Name: assessing the age-specific phagocytic ability of adult drosophila melanogaster hemocytes using an in vivo phagocytosis assay
Uploaded: 2020-06-11T13:30:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами от Национальных институтов здравоохранения R03 AG061484-02 и UMBC колледж естественных и математических наук Бектон Дикинсон факультет исследовательский фонд.

<ol>
	<li>Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+DNA/RNA+methyltransferase+contributes+to+robust+host+defense+in+ageing+animals+by+regulating+sphingolipid+metabolism.">Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+and+aging:+the+enemy+within.">Immunity and aging: the enemy within.</a> Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).</li><li>Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+and+aging.">Innate immunity and aging.</a> Experimental Gerontology. 43 (8), 718-728 (2008).</li><li>Panda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+innate+immunosenescence:+causes+and+consequences+for+immunity+in+old+age.">Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age.</a> Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).</li><li>Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosenescence:+emerging+challenges+for+an+ageing+population.">Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population.</a> Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).</li><li>Min, K. -. J., Tatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+molecular+mechanism+of+immunosenescence+in+Drosophila.">Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472 (2018).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+on+the+fly:+a+primer+on+the+Drosophila+model+system.">Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li><li>Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+genetic+model+for+hematopoiesis.">Drosophila as a genetic model for hematopoiesis.</a> Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).</li><li>R&#228;met, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli.">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li><li>Garschall, K., Flatt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+between+immunity+and+aging+in+Drosophila.">The interplay between immunity and aging in Drosophila.</a> F1000Research. 7, (2018).</li><li>Brennan, C. A., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+The+genetics+of+innate+immune+recognition+and+response.">Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response.</a> Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).</li><li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+a+fundamental+process+in+immunity.">Phagocytosis: a fundamental process in immunity.</a> BioMed Research International. 9042851, (2017).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).</li><li>Stuart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+analysis+of+the+Drosophila+phagosome.">A systems biology analysis of the Drosophila phagosome.</a> Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).</li><li>Mackenzie, D. K., Bussi&#232;re, L. F., Tinsley, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+of+the+cellular+immune+response+in+Drosophila+melanogaster.">Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).</li><li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes.">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li><li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila.">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).</li><li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus.">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li><li>. Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html">https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html</a> (2019)</li><li>Fellous, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+food+quality+affects+adult+(but+not+larval)+immune+gene+expression+independent+of+effects+on+general+condition.">Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition.</a> Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).</li><li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemese,+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein,+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila.">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li><li>Goto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+haemocyte-specific+protein,+hemolectin,+similar+to+human+von+Willebrand+factor.">A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor.</a> Biochemical Journal. 359, 99-108 (2001).</li><li>Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardin,+a+Drosophila+collagen,+facilitates+accumulation+of+hemocytes+at+the+heart.">Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart.</a> Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).</li><li>Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+proliferation+of+adult+hemocytes+in+Drosophila+by+BrdU+incorporation+and+PH3+expression+in+response+to+bacterial+infection.">Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection.</a> Wellcome Open Research. 3, (2018).</li><li>Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumu+is+required+for+circulating+hemocyte+differentiation+and+phagocytosis+in+Drosophila.">Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95 (2018).</li><li>Petraki, S., Alexander, B., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+blood+cell+populations+of+the+Drosophila+melanogaster+larva.">Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Gyoergy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+allowing+independent+visualization+and+genetic+manipulation+of+Drosophila+melanogaster+macrophages+and+surrounding+Tissues.">Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).</li><li>Bosch, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+of+adult+Drosophila+do+not+expand,+but+control+survival+after+bacterial+infection+by+induction+of+Drosocin+around+their+reservoir+at+the+respiratory+epithelia.">Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia.</a> BioRxiv. 578864, (2019).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Протокол, описанный здесь, является надежным способом количественной оценки различных аспектов фагоцитоза, в контролируемых экспериментальных условиях. Мы отмечаем, что мы только протестировали эту процедуру с грамположительными бактериальными частицами и результаты могут отличаться, если грамм положительные бактериальные частицы используются. Действительно, было бы интересно сравнить фагоцитные реакции как на грамоты отрицательных и грамм положительных бактерий в различных экспериментальных условиях. Использование нано-инжектора позволяет точно контролировать объемы инъекций, обеспечивая впрыскивание каждой мухи с одинаковым объемом частиц. Одно ограничение протокола связано с несоответствиями в подготовке частиц. Частицы будут агрегироваться после замораживания, поэтому небольшие колебания объемов разбавления или отсутствие вихря могут повлиять на концентрацию частиц между экспериментами. Чтобы свести к минимуму возможные колебания концентрации частиц в разных возрастных группах, полезно вводить мух 1- и 5-недельного возраста в один и тот же день, используя тот же иглы и раствор частиц. Другим потенциальным недостатком является то, что во время вскрытия, спинной сосуд и / или кутикулы могут быть легко повреждены, если булавки не обрабатываются должным образом. Чтобы избежать нарушения спинной сосуд, свести к минимуму количество булавок, используемых в вскрытии. Преимущество этого метода вскрытия заключается в том, что все фиксации, стирки и окрашивания шаги могут быть выполнены в вскрытии пластины. Поскольку кутикулы закреплены вниз, это предотвращает кутикулы от потери между шагами.
По сравнению с существующими методами18,,19,,25,,26,,27,,28,,29,описанный протокол имеет свои преимущества и ограничения. Рассекав спинной сосуд, мы можем визуализировать и количественно определить индивидуальные гемоциты в этом месте. Это позволяет обнаруживать тонкие вариации в фагоцитной активности между экспериментальными группами. Другие методы визуализировать флуоресцентно помечены частиц, собирая гемоциты с помощью анализа Кровотечения / Scrape19,25,26,,27, или через нетронутыми брюшной кутикулы18,19,28,29; однако, отдельные гемоциты не могут быть оценены при визуализации через спинной кутикулы. Преимущество этого протокола, по сравнению с методом Bleed/Scrape, заключается в том, что наш метод позволяет нам оценить только те гемоциты, связанные с спинным сосудом, и учитывает циркулирующие клетки или те, которые расположены вдоль стенки тела, которые могут быть функционально разными. Рассекречивание спинного сосуда также устраняет необходимость включения второго раунда инъекций с флуоресценцией quencher, как Трипан синий19,26. Это потому, что любые частицы, не связанные или поглощенные клеткой, будут смыты во время шагов мытья. И наоборот, альтернативные методы могут быть проще в выполнении, поскольку они не требуют вскрытия. Хотя вскрытие спинного сосуда легко узнать, этот шаг добавляет уровень сложности, которые не могут быть осуществимы в некоторых экспериментальных конструкций.
Хотя описанное использование этого in vivo фагоцитоза анализ для оценки и количественной фагоцитных событий между различными возрастами, этот протокол является весьма адаптируемым и может быть использован для анализа различных аспектов фагоцитоза между генотипом, полом или типом ткани. С фагоцитозом, имеющих центральное значение для большинства многоклеточных животных, понимание того, как этот процесс снижается с возрастом может привести к улучшению терапевтического лечения для стареющего населения. Этот подход предлагает долгосрочный потенциал для выяснения аспектов возрастных изменений иммунного ответа, с особым акцентом на фагоцитоз.

Врожденная иммунная система, которая состоит из физических и химических барьеров для инфекции, а также клеточных компонентов, эволюционно сохраняется через многоклеточные организмы1,2. Как первая линия обороны, врожденная иммунная система играет важную роль в борьбе с вторжением патогенов у всех животных1,,2,3. Компоненты врожденного иммунного ответа включают широкий спектр типов клеток, которые классифицируются на том основании, что им не хватает специфичности и иммунологической памяти2,,3,,4. У людей эти типы клеток включают фагоцитные моноциты и макрофаги, нейтрофилы и цитотоксические естественные клетки-убийцы4,,5. Хотя наличие функциональной иммунной системы является необходимым для выживания хозяина, ясно, что функция иммунных клеток снижается с возрастом, явление, известное как иммуносенессация5,6. Возможность оценить возрастные изменения иммунного ответа, включая различные аспекты процесса фагоцитоза, может помочь в нашем понимании иммуносенекции. Процедура, которую мы описываем здесь, обеспечивает эффективный и повторяемый подход к оценке и количественной оценке фагоцитных событий гемоцитами в drosophila melanogaster.
Дрозофила является идеальной моделью для изучения иммунного ответа по многим причинам. С одной, есть обширный набор генетических инструментов, которые позволяют легко манипулировать экспрессией генов в ткани зависит образом7. Эти инструменты включают в себя коллекцию мутантов, запасы РНК-интерференции, запасы GAL4/UAS и генетическую справочную панель Drosophila, которая содержит 205 различных инбредных линий, для которых каталогизуются все последовательности генома8. Короткий жизненный цикл Drosophila и большое количество людей, произведенных позволяют исследователям проверить несколько человек в контролируемой среде, в течение короткого периода времени. Это значительно повышает способность выявлять тонкие различия в иммунных реакциях на инфекции среди генотипов, между полами или в разных возрастных группах. Важно отметить, что многие генетические компоненты и функции врожденного иммунного ответа, в том числе фагоцитоз, эволюционно сохраняются между дрозофилой и млекопитающими1,2.
В Drosophila, процесс фагоцитоза, который следует инфекции осуществляется фагоцитатических гемоцитов называется плазматоцитов, которые эквивалентны млекопитающих макрофагов9. Гемоциты необходимы для распознавания широкого спектра частиц и очистки микробных патогенов9,,10,,11,,12,,13. Эти клетки выражают различные рецепторы, которые должны дифференцировать себя от не-я, и инициировать сигнальные события, необходимые для выполнения фагоцитного процесса10,11,,12,13,14,15. Как только частица связана, она начинает быть интернализирована путем реорганизации актин цитоскелета и реконструкции плазменной мембраны, чтобы расширить вокруг частицы, образуя фагоцитный стакан11,12,13,14. Во время этого процесса, другой набор сигналов говорит клетке, чтобы усвоить частицу дальше, закрыв фагоцитарная чашка, образуя мембрану связаны фагосом11,12,13,14,15. Фагосом затем проходит процесс созревания, связывая с различными белками и сплавляясь с лизосомами, образуя кислый фаголисом11,12,13,14,15. На данный момент частицы могут эффективно деградировать иустранять 11,,12,,13,,14,,15. Исследования дрозофилы показали, что старые мухи (4 недели) имеют пониженную способность к очистке инфекции по сравнению с молодыми мухами (1-недельный), вероятно, из-за, по крайней мере частично, к снижению в некоторых аспектах фагоцитоза16,17.
Метод, описанный здесь, использует два отдельных флуоресцентно-маркированных тепловой убитой кишечной палочки частиц, один подшипник стандартный фторфор и один, который является рН чувствительны, для оценки двух различных аспектов фагоцитоза: первоначальное поглощение частиц, и деградация частиц в фаголизоме. В этом анализе флуоресценция фтор-частицы наблюдается, когда частицы связаны и поглощены гемоцитами, в то время как рН чувствительных частиц флуоресцирует только в условиях низкого рН фагосомы. Флуоресцентные события могут наблюдаться в гемоцитах, которые локализуются вдоль спинного сосуда. Мы фокусируемся на гемоцитах, локализованных в спинном сосуде, которые обеспечивают анатомическую ориентир для поиска гемоцитов, которые, как известно, способствуют бактериальному зазору, и последовательно изолировать их. Однако, гемоциты в других частях тела и гемолимфом также важны для зазора. Хотя мы не изучали эту популяцию клеток, наша общая процедура может быть применима и для фагоцитных анализов этих клеток. Одним из преимуществ нашего подхода является то, что мы можем количественно фагоцитных событий в отдельных гемоцитов, что позволяет нам обнаружить тонкие изменения в фагоцитных процессов. Другие исследования, которые визуализировать флуоресцентные события через кутикулу18,19 не учитывают различия в количестве гемоцитов настоящее время, что особенно важно рассмотреть в нашем случае, как общее количество гемоцитов, как ожидается, изменится свозрастом 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:531px;" width="531">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">0.10 mm Insect pins</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">26002-10</td>
			<td style="width:159px;">Here: pins are cut in half, and the sharp end is used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">1 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:96px;">Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td style="width:159px;">Filled with mineral oil to load needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">15% Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:96px;">Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td style="width:159px;">for dissection media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">16 % Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:159px;">EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">1x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">3 mL Trasnfer Pipet</td>
			<td style="width:96px;">Falcon</td>
			<td>357524</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">3.5&#34; Glass Capillaries</td>
			<td style="width:96px;">Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td style="width:159px;">1.14mm O.D X 3.5&#34; length X 0.53&#34; I.D</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">35x10 mm Petri dishes</td>
			<td style="width:96px;">Becton Dickinson</td>
			<td>351008</td>
			<td style="width:159px;">Used as dissection plate, filled half way with Sylgard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">6x penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:159px;">for dissection media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">70% Glycerol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Analog Vortex mixer</td>
			<td style="width:96px;">VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Biological point forceps, Dumont No. 5</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td style="width:159px;">Diluted 1:1000 in 1x PBST</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Drosophila strain</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:159px;">w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">E. coli (K-12 strain) BioParticles&#8482;, Alexa Fluor&#8482; 594 conjugate</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>E23370</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Glass slides</td>
			<td style="width:96px;">Premiere</td>
			<td>D17026102</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Live cell imaging solution</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td style="width:159px;">preferred buffer for particle preparation and dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:96px;">Mpbio</td>
			<td>194836</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Nanoject II automatic nanoliter injector</td>
			<td style="width:96px;">Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials</td>
			<td style="width:96px;">Genesee</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td style="width:159px;">Size: 25 X 95 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Nutating Mixer</td>
			<td style="width:96px;">Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-043</td>
			<td style="width:159px;">Speed used: 20 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">pHrodo&#8482; Red E. coli BioParticles&#8482; Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>P35361</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Schneider&#39;s Drosophila cell culture media (1x)</td>
			<td style="width:96px;">Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td style="width:159px;">Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:96px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:159px;">2mM (or 20%) working</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Sylgard 184 Silicone elastomer</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td style="width:159px;">Prepare according to provided protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Tween 20</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td style="width:159px;">For PBS + 0.1% tween</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Vertical Pipette Puller Model 700C</td>
			<td style="width:96px;">David Kopf Instruments</td>
			<td>812368</td>
			<td style="width:159px;">Heater: 55&#8451; Solenoid: 45</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope</td>
			<td style="width:96px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:159px;">Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the age-specific phagocytic ability of adult drosophila melanogaster hemocytes using an in vivo phagocytosis assay

Фагоцитоз является важной функцией врожденного иммунного ответа. Этот процесс осуществляется фагоцитными гемоцитами, основной функцией которых является распознавание широкого спектра частиц и уничтожение микробных патогенов. С возрастом организмов этот процесс начинает снижаться, однако мало что известно о базовых механизмах или генетической основе иммуносенелесции. Здесь, инъекция, основанная в vivo фагоцитоз анализ используется для оценки возрастных изменений в различных аспектах фагоцитоза, таких как связывание, поглощение, и деградация интернализированных частиц, путем количественной оценки фагоцитных событий в гемоцитах у взрослых Drosophila. Drosophila melanogaster стал идеальной моделью для изучения возрастных изменений в врожденной иммунной функции по многим причинам. С одной стороны, многие генетические компоненты и функции врожденного иммунного ответа, включая фагоцитоз, эволюционно сохраняются между дрозофилой и млекопитающими. Из-за этого результаты, полученные от использования этого протокола, вероятно, будут широко актуальны для понимания возрастных изменений в иммунной функции в различных организмах. Кроме того, мы отмечаем, что этот метод обеспечивает количественные оценки фагоцитной способности гемоцитов, которые могут быть полезны для различных тем исследования, и не должны ограничиваться исследованиями старения.

Чтобы проиллюстрировать описанные методы инъекции, Рисунок 1A показывает место инъекции на Drosophila melanogaster, а также как пищевой краситель позволяет визуальное подтверждение того, что муха была введена (Рисунок 1B). Добавление пищевого красителя также помогает в распознавании засоренных иглы. Инъекции могут быть выполнены в брюшной полости, но держать место инъекции последовательной через эксперименты. Это поможет свести к минимуму возможные различия между каждым экспериментом.
Чтобы визуализировать флуоресцентно помеченные частицы в пределах ординаторных гемоцитов вдоль спинного сосуда, мы вскрыли спинной сосуд и прикрепили брюшную кутикулу. На рисунке 2A-F излагаются методы вскрытия.
Для оценки возрастной способности молодых и престарелых мух проводить фагоцитоз, гемоциты вдоль спинного сосуда визуализируются с помощью флуоресцентного микроскопа. Для обеспечения того, чтобы только клетки вдоль спинной сосуда подсчитываются, антитела или GFP-тегами генов для определенных маркеров клеток крови или сердца конкретных коллагена, таких как гемес и гемолектин, или Pericardin (Рисунок 3), соответственно, могут быть использованы22,23,24. Флуоресцентно помеченные частицы кишечной палочки имеют 1 мм в длину, в то время как гемоциты 10 мм вдиаметре 17. Подсчитываются только те флуоресцентные события, расположенные в диаметре 10 мм, сосредоточенном на DAPI-положительном ядре(рисунок 4). Для количественной оценки флуоресцентных событий используется программное обеспечение ImageJ(рисунок 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig1.jpg"> Рисунок 1: Сайт инъекций и визуальная проверка. (A) Боковая сторона грудной клетки прокалытается вытянутой капиллярной иглой. (B) Инъекции визуально проверены путем добавления зеленого пищевого красителя к раствору частицы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig2.jpg"> Рисунок 2: Вскрытие спинного сосуда. (A) Пины помещаются в грудную клетку и задний живот (черные стрелки). (B-C) Два горизонтальных разреза (зеленые стрелки) делаются на заднем конце живота(B),и передний конец (C). (D) Вертикальный разрез (зеленая стрелка) производится посередине живота, соединяя два горизонтальных разреза. (E) Дополнительные булавки (я) используются для филе открыть брюшной полости, подвергая внутренней ткани. (F) Внутренняя ткань (урожай, кишечник, матка, яичники, жировые тела) удаляется, подвергая спинной сосуд. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig3.jpg"> Рисунок 3: Венральный вид расчлененного спинного сосуда от 5-недельной самки, впрыскиваемой рН чувствительными частицами, окрашенными антителами, направленными против Перикардина (A). Пунктирная белая линия очерчивает боковую сторону спинного сосуда со стрелкой, указывающей на переднюю область. (B) Увеличенное изображение (A): кластеры гемоцитов (голубая стрелка), которые активно деградирует бактерии, в первой аортальной камере спинного сосуда. (C) Увеличенное изображение (A) с изложением внеклеточной матрицы (ECM) коллагеноподобный белок, Перикарин (зеленая стрелка), который держит спинной сосуд на месте24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig4.jpg"> Рисунок 4: Расчлененный спинной сосуд и связанные с ними гемоциты из самки мухи, вводимые с чувствительностью к рН частиц, или фтор-частиц. ()Спинной сосуд и связанные с ним гемоциты с поглощенным рН чувствительных помечены E. частицы кишечной палочки (красный), или (E) фтор-маркированные частицы кишечной палочки (красный), изолированные от 1-недельной мухи, после восстановления в течение 60 мин. (B, F) Увеличенный вставка (A) и (E) (белый ящик), соответственно, показывая два отдельных гемоцитов с подсчетом. (C) Спинной сосуд и связанные с ним гемоциты с поглощенным рН чувствительных помечены частицы кишечной палочки (красный), или ( G) фтор-маркированные частицы кишечной палочки (красный), изолированные от 5-недельной мухи, после восстановления в течение 60 мин. (D, H) Увеличенный вставка (C) и (G) (белый ящик), соответственно, показывая два отдельных гемоцитов с количеством случаев. Пунктирная белая линия очерчивает боковую сторону спинного сосуда со стрелкой, указывающей на переднюю область. Ядра, окрашенные DAPI (синий). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig5.jpg"> Рисунок 5: Количественная фагоцитарный событий в 10 мм гемоцитов с помощью счетчика клеток в ImageJ. (A) После открытия изображения (ы) в ImageJ, сотовый счетчик Уведомление инструмент может быть использован для отслеживания фагоцитных событий на клетку. (B) Этот инструмент назначит другой цвет каждой ячейке, выбранной для подсчета, с каждой точкой, соответствующей флуоресцентному событию в этойячейке. Нажатие на "alt'y" будет отображать таблицу, показывающую количество событий, подсчитанных в ячейке. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Этот протокол описывает in vivo анализ фагоцитоза, используемого для оценки и количественной оценки способности молодых и в возрасте Drosophila melanogaster гемоцитов к бактериям фагоцитозы.

Оценка возрастных фагоцитных способности взрослых Drosophila меланогастер гемоцитов с помощью In Vivo Фагоцитоз Анализа

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Наш протокол обеспечивает эффективный и повторяемый подход к оценке и количественной оценке фагоцитических событий в гемоцитах. Основным преимуществом этого метода является то, что мы можем количественно фагоцитических событий в отдельных гемоцитов, что позволяет нам обнаружить изменения в фагоцитических процессов среди генотипов у отдельных мух. Выполнение вскрытия может быть сложной задачей, поэтому при выполнении этого метода в первый раз, практика вскрытия как можно больше, прежде чем проводить полную процедуру.Начните с подготовки стеклянных игл для инъекций. Заполните один миллиметр шприц с минеральным маслом, и приложите 30 калибровочных подкожной иглы при условии, с нано-инжектором. Вставьте 30 калибровочных игл в тупой конец вытащил капиллярной иглы и заполнить его с минеральным маслом.Медленно удалите 30 калибровочных игл, убедившись, что пузырьки воздуха не образуются. Удалите коллет и поместите запечатанное O-кольцо с отступом вверх. Поместите больше O-кольцо на металлический поршень, а затем прикрепить коллет без затягивания.Вставьте металлический поршень в тупой конец заполненной маслом стеклянной иглы и аккуратно нажмите его вниз, вставив его в большой O-кольцо. Затем затяните коллет до безопасного. После заполнения иглы флюоро или рН чувствительных частиц, вводить мух в стерноплеуральной пластины грудной клетки.Инъекция успешна, если зеленый краситель идет в лету. Поместите инъекционных мух в новый пищевой флакон, увеяв время введения первой и последней мухи. Положите флакон на бок, пока все мухи не оправились, чтобы предотвратить их от застрять в пище.Ориентируйте вентральную сторону мухи вверх под рассеченным стереомикроскопом. Затем вставьте булавку насекомого в грудную клетку, а другой через самый задний конец живота возле гениталий. После того, как все мухи были закреплены, используйте передачу пипетки, чтобы добавить достаточно препарации средств для покрытия мух.Удалите голову ножницами кутикулы, и сделать горизонтальный разрез непосредственно над задней булавкой в животе, то другой в самом передней части живота. Сделайте вертикальный разрез, соединяющий два горизонтальных разреза, которые откроют брюшную полость. Используйте типсы для удаления внутренних органов и тканей, убедившись, что избежать спинного сосуда.При необходимости используйте дополнительные булавки для защиты разрезанных концов кутикулы. Затем удалите грудную клетку ножницами кутикулы. Откажитесь от средств вскрытия и замените его на один миллилитр 4%PFA, защищая вскрытия от света как можно больше.Исправить вскрытия в течение 15 минут при комнатной температуре при качания при 20 об/мин. Затем удалите фиксатор и добавьте один миллилитр 1X PBST. При желании испачкать вскрытия антителами.После монтажа кутикулы на слайде микроскопа, используйте миппы, чтобы сориентировать их вентральную сторону вверх, и убедитесь, что спинной сосуд виден. Молодые и пожилые мухи оценивались на возрастную способность проводить фагоцитоз с помощью флуоресцентной визуализации гемоцитов вдоль спинного сосуда. Антитела против перикардина были использованы для обеспечения того, чтобы только клетки вдоль спинного сосуда были подсчитаны.Поскольку частицы E.coli с люминесцентной маркировкой имеют один микрометр в длину, а гемоциты - 10 микрометров в диаметре, учитываются только флуоресцентные явления диаметром 10 микрометров, сосредоточенные на положительном ядре DAPI. Программное обеспечение ImageJ затем было использовано для количественной оценки событий. При попытке этой процедуры, важно визуализировать, что муха была на самом деле вводили и помнить, что сроки имеет решающее значение.Своевременное завершение инъекций и вскрытий поможет свести к минимуму экспериментальную ошибку и возможные колебания фагоцитического курса. Этот метод позволит исследователям исследовать различные темы исследования, включая вопросы, касающиеся клеточного иммунитета, различных популяций клеток крови или различения фагоцитоза от производства AMP во время успешного иммунного ответа.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Видео высокого разрешения отслеживания передвижения у взрослых дрозофилы

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

Препарирование Oenocytes от взрослых Дрозофилы</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Инъекции инсулина и гемолимфы добычи для измерения чувствительности к инсулину у взрослых Дрозофилы</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Измерение продолжительности жизни в<em&gt; Дрозофилы</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Выявление различий в сперме конкурентоспособности на<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Изображений Через куколки случае<em&gt; Дрозофилы</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule

Использование Рамсей анализе измерить жидкости секреции и поток ионов ставки в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Мальпигиев канальцев

Modulation of renal epithelial ion transport allows organisms to maintain ionic and osmotic homeostasis in the face of varying external conditions. The ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Определение области оптических поперечных мышц Drosophila Melanogaster взрослых косвенные рейса мышц

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Визуализация и отслеживание эндогенных мРНК в Live Drosophila меланогастер яйцо палаты

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...