Name: assessing the age-specific phagocytic ability of adult drosophila melanogaster hemocytes using an in vivo phagocytosis assay
Uploaded: 2020-06-11T13:30:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R03 AG061484-02 y el UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund.

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	<li>Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+DNA/RNA+methyltransferase+contributes+to+robust+host+defense+in+ageing+animals+by+regulating+sphingolipid+metabolism.">Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism.</a> The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li><li>DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+and+aging:+the+enemy+within.">Immunity and aging: the enemy within.</a> Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).</li><li>Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+and+aging.">Innate immunity and aging.</a> Experimental Gerontology. 43 (8), 718-728 (2008).</li><li>Panda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+innate+immunosenescence:+causes+and+consequences+for+immunity+in+old+age.">Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age.</a> Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).</li><li>Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosenescence:+emerging+challenges+for+an+ageing+population.">Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population.</a> Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).</li><li>Min, K. -. J., Tatar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+molecular+mechanism+of+immunosenescence+in+Drosophila.">Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472 (2018).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+on+the+fly:+a+primer+on+the+Drosophila+model+system.">Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li><li>Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+genetic+model+for+hematopoiesis.">Drosophila as a genetic model for hematopoiesis.</a> Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).</li><li>R&#228;met, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+phagocytosis+and+identification+of+a+Drosophila+receptor+for+E.+coli.">Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli.</a> Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).</li><li>Garschall, K., Flatt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+between+immunity+and+aging+in+Drosophila.">The interplay between immunity and aging in Drosophila.</a> F1000Research. 7, (2018).</li><li>Brennan, C. A., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+The+genetics+of+innate+immune+recognition+and+response.">Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response.</a> Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).</li><li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+a+fundamental+process+in+immunity.">Phagocytosis: a fundamental process in immunity.</a> BioMed Research International. 9042851, (2017).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).</li><li>Stuart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+analysis+of+the+Drosophila+phagosome.">A systems biology analysis of the Drosophila phagosome.</a> Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).</li><li>Mackenzie, D. K., Bussi&#232;re, L. F., Tinsley, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence+of+the+cellular+immune+response+in+Drosophila+melanogaster.">Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster.</a> Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).</li><li>Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+ability+declines+with+age+in+adult+Drosophila+hemocytes.">Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes.</a> Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).</li><li>Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+cellular+and+humoral+immune+responses+in+Drosophila.">Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila.</a> Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).</li><li>Garg, A., Wu, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rab14+mediates+phagocytosis+in+the+immune+response+to+Staphylococcus+aureus.">Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).</li><li>. Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington Available from: <a target="_blank" href="https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html">https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html</a> (2019)</li><li>Fellous, S., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+food+quality+affects+adult+(but+not+larval)+immune+gene+expression+independent+of+effects+on+general+condition.">Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition.</a> Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).</li><li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemese,+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein,+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila.">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li><li>Goto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+haemocyte-specific+protein,+hemolectin,+similar+to+human+von+Willebrand+factor.">A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor.</a> Biochemical Journal. 359, 99-108 (2001).</li><li>Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardin,+a+Drosophila+collagen,+facilitates+accumulation+of+hemocytes+at+the+heart.">Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart.</a> Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).</li><li>Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+proliferation+of+adult+hemocytes+in+Drosophila+by+BrdU+incorporation+and+PH3+expression+in+response+to+bacterial+infection.">Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection.</a> Wellcome Open Research. 3, (2018).</li><li>Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumu+is+required+for+circulating+hemocyte+differentiation+and+phagocytosis+in+Drosophila.">Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95 (2018).</li><li>Petraki, S., Alexander, B., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+blood+cell+populations+of+the+Drosophila+melanogaster+larva.">Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li><li>Gyoergy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+allowing+independent+visualization+and+genetic+manipulation+of+Drosophila+melanogaster+macrophages+and+surrounding+Tissues.">Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).</li><li>Bosch, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+of+adult+Drosophila+do+not+expand,+but+control+survival+after+bacterial+infection+by+induction+of+Drosocin+around+their+reservoir+at+the+respiratory+epithelia.">Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia.</a> BioRxiv. 578864, (2019).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí es una forma fiable de cuantificar diferentes aspectos de la fagocitosis, en condiciones experimentales controladas. Observamos que sólo hemos probado este procedimiento con partículas bacterianas gram negativas y los resultados pueden diferir si se utilizan partículas bacterianas gram positivas. De hecho, sería interesante comparar las respuestas fagocíticas con bacterias gram negativas y gram positivas en diferentes condiciones experimentales. El uso de un nano-inyector permite un control preciso sobre los volúmenes de inyección, asegurando que cada mosca se inyecta con el mismo volumen de partículas. Una limitación al protocolo proviene de incoherencias en los preparativos de partículas. Las partículas se agregarán una vez congeladas, por lo que pequeñas variaciones en los volúmenes de dilución, o la falta de vórtice, pueden afectar la concentración de partículas entre experimentos. Para minimizar las posibles variaciones en las concentraciones de partículas entre edades, es beneficioso inyectar moscas viejas de 1 y 5 semanas el mismo día, utilizando la misma aguja y solución de partículas. Otro inconveniente potencial es que durante las disecciones, el vaso dorsal y / o cutícula puede dañarse fácilmente si los pines no se manejan correctamente. Para evitar interrumpir el vaso dorsal, minimice el número de pasadores utilizados por disección. La ventaja de este método de disección es que todos los pasos de fijación, lavado y tinción se pueden realizar en la placa de disección. Debido a que las cutículas están ancladas hacia abajo, esto evita que las cutículas se pierdan entre pasos.
En comparación con los métodos existentes18,19,25,26,27,28,29, el protocolo descrito tiene sus ventajas y limitaciones. Al diseccionar el vaso dorsal, somos capaces de visualizar y cuantificar hemocitos individuales en este lugar. Esto permite detectar variaciones sutiles en la actividad fagocítica entre grupos experimentales. Otros métodos visualizan partículas etiquetadas fluorescentemente mediante la recolección de hemocitos utilizando un ensayo de sangrado/raspado19,25,26,27, o a través de una cutícula ventral intacta18,19,28,29; sin embargo, los hemocitos individuales no se pueden evaluar cuando se visualizan a través de la cutícula dorsal. La ventaja de este protocolo, en comparación con el método Bleed/Scrape es que nuestro método nos permite evaluar sólo aquellos hemocitos asociados con el vaso dorsal, y tiene en cuenta las células circulantes o las que a lo largo de la pared del cuerpo, que pueden ser funcionalmente diferentes. La disección del recipiente dorsal también elimina la necesidad de incluir una segunda ronda de inyecciones con un quencher de fluorescencia, como Trypan azul19,26. Esto se debe a que las partículas no enlazadas o engullidas por una célula se lavarán durante los pasos de lavado. Por el contrario, los métodos alternativos pueden ser más fáciles de realizar porque no requieren disecciones. Mientras que diseccionar el recipiente dorsal es fácil de aprender, este paso añade un nivel de complejidad que puede no ser factible en algunos diseños experimentales.
Aunque el uso descrito de este ensayo de fagocitosis in vivo es evaluar y cuantificar eventos fagocíticos entre diferentes edades, este protocolo es altamente adaptable y se puede utilizar para analizar diferentes aspectos de la fagocitosis entre el genotipo, el sexo o el tipo de tejido. Dado que la fagocitosis es de importancia central para la mayoría de los animales multicelulares, entender cómo este proceso disminuye con la edad podría conducir a mejores tratamientos terapéuticos para el envejecimiento de la población. Este enfoque ofrece un potencial a largo plazo para esclarecer aspectos de los cambios relacionados con la edad en la respuesta inmune, con especial atención a la fagocitosis.

El sistema inmunitario innato, que consiste en barreras físicas y químicas a la infección, así como componentes celulares, es evolutivo conservado a través de organismos multicelulares1,2. Como primera línea de defensa, el sistema inmune innato desempeña un papel crítico en la lucha contra los patógenos invasores en todos los animales1,2,3. Los componentes de la respuesta inmunitaria innata incluyen una amplia gama de tipos celulares que se clasifican sobre la base de que carecen de especificidad y memoria inmunológica2,3,4. En los seres humanos, estos tipos de células incluyen monocitos fagocíticos y macrófagos, neutrófilos, y células asesinas naturales citotóxicas4,5. Si bien tener un sistema inmunitario funcional es imprescindible para la supervivencia del huésped, está claro que la función de las células inmunitarias disminuye con la edad, un fenómeno conocido como inmunosensia5,6. Ser capaz de evaluar los cambios relacionados con la edad en la respuesta inmune, incluyendo diferentes aspectos del proceso de fagocitosis, podría ayudar en nuestra comprensión de la inmunosidad. El procedimiento que describimos aquí proporciona un enfoque eficaz y repetible para evaluar y cuantificar eventos fagocíticos por hemocitos en Drosophila melanogaster.
Drosophila es un modelo ideal para estudiar la respuesta inmune por muchas razones. Por un ejemplo, hay un amplio conjunto de herramientas genéticas disponibles que permiten manipular fácilmente la expresión génica de una manera dependiente del tejido7. Estas herramientas incluyen una colección de mutantes, existencias de interferencia de ARN, existencias DE GAL4/UAS y el Panel de Referencia Genética de Drosophila que contiene 205 líneas endogámicas diferentes para las que se catalogan todas las secuencias del genoma8. El corto ciclo de vida de Drosophila y el gran número de individuos producidos permiten a los investigadores probar múltiples individuos en un entorno controlado, en un corto período de tiempo. Esto mejora en gran medida la capacidad de identificar diferencias sutiles en las respuestas inmunitarias a la infección entre genotipos, entre sexos o a través de edades. Es importante destacar que muchos componentes genéticos y funciones de la respuesta inmunitaria innata, incluida la fagocitosis, se conservan evolutivamente entre Drosophila y los mamíferos1,2.
En Drosophila, el proceso de fagocitosis que sigue a la infección se lleva a cabo por hemocitos fagocíticos llamados plasmatocitos, que son equivalentes a los macrófagos de mamíferos9. Los hemocitos son esenciales para reconocer una amplia gama de partículas y eliminar patógenos microbianos9,10,11,12,13. Estas células expresan una variedad de receptores que deben diferenciarse de sí mismos de los no propios, e iniciar eventos de señalización necesarios para llevar a cabo el proceso fagocítico10,,11,12,13,14,15. Una vez que una partícula está unida, comienza a ser interiorizada por reorganización del citoesqueleto de actina y remodelación de la membrana plasmática para expandirse alrededor de la partícula, formando una copa fagocítica11,12,13,14. Durante este proceso, otro conjunto de señales indica a la célula que internalice aún más la partícula cerrando la copa fagocítica, formando un fagosoma ligado a la membrana11,12,13,14,15. El fagosoma se somete entonces a un proceso de maduración, asociándose con diferentes proteínas y fusionándose con lisosomas, formando un fagosoma ácido11,12,13,14,15. En este punto, las partículas pueden ser eficientemente degradadas y eliminadas11,12,13,14,15. Los estudios de Drosophila han revelado que las moscas mayores (4 semanas de edad) tienen una capacidad reducida para eliminar una infección en comparación con las moscas más jóvenes (1 semana de edad), probablemente debido, al menos en parte, a una disminución en algunos aspectos de la fagocitosis16,,17.
El método descrito aquí utiliza dos partículas de E. coli de muerte por calor etiquetadas fluorescentemente separadas, una con un fluoróforo estándar y otra sensible al pH, para evaluar dos aspectos diferentes de la fagocitosis: el engullimiento inicial de las partículas y la degradación de las partículas en el fagosoma. En este ensayo, la fluorescencia fluoroparta-partícula es observable cuando las partículas están unidas y engullidas por hemocitos, mientras que las partículas sensibles al pH fluoresce sólo en las condiciones de pH bajo del fagosoma. Los eventos fluorescentes se pueden observar en hemocitos que se localizan a lo largo del vaso dorsal. Nos centramos en los hemocitos localizados en el vaso dorsal, que proporcionan un punto de referencia anatómico para localizar hemocitos que se sabe que contribuyen al aclaramiento bacteriano, y para aislarlos constantemente. Sin embargo, los hemocitos en otras partes del cuerpo y la hemolymph también son importantes para el aclaramiento. Aunque no hemos estudiado esta población celular, nuestro procedimiento general podría ser aplicable para los ensayos fagocíticos de estas células también. Una ventaja de nuestro enfoque es que podemos cuantificar eventos fagocíticos dentro de hemocitos individuales, lo que nos permite detectar variaciones sutiles en los procesos fagocíticos. Otros estudios que visualizan eventos fluorescentes a través de la cutícula18,,19 no tienen en cuenta las diferencias en el número de hemocitos presentes, lo que es especialmente importante a considerar en nuestro caso ya que se espera que el recuento total de hemocitos cambie con la edadde 17años.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:531px;" width="531">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">0.10 mm Insect pins</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">26002-10</td>
			<td style="width:159px;">Here: pins are cut in half, and the sharp end is used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">1 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:96px;">Becton Dickinson</td>
			<td>309602</td>
			<td style="width:159px;">Filled with mineral oil to load needle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">15% Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:96px;">Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td style="width:159px;">for dissection media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">16 % Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:159px;">EM-grade, 4% working, diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">1x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">3 mL Trasnfer Pipet</td>
			<td style="width:96px;">Falcon</td>
			<td>357524</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">3.5&#34; Glass Capillaries</td>
			<td style="width:96px;">Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td style="width:159px;">1.14mm O.D X 3.5&#34; length X 0.53&#34; I.D</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">35x10 mm Petri dishes</td>
			<td style="width:96px;">Becton Dickinson</td>
			<td>351008</td>
			<td style="width:159px;">Used as dissection plate, filled half way with Sylgard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">6x penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td style="width:159px;">for dissection media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">70% Glycerol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Analog Vortex mixer</td>
			<td style="width:96px;">VWR</td>
			<td>58816-121</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Biological point forceps, Dumont No. 5</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td style="width:159px;">Diluted 1:1000 in 1x PBST</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Drosophila strain</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:159px;">w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">E. coli (K-12 strain) BioParticles&#8482;, Alexa Fluor&#8482; 594 conjugate</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>E23370</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Glass slides</td>
			<td style="width:96px;">Premiere</td>
			<td>D17026102</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Live cell imaging solution</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td style="width:159px;">preferred buffer for particle preparation and dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:96px;">Mpbio</td>
			<td>194836</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Nanoject II automatic nanoliter injector</td>
			<td style="width:96px;">Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Narrow Polystyrene Super Bulk Drosophila Vials</td>
			<td style="width:96px;">Genesee</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td style="width:159px;">Size: 25 X 95 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Nutating Mixer</td>
			<td style="width:96px;">Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-043</td>
			<td style="width:159px;">Speed used: 20 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">pHrodo&#8482; Red E. coli BioParticles&#8482; Conjugate for Phagocytosis</td>
			<td style="width:96px;">Life Technologies</td>
			<td>P35361</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Schneider&#39;s Drosophila cell culture media (1x)</td>
			<td style="width:96px;">Gibco</td>
			<td>21720-024</td>
			<td style="width:159px;">Dissection media, combine: Schneiders, FBS, and pen/strep; filter sterilize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:96px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:159px;">2mM (or 20%) working</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:96px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:161px;">Sylgard 184 Silicone elastomer</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>24236-10</td>
			<td style="width:159px;">Prepare according to provided protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:161px;">Tween 20</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td style="width:159px;">For PBS + 0.1% tween</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:161px;">Vertical Pipette Puller Model 700C</td>
			<td style="width:96px;">David Kopf Instruments</td>
			<td>812368</td>
			<td style="width:159px;">Heater: 55&#8451; Solenoid: 45</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:161px;">Zeiss AxioImager.Z1 fluorescent microscope</td>
			<td style="width:96px;">Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:159px;">Here: Apotome structural interference system with Zeiss Zen imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the age-specific phagocytic ability of adult drosophila melanogaster hemocytes using an in vivo phagocytosis assay

La fagocitosis es una función esencial de la respuesta inmunitaria innata. Este proceso se lleva a cabo por hemocitos fagocíticos cuya función principal es reconocer una amplia gama de partículas y destruir patógenos microbianos. A medida que los organismos envejecen, este proceso comienza a disminuir, pero poco se sabe sobre los mecanismos subyacentes o la base genética de la inmunosoncia. Aquí, un ensayo de fagocitosis in vivo basado en inyección se utiliza para evaluar los cambios relacionados con la edad en diferentes aspectos de la fagocitosis, como la unión, el engullido y la degradación de partículas internalizadas, cuantificando los eventos fagocíticos en los hemocitos en Drosophila adulta. Drosophila Por un solo lugar, muchos componentes genéticos y funciones de la respuesta inmunitaria innata, incluida la fagocitosis, se conservan evolutivamente entre Drosophila y los mamíferos. Debido a eso, los resultados obtenidos del uso de este protocolo son propensos a ser ampliamente relevantes para entender los cambios relacionados con la edad en la función inmune en una variedad de organismos. Además, observamos que este método proporciona estimaciones cuantitativas de la capacidad fagocítica de hemocitos, que podrían ser útiles para una variedad de temas de investigación, y no tienen por qué limitarse a estudios de envejecimiento.

Para ilustrar los métodos de inyección descritos, la Figura 1A muestra el lugar de inyección en Drosophila melanogaster, así como cómo el tinte alimentario permite una confirmación visual de que se inyectó la mosca (Figura 1B). La adición de tinte alimenticio también ayuda en el reconocimiento de una aguja obstruida. Las inyecciones se pueden realizar en el abdomen, pero mantener el lugar de inyección consistente en todos los experimentos. Esto ayudará a minimizar las posibles variaciones entre cada experimento.
Para visualizar las partículas etiquetadas fluorescentemente dentro de los hemocitos residentes a lo largo del vaso dorsal, diseccionamos el vaso dorsal y adjuntamos la cutícula abdominal. La Figura 2A-F describe los métodos de disección.
Para evaluar la capacidad específica de la edad de las moscas jóvenes y envejecidas para llevar a cabo la fagocitosis, los hemocitos a lo largo del vaso dorsal se visualizan mediante un microscopio fluorescente. Para asegurarse de que sólo se cuentan las células a lo largo del vaso dorsal, se pueden utilizar anticuerpos o genes con etiqueta GFP para determinados marcadores de células sanguíneas o colágeno específico del corazón, como Hemese y Hemolectin, o Pericardin (Figura 3), respectivamente,22,,23,,24. Las partículas de E. coli con etiqueta fluorescente mientras que las partículas de E. coli son de 1 mm de longitud, mientras que los hemocitos tienen 10 mm de diámetro17. Sólo se cuentan los eventos fluorescentes situados dentro de un diámetro de 10 mm centrados en un núcleo DAPI positivo(Figura 4). Para cuantificar eventos fluorescentes, se utiliza el software ImageJ (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig1.jpg"> Figura 1: Sitio de inyección y verificación visual. (A) El lado lateral del tórax está perforado con una aguja capilar tirada. (B) Las inyecciones se verifican visualmente añadiendo tinte alimentario verde a la solución de partículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig2.jpg"> Figura 2: Disección del vaso dorsal. (A) Los pines se colocan en el tórax y el abdomen posterior (flechas negras). (B-C) Se realizan dos incisiones horizontales (flechas verdes) en el extremo posterior del abdomen(B)y en el extremo anterior (C). (D) Se realiza una incisión vertical (flecha verde) en el centro del abdomen, conectando los dos cortes horizontales. (E) Los pines opcionales (*) se utilizan para abrir la cavidad abdominal, exponiendo el tejido interno. (F) Se extrae el tejido interno (cultivo, intestino, útero, ovarios, cuerpos de grasa), exponiendo el vaso dorsal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig3.jpg"> Figura 3: Vista ventral de un vaso dorsal diseccionado de una hembra de 5 semanas de edad inyectada con partículas sensibles al pH, manchada con anticuerpos dirigidos contra Pericardina (A). La línea blanca punteada delinea el lado lateral del vaso dorsal, con flecha apuntando hacia la región anterior. (B) Imagen ampliada de (A): racimos de hemocitos (flecha azul) que estaban degradando activamente las bacterias, dentro de la primera cámara aórtica del vaso dorsal. (C) Imagen ampliada de (A) que describe la matriz extracelular (ECM) de proteína similar al colágeno, Pericardin (flecha verde), que mantiene el vaso dorsal en el lugar24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig4.jpg"> Figura 4: Vaso dorsal diseccionado y hemocitos asociados de una mosca hembra inyectada con partículas sensibles al pH, o partículas fluoro. (A) El vaso dorsal y los hemocitos asociados con pH engullido sensible-etiquetada E. coli partículas (rojo), o (E) fluoro-etiquetado E. coli partículas (rojo), aislados de una mosca vieja de 1 semana, después de recuperarse durante 60 min. (B,F) Inserción magnificada de (A) y (E) (caja blanca), respectivamente, mostrando dos hemocitos individuales con eventos conteos. (C) El vaso dorsal y los hemocitos asociados con pH engullido sensible-etiquetado E. coli partículas (rojo), o ( G) fluorado-etiquetado E. coli partículas (rojo), aislados de una mosca de 5 semanas de edad, después de recuperarse durante 60 min. (D,H) Inserción magnificada de (C) y (G) (caja blanca), respectivamente, mostrando dos hemocitos individuales con eventos conteos. La línea blanca punteada delinea el lado lateral del vaso dorsal, con flecha apuntando hacia la región anterior. Núcleos manchados con DAPI (azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig5.jpg"> Figura 5: Cuantificar eventos fagocíticos dentro de un hemocitos de 10 mm utilizando el contador de celdas en ImageJ. (A) Después de abrir las imágenes en ImageJ, la herramienta Aviso de contador de celdas se puede utilizar para realizar un seguimiento de los eventos fagocíticos por celda. (B) Esta herramienta asignará un color diferente a cada celda seleccionada para ser contada, con cada punto correspondiente a un evento fluorescente dentro de esacelda. Al pulsar 'alt+y' se mostrará una tabla que muestra el número de eventos contados por celda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Este protocolo describe un ensayo in vivo de fagocitosis utilizado para evaluar y cuantificar la capacidad de los hemocitos de Drosophila melanogaster jóvenes y envejecidos a las bacterias fagocitosas..

Evaluación de la capacidad fagocítica específica por edad de los hemocitos de Drosophila melanogaster adultos utilizando un ensayo de fagocitosia In Vivo

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Nuestro protocolo proporciona un enfoque eficaz y repetible para evaluar y cuantificar eventos fagocíticos en hemocitos. La principal ventaja de esta técnica es que podemos cuantificar eventos fagocíticos dentro de hemocitos individuales lo que nos permite detectar variaciones en los procesos fagocíticos entre genotipos en moscas individuales. Realizar disecciones puede ser difícil, por lo que al realizar esta técnica por primera vez, practique las disecciones tanto como sea posible antes de llevar a cabo el procedimiento completo.Comience preparando agujas de vidrio para inyección. Llene una jeringa de un milímetro con aceite mineral y adjunte la aguja hipodérmica del calibre 30 provista del nanoinyector. Inserte la aguja del calibre 30 en el extremo romo de una aguja capilar tirada y llénala con aceite mineral.Retire lentamente la aguja del calibre 30 asegurándose de que no se formen burbujas de aire. Retire la pinza y coloque la junta tórica sellada con la sangría hacia arriba. Coloque la junta tórica más grande en el émbolo metálico y, a continuación, vuelva a colocar la pinza sin apretarla.Inserte el émbolo metálico en el extremo romo de la aguja de vidrio llena de aceite y empújelo suavemente hacia abajo insertándolo en la junta tórica más grande. A continuación, apriete el collet hasta que esté seguro. Después de llenar la aguja con partículas sensibles al fluoro o al pH, inyecte las moscas en la placa esternopleural del tórax.La inyección es exitosa si el tinte verde está entrando en la mosca. Coloque las moscas inyectadas en un vial de alimentos nuevo, teniendo en cuenta el momento en que se inyectó la primera y la última mosca. Colocar el vial de lado hasta que todas las moscas se hayan recuperado para evitar que se atasquen en el alimento.Oriente el lado ventral de la mosca hacia arriba bajo un estereomicroscopio diseccionado. Luego inserte un pasador de insecto en el tórax y otro a través del extremo más posterior del abdomen cerca de los genitales. Una vez que todas las moscas han sido ancladas, utilice una pipeta de transferencia para agregar suficientes medios de disección para cubrir las moscas.Retire la cabeza con tijeras de cutícula, y haga una incisión horizontal directamente por encima del pasador posterior en el abdomen, luego otra en el extremo más anterior del abdomen. Haga una incisión vertical que conecte las dos incisiones horizontales que abrirán la cavidad abdominal. Utilice fórceps para extraer los órganos y tejidos internos, asegurándose de evitar el vaso dorsal.Si es necesario, utilice pasadores adicionales para fijar los extremos de corte de la cutícula. A continuación, retire el tórax con las tijeras de cutícula. Deseche el medio de disección y reemplácelo por un mililitro de 4%PFA, protegiendo las disecciones de la luz tanto como sea posible.Fije las disecciones durante 15 minutos a temperatura ambiente mientras se balancea a 20 rpm. A continuación, quite el fijador y agregue un mililitro de 1X PBST. Si lo desea, manche las disecciones con anticuerpos.Después de montar las cutículas en un portaobjetos del microscopio, utilice fórceps para orientarlas hacia arriba y asegúrese de que el vaso dorsal sea visible. Las moscas jóvenes y envejecidas fueron evaluadas por la capacidad específica de la edad para llevar a cabo la fagocitosis mediante imágenes fluorescentes de hemocitos a lo largo del vaso dorsal. Se utilizó un anticuerpo contra la pericardiina para asegurar que sólo se contaran las células a lo largo del vaso dorsal.Dado que las partículas de E. coli con etiqueta fluorescente tienen un micrómetro de longitud y los hemocitos tienen 10 micrómetros de diámetro, solo se contaron eventos fluorescentes dentro de un diámetro de 10 micrómetros centrados en un núcleo DAPI positivo. El software ImageJ se utilizó entonces para cuantificar los eventos. Al intentar este procedimiento, es importante visualizar que la mosca se inyectó realmente y recordar que el tiempo es crítico.Completar las inyecciones y dissecciones de manera oportuna ayudará a minimizar el error experimental y las posibles variaciones en la tasa fagocítica. Esta técnica permitirá a los investigadores explorar una variedad de temas de investigación, incluyendo preguntas sobre inmunidad celular, diferentes poblaciones de células sanguíneas o distinguir la fagocitosis de la producción de AMP durante una respuesta inmune exitosa.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

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Investigación

Biología

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