quantitativas da capacidade fagocítica hemocito, que poderia ser útil para uma variedade de tópicos de pesquisa, e não precisa se limitar a estudos de envelhecimento.

Para ilustrar os métodos de injeção descritos, a Figura 1A mostra o local de injeção em Drosophila melanogaster, bem como como o corante alimentar permite uma confirmação visual de que a mosca foi injetada(Figura 1B). A adição de corante alimentar também auxilia no reconhecimento de uma agulha entupida. As injeções podem ser realizadas no abdômen, mas mantêm o local de injeção consistente entre os experimentos. Isso ajudará a minimizar possíveis variações entre cada experimento.
Para visualizar as partículas fluorescentes rotuladas dentro de hemócitos residentes ao longo do vaso dorsal, dissecamos o vaso dorsal e anexamos cutícula abdominal. A Figura 2A-F descreve os métodos de dissecção.
Para avaliar a capacidade específica da idade das moscas jovens e idosas para realizar fagocitose, os hemócitos ao longo do vaso dorsal são visualizados usando um microscópio fluorescente. Para garantir que apenas as células ao longo do vaso dorsal sejam contadas, podem ser utilizados anticorpos ou genes marcados por GFP para certos marcadores de células sanguíneas ou colágeno específico do coração, como Hemese e Hemolectina, ou Pericardina(Figura 3),respectivamente, 22,,23,,24. Partículas E. coli fluorescentes são de 1 mm de comprimento, enquanto os hemócitos têm 10 mm de diâmetro17. Apenas são contabilizados aqueles eventos fluorescentes localizados dentro de um diâmetro de 10 mm centrados em um núcleo DAPI positivo(Figura 4). Para quantificar eventos fluorescentes, é utilizado o software ImageJ(Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig1.jpg"> Figura 1: Local de injeção e verificação visual. (A) O lado lateral do tórax é perfurado com uma agulha capilar puxada. (B) As injeções são verificadas visualmente adicionando corante de alimentos verdes à solução de partículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig2.jpg"> Figura 2: Dissecção do vaso dorsal. (A) Os pinos são colocados no tórax e abdômen posterior (setas pretas). (B-C) Duas incisões horizontais (setas verdes) são feitas na extremidade posterior do abdômen(B)e na extremidade anterior(C). (D) Uma incisão vertical (arqueiro verde) é feita no meio do abdômen, conectando os dois cortes horizontais. (E) Os pinos opcionais (*) são usados para abrir a cavidade abdominal, expondo o tecido interno. (F) O tecido interno (cultura, intestino, útero, ovários, corpos gordos) é removido, expondo o vaso dorsal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig3.jpg"> Figura 3: Visão ventral de um vaso dorsal dissecado de uma fêmea de 5 semanas injetada com partículas sensíveis ao pH, manchadas com anticorpos direcionados contra Pericardin (A). A linha branca pontilhada descreve o lado lateral do vaso dorsal, com seta apontando para a região anterior. (B) Imagem ampliada de (A): aglomerados de hemócitos (seta azul) que estavam ativamente degradando bactérias, dentro da primeira câmara aórtica do vaso dorsal. (C) Imagem ampliada de (A) delineando a proteína de colágeno extracelular (ECM), pericardina (arqueiro verde), que mantém o vaso dorsal no lugar24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig4.jpg"> Figura 4: Vaso dorsal dissecado e hemócitos associados de uma mosca fêmea injetado com partículas sensíveis ao pH, ou fluoro-partículas. (A) O vaso dorsal e os hemócitos associados com partículas E. coli com rótulo de pH (vermelho) ou (E) fluoro-rotulados partículas E. coli (vermelho), isolados de uma mosca de uma semana de idade, após a recuperação por 60 minutos.(B,F) Inset ampliado de (A) e (E) (caixa branca), respectivamente, mostrando dois hemocitos individuais com eventos contados. (C) O vaso dorsal e hemócitos associados com partículas E. coli com rótulo de pH (vermelho), ou ( G) fluoro-rotulado partículas E. coli (vermelho), isolados de uma mosca de 5 semanas de idade, após a recuperação por 60 minutos. (D,H) Inset ampliado de (C) e (G) (caixa branca), respectivamente, mostrando dois hemocitos individuais com eventos contados. A linha branca pontilhada descreve o lado lateral do vaso dorsal, com seta apontando para a região anterior. Núcleos manchados com DAPI (azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig5.jpg"> Figura 5: Quantificando eventos fagocícitos dentro de um hemócito de 10 mm usando o contador celular em ImageJ. (A) Após a abertura de imagens no ImageJ, a ferramenta Cell Counter Notice pode ser usada para acompanhar eventos fagocíticos por célula. (B) Esta ferramenta atribuirá uma cor diferente a cada célula selecionada a ser contada, com cada ponto correspondente a um evento fluorescente dentro dessa célula. Pressionar 'alt+y' exibirá uma tabela mostrando o número de eventos contados por célula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Este protocolo descreve um ensaio in vivo da fagocitose utilizado para avaliar e quantificar a capacidade dos hemócitos de melanogaster de Drosophila jovens e envelhecidos para bactérias fagocitose..

Avaliando a Habilidade Fagocítica Específica da Idade dos Hemócitos de Melanogaster Drosophila Adulto usando um Ensaio de Faagocitose In Vivo

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Nosso protocolo fornece uma abordagem eficaz e repetível para avaliar e quantificar eventos fagocíticos em hemócitos. A principal vantagem dessa técnica é que podemos quantificar eventos fagocíticos dentro de hemócitos individuais que nos permitem detectar variações nos processos fagocíticos entre genótipos em moscas individuais. Realizar dissecções pode ser um desafio, por isso, ao realizar essa técnica pela primeira vez, pratique dissecções o máximo possível antes de realizar o procedimento completo.Comece preparando agulhas de vidro para injeção. Encha uma seringa de um milímetro com óleo mineral e conecte a agulha hipodérmica de calibre 30 fornecida com o nano-injetor. Insira a agulha de calibre 30 na extremidade cega de uma agulha capilar puxada e encha-a com óleo mineral.Remova lentamente a agulha de calibre 30 certificando-se de que não se formem bolhas de ar. Remova o collet e coloque o o-anel O selado com o recuo voltado para cima. Coloque o anel O maior sobre o êmbolo metálico e recoloque a collet sem apertar.Insira o êmbolo metálico na extremidade contundente da agulha de vidro cheia de óleo e empurre-o suavemente para baixo, inserindo-o no anel O maior. Em seguida, aperte a collet até ficar em segurança. Depois de encher a agulha com partículas fluoro ou pH, injete as moscas na placa esternopleural do tórax.A injeção é bem sucedida se o corante verde está indo para a mosca. Coloque as moscas injetadas em um novo frasco de comida observando a hora em que a primeira e última mosca foram injetadas. Coloque o frasco de lado até que todas as moscas se recuperem para evitar que grudem na comida.Oriente o lado ventral da mosca sob um estereótipo dissetante. Em seguida, insira um pino de inseto no tórax e outro através da extremidade mais posterior do abdômen perto da genitália. Uma vez que todas as moscas tenham sido presas, use um pipet de transferência para adicionar mídia de dissecção suficiente para cobrir as moscas.Remova a cabeça com uma tesoura de cutícula e faça uma incisão horizontal diretamente acima do pino posterior no abdômen, depois outra na extremidade mais anterior do abdômen. Faça uma incisão vertical conectando as duas incisões horizontais que abrirão a cavidade abdominal. Use fórceps para remover os órgãos internos e tecido, certificando-se de evitar o vaso dorsal.Se necessário, use pinos adicionais para fixar as extremidades de corte da cutícula. Em seguida, remova o tórax com a tesoura da cutícula. Descarte a mídia de dissecção e substitua-a por um mililitro de 4%, protegendo as dissecções da luz o máximo possível.Fixar as dissecções por 15 minutos em temperatura ambiente enquanto balança a 20 rpm. Em seguida, remova o fixador e adicione um mililitro de 1X PBST. Se desejar, manche as dissecções com anticorpos.Depois de montar as cutículas em um slide de microscópio, use fórceps para orientá-los do lado ventral para cima, e certifique-se de que o vaso dorsal é visível. Moscas jovens e idosas foram avaliadas pela capacidade específica da idade de realizar fagocitose por imagem fluorescente de hemócitos ao longo do vaso dorsal. Um anticorpo contra pericártina foi usado para garantir que apenas células ao longo do vaso dorsal fossem contadas.Uma vez que partículas E.coli fluorescentes são um micrômetro de comprimento e hemócitos têm 10 micrômetros de diâmetro, apenas eventos fluorescentes dentro de um diâmetro de 10 micrômetros centrados em um núcleo DAPI positivo foram contados. O software ImageJ foi então usado para quantificar os eventos. Ao tentar este procedimento, é importante visualizar que a mosca foi realmente injetada e lembrar que o tempo é crítico.Completar injeções e dissecções em tempo hábil ajudará a minimizar erros experimentais e possíveis variações na taxa fagocítica. Essa técnica permitirá que os pesquisadores explorem uma variedade de tópicos de pesquisa, incluindo questões sobre imunidade celular, diferentes populações de células sanguíneas ou distinção da fagocitose da produção de AMP durante uma resposta imune bem sucedida.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Dissecção do CNS Larval em Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biologia

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

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Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

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Dissecção da Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster</em

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Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

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Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

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Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

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Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

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A utilização do Ramsay ensaio para medir secreção de fluidos e Ion Flux Preços no<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Tubule Malpighian

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Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

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Determinação de área óptica transversal muscular dos músculos de voo indirecto adulto de Drosophila Melanogaster

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...