Name: determination of chemical inhibitor efficiency against intracellular toxoplasma gondii growth using a luciferase-based growth assay
Uploaded: 2020-04-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay at JoVE.com

De auteurs willen Drs. Sibley en Carruthers bedanken voor het delen van pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plasmid en anti-TgCPL en TgActin antilichamen. Dit werk werd ondersteund door het Clemson Startup fonds (aan Z.D.), Temptemplar Eye Foundation Pediatric Oog-Ophthalmology Career-Starter Research Grant (aan Z.D.), een pilot subsidie van een NIH COBRE grant P20GM109094 (aan Z.D.), en NIH R01AI143707 (naar Z.D.). De financiers hadden geen rol in het ontwerpen van studies, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit om het manuscript te publiceren of te bereiden.

Toxoplasma gondii is ingedeeld in Risk Group 2 en moet worden behandeld op een Biosafety Level 2 (BSL-2). Het protocol is herzien en goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor bioveiligheid van de Clemson University.
1. Luciferase-gebaseerde Toxoplasma groeitest
<ol><li>Zaad menselijke voorhuid fibroblasten (HFFs) 1 week voor parasiet inenting om ervoor te zorgen dat gastheercellen volledig confluent zijn. Voer een mock test uit in een transparante plaat om ervoor te ...

<ol>
	<li>Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lytic+Cycle+of+Toxoplasma+gondii:+15+Years+Later.">Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).</li><li>Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+Seroprevalence+in+the+United+States+2009-2010+and+Comparison+with+the+Past+Two+Decades.">Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).</li><li>Kieffer, F., Wallon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+toxoplasmosis.">Congenital toxoplasmosis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).</li><li>Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annual+cost+of+illness+and+quality-adjusted+life+year+losses+in+the+United+States+due+to+14+foodborne+pathogens.">Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens.</a> Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).</li><li>Dubey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasmosis.">Toxoplasmosis.</a> Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).</li><li>Lindsay, D., Dubey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+changing+paradigm+of+congenital+toxoplasmosis.">Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis.</a> Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).</li><li>Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+on+anti-Toxoplasma+drugs+discovery:+Design,+synthesis+and+screening.">Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).</li><li>Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+toxoplasmosis+II:+clinical+features,+pathology+and+management.">Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).</li><li>Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Labeling+of+Intracellular+Toxoplasma+gondii+with+Uracil.">Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).</li><li>Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+immunoassay+for+evaluation+of+Toxoplasma+gondii+growth+in+tissue+culture.">Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).</li><li>Derouin, F., Chastang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+immunoassay+to+assess+effect+of+antimicrobial+agents+on+Toxoplasma+gondii+in+tissue+culture.">Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).</li><li>McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Growth+Assay+for+Toxoplasma+gondii+Using+Yellow+Fluorescent+Protein.">High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).</li><li>Touquet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+assay+to+evaluate+Toxoplasma+gondii+infection+and+proliferation:+A+multiparametric+assay+to+screen+new+compounds.">High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds.</a> PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).</li><li>Thornton, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ortholog+of+Plasmodium+falciparum+chloroquine+resistance+transporter+(PfCRT)+plays+a+key+role+in+maintaining+the+integrity+of+the+endolysosomal+system+in+Toxoplasma+gondii+to+facilitate+host+invasion.">An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).</li><li>Larson, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+cathepsin+L+is+the+primary+target+of+the+invasion-inhibitory+compound+morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl+sulfone+phenyl.">Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).</li><li>Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+Ingests+and+Digests+Host+Cytosolic+Proteins.">Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins.</a> mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).</li><li>Cristina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+depends+on+lysosomal+consumption+of+autophagosomes+for+persistent+infection.">Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).</li><li>Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+L+occupies+a+vacuolar+compartment+and+is+a+protein+maturase+within+the+endo/exocytic+system+of+Toxoplasma+gondii.">Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).</li><li>Huynh, M. H., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tagging+of+endogenous+genes+in+a+Toxoplasma+gondii+strain+lacking+Ku80.">Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80.</a> Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).</li><li>Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Genome+Engineering+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/Cas9.">Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9.</a> PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).</li><li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).</li><li>Radke, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cell+cycle+for+the+tachyzoite+stage+of+Toxoplasma+gondii.">Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).</li><li>Ran, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-CRISP:+fast+CRISPR+target+site+identification.">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).</li><li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuPaGDT:+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens.">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li></ol>

++Dit protocol beschrijft een op luciferase gebaseerd protocol om de intracellulaire Toxoplasma-groei te beoordelen en de remmingswerkzaamheid van chemische verbindingen tegen de groei van parasieten te evalueren. Vergeleken met de bestaande strategieën die beschikbaar zijn voor het meten van intracellulaire Toxoplasma-groei, vertoont deze methode een hoge gevoeligheid en specificiteit. Tijdens het monitoren van de groei van parasieten wordt een mock-test in een duidelijke 96-microplaat aanbevolen om t...

Toxoplasma gondii is een zeer succesvolle obligate intracellulaire parasiet die ongeveer een derde van de menselijke bevolking infecteert. De hoge transmissiesnelheid is voornamelijk te wijten aan de diverse transmissieroutes, waaronder de consumptie van niet gaar vlees, blootstelling aan reservoirs van zoogdieren en aangeboren overdracht tijdens de geboorte. T. gondii veroorzaakt vooral opportunistische infecties die kunnen leiden tot ernstige morbiditeit en mortaliteit bij immuungecompromitteerde personen1,2,3,4,5,6. De antibiotica die momenteel worden gebruikt voor de behandeling van acute toxoplasmose zijn bijzonder inefficiënt bij de behandeling van aangeboren en latente infecties en veroorzaken ernstige reacties bij sommige personen3,7,8. Er bestaat dus een dringende behoefte om nieuwe therapieën te identificeren. Inzicht in de verschillen in subcellulaire processen binnen Toxoplasma en de gastheer ervan zal helpen om potentiële medicijndoelen te identificeren. Daarom zijn efficiënte en handige genoommanipulatietechnieken nodig om de rol van individuele genen binnen Toxoplasmate bestuderen. Bovendien behoort Toxoplasma tot de phylum Apicomplexa, die verschillende andere belangrijke menselijke ziekteverwekkers omvat, zoals Plasmodium spp. en Cryptosporidium spp. Vandaar dat Toxoplasma kan worden gebruikt als een modelorganisme om de basisbiologie in andere apicomplexe parasieten te bestuderen.
Om nieuwe antibiotica tegen microbiële pathogenen te identificeren, wordt een hoge doorvoerscreening van een bibliotheek van chemische verbindingen in eerste instantie uitgevoerd om hun werkzaamheid bij de onderdrukking van microbiële groei te bepalen. Tot nu toe zijn er verschillende op microplaat gebaseerde groeitesten ontwikkeld voor het meten van de intracellulaire groei van T. gondii (d.w.z., radioactief 3H-uracil-incificering-gebaseerde kwantificering9, kwantitatieve ELISA-gebaseerde parasietdetectie met behulp van T. gondii-specifiekeantilichamen10,11, reporter protein-based measurement β-galactosidase of YFP-expressing Toxoplasma stammen12,13, en een recent ontwikkelde high-content imaging assay14).
Deze individuele strategieën hebben allemaal unieke voordelen; bepaalde beperkingen beperken echter ook hun toepassingen. Bijvoorbeeld, omdat Toxoplasma alleen kan repliceren in nucleated dierlijke cellen, autofluorescentie en niet-specifieke binding vananti-T. gondii antilichamen aan gastheercellen veroorzaken interferentie in fluorescentie-gebaseerde metingen. Bovendien vereist het gebruik van radioactieve isotopen speciale veiligheidsvoorschriften en mogelijke veiligheidsproblemen. Sommige van deze tests zijn meer geschikt voor het beoordelen van de groei op een enkel tijdstip in plaats van continue monitoring van de groei.
Hier gepresenteerd is een luciferase-gebaseerd protocol voor de kwantificering van intracellulaire Toxoplasma groei. In een eerdere studie werd het NanoLuc luciferase-gen gekloond onder de Toxoplasma-tobulinpromotor, en deze luciferaseexpressieconstructie werd getransfecteerd tot wild-type (RHΔku80Δ Toxoplasma hxg-stam) parasieten om een RHΔku80Δhxgte creëren::NLuc-stam (aangeduid als RHΔku80::NLuc hiernamaals)15. Deze stam diende als de ouderlijke stam voor intracellulaire groeibepaling en gendeletie in deze studie. Met behulp van de RHΔku80::NLuc stam, parasiet groei in menselijke voorhuid fibroblasten (HFFs) werd gecontroleerd over een periode van 96 uur na de infectie om parasiet verdubbeling seinstijd te berekenen.
Bovendien kan de remmingswerkzaamheid van LHVS tegen de groei van parasieten worden bepaald door toxoplasma-groeicijfers te plotten tegen seriële LHVS-concentraties om de IC50-waarde te identificeren. Eerdere literatuur heeft gemeld dat TgCPL een belangrijk doelwit is van LHVS bij parasieten en dat behandeling met LHVS de ontwikkeling van acute en chronische Toxoplasma-infecties vermindert 16,17,18,19. Daarnaast werd RHΔku80::NLuc gebruikt als de ouderlijke stam voor genoommodificatie om een TgCPL-gebrekkigestam te genereren (RHΔku80Δcpl::NLuc),en de remming van LHVS werd gemeten tegen deze mutant. Door het observeren van een upshift van IC50-waarden voor LHVS in de TgCPL-gebrekkigeparasieten in vergelijking met de WT-stam, werd gevalideerd dat TgCPL het doelwit is van LHVS in vivo.
In dit protocol, RHΔku80::NLuc wordt gebruikt als de ouderlijke stam, die een efficiënte niet-homologe end-joining traject (NHEJ) ontbreekt, waardoor dubbele crossover homologie-afhankelijke recombinatie (HDR)20,21. Bovendien worden 50 bp homologe regio's geflankeerd aan beide uiteinden van een medicijnresistentiecassette door PCR. Het PCR-product dient als een reparatiesjabloon om de gehele genlocus via HDR te verwijderen met behulp van crispr-Cas9-gebaseerde genoombewerkingstools. Dergelijke korte homologe regio's kunnen gemakkelijk worden opgenomen in primers, het verstrekken van een handige strategie voor de productie van de reparatie sjabloon. Dit protocol kan worden aangepast om universele gendeletie en enogene gentagging uit te voeren.
Bijvoorbeeld, in onze meest recente publicatie, drie protease genen, TgCPL, TgCPB (Toxoplasma cathepsin B-achtige protease), en TgSUB1 (Toxoplasma subtilisine-achtige protease 1), werden genetisch ablated in TgCRT (Toxoplasma chloroquine-resistentie transporter) -ficiënte parasieten met behulp van deze methode15. Bovendien werd TgAMN (een putatief aminopeptidase N [TgAMN, TGGT1_221310]) endogeen gelabeld15. Het Lourido-lab rapporteerde ook met behulp van korte homologe regio's in het bereik van 40-43 bp voor de introductie van site-gerichte genmutatie en endogene gentagging in het Toxoplasma genoom met behulp van een soortgelijke methode22. Deze succesvolle genoommodificaties suggereren dat een homologe regio van 40-50 bp voldoende is voor een efficiënte DNA-recombinatie in de TgKU80-gebrekkigestam, wat genoommanipulatie in Toxoplasma gondiiaanzienlijk vereenvoudigt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel extraction kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T1020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek Instuments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C29871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneAmp HiFi PCR premix</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>639298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine h</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>301-10 hCTZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phire Tissue Direct PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F170L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E0554S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneious software for sgRNA design (version: R11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software (8th version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of chemical inhibitor efficiency against intracellular toxoplasma gondii growth using a luciferase-based growth assay

Toxoplasma gondii is een protozoan ziekteverwekker die op grote schaal de menselijke bevolking beïnvloedt. De huidige antibiotica die worden gebruikt voor de behandeling van klinische toxoplasmose zijn beperkt. Bovendien vertonen ze nadelige bijwerkingen in bepaalde groepen mensen. Daarom is de ontdekking van nieuwe therapieën voor klinische toxoplasmose noodzakelijk. De eerste stap van nieuwe antibioticaontwikkeling is het identificeren van chemische verbindingen die een hoge werkzaamheid vertonen bij remming van de groei van parasieten met behulp van een hoge doorvoerscreeningstrategie. Als obligate intracellulaire ziekteverwekker kan Toxoplasma alleen repliceren in gastheercellen, wat het gebruik van optische absorptiemetingen als snelle indicator van groei verbiedt. Hier gepresenteerd is een gedetailleerd protocol voor een luciferase-gebaseerde groei test. Als voorbeeld wordt deze methode gebruikt om de verdubbelingstijd van wilde Toxoplasma-parasieten te berekenen en de werkzaamheid van morfolinurea-leucyl-homofenyl-vinylsulfonefenyl (LHVS, een cysteine protease-targeting verbinding) met betrekking tot remming van parasiet intracellulaire groei te meten. Ook beschreven, is een CRISPR-Cas9-gebaseerde gendeletieprotocol in Toxoplasma met behulp van 50 bp homologe regio's voor homologie-afhankelijke recombinatie (HDR). Door het kwantificeren van de remmingswerkzaamheid van LHVS in wild-type en TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-achtige protease)-deficiënte parasieten, wordt aangetoond dat LHVS de groei van wilde parasieten efficiënter remt dan δcpl-groei, wat suggereert dat TgCPL een doelwit is waaraan LHVS zich bindt in Toxoplasma. De hoge gevoeligheid en eenvoudige werking van deze op luciferase gebaseerde groeitest maken het geschikt voor het monitoren van Toxoplasma-proliferatie en het evalueren van de werkzaamheid van geneesmiddelen op een hoge doorvoermanier.

Figuur 1 is een voorbeeld van een groeicurve voor de RHΔku80::NLuc-stam en de afgeleide berekening voor de verdubbelingstijd. Over het algemeen wordt de test uitgevoerd in drie technische replicaties voor elk van de drie biologische repliceert om rekening te houden met variaties van luciferase activiteit lezingen. Om de genormaliseerde plooiverandering van de parasietgroei te berekenen, werd elke lezing bij 24-96 uur na de infectie gedeeld ...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay at JoVE.com

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay (Video) | JoVE

Hier gepresenteerd is een protocol om de remming werkzaamheid van chemische verbindingen te evalueren tegen in vitro intracellulaire groei van Toxoplasma gondii met behulp van een luciferase-gebaseerde groei test. De techniek wordt gebruikt om remmingsspecificiteit te bevestigen door genetische verwijdering van het overeenkomstige doelgen. De remming van LHVS tegen TgCPL protease wordt als voorbeeld geëvalueerd.

Bepaling van de chemische remmer efficiëntie tegen intracellulaire Toxoplasma Gondii Groei met behulp van een Luciferase-Based Growth Assay

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

Deze gevoelige strategieën kunnen worden gebruikt om de remmingseffectie van chemische remmers te evalueren en in combinatie met CRISPR-Cas9-gendeling om de medicijndoelen te onderzoeken. In plaats van een endpoint-test te gebruiken, kan de groei van parasieten na verloop van tijd worden gecontroleerd om de berekening van de verdubbelingstijd van parasieten mogelijk te maken met behulp van een gevoelig reportereiwit. Deze test kan mogelijk worden opgeschaald in 384 of 1, 536 goed microplaten voor het testen van meerdere verbindingen of voor het screenen van bibliotheken op een hoge doorvoermanier.Deze strategie kan worden gewijzigd om de groei van andere intracellulaire microbiële pathogenen en hun reacties op het geneesmiddel van belang te kwantificeren. Om een luciferase-gebaseerde Toxoplasma groeitest uit te voeren, beginnen met het zorgvuldig aspireren van het medium van voorgezaaide 96-well microplate culturen van menselijke voorhuid fibroblasten en inenten 150 microliter van parasiet B suspensie in de putten in een drie kolom-vijf rij formaat. Na een incubatie van vier uur in de couveuse van de celcultuur, het medium voorzichtig uit elke put aanzuigen om de niet-binnengevallen parasieten te verwijderen en de putten in elk, maar de eerste rij te vullen met kamertemperatuurfenol roodvrij medium.Voeg vervolgens 100 microliters van een 12,5 micromolar luciferase substraatoplossing in PBS toe aan elke put van de bovenste rij en ontcubeer de microplaten gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om volledige cellyse mogelijk te maken. Aan het einde van de incubatie meet u de luciferase-activiteit op een microplatelezer. Elke lezing vertegenwoordigt het oorspronkelijke aantal binnengevallen parasieten op vier uur na infectie.Herhaal de analyse elke 24 uur voor de komende vier dagen zonder het medium te veranderen. Om de genormaliseerde vouw-verandering van parasietgroei te berekenen, kan elke lezing door de aanvankelijke lezing bij vier uren na besmetting worden verdeeld. Het log 2 van de genormaliseerde vouw-verandering van parasietgroei kan dan tegen elk keerpunt worden uitgezet en aan een lineaire regressiefunctie worden onderworpen om de helling te verkrijgen die de verdubbelingstijd vertegenwoordigt.Om de werkzaamheid van de remming van een verbinding van belang op toxoplasmagroei te beoordelen, voorhuid van de menselijke voorskinfibroblasten in 96-well microplaten gedurende ten minste zeven dagen voordat elke put van cellen met 150 microliter parasieten worden ingeënt, zoals aangetoond gedurende vier uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Bereid tijdens de incubatie de verbinding van belang voor bij acht verschillende concentraties in een reservoir met 12 put door seriële verdunning. Verdun de verbindingen in een reservoir met 12 putten bij een één-op-drie verdunning door elk mengsel meerdere keren op en neer te pipetten met een pipet van één milliliter.Na vier uur na infectie, vervang het medium in elke put van kolommen twee tot en met negen met 150 microliters van medium aangevuld met elke verdunning van de verbinding, waardoor de eerste kolom gevuld met regelmatige medium om te dienen als de niet-behandelde controle. Breng vervolgens de celculturen 96 uur terug naar de celkweek incubator en meet de luciferase-activiteit voor elke put om het percentage groeiremming in de culturen bij elke concentratie van de verbinding te bepalen. Om de genormaliseerde luciferase activiteit als percentage te berekenen, verdeel je de gemiddelde luciferase activiteit voor elke samengestelde concentratie door de gemiddelde luciferase activiteit afgeleid van de niet-behandelde parasieten.Gebruik vervolgens een geschikt grafieksoftwareprogramma om de genormaliseerde luciferase-activiteiten in kaart te brengen tegen de individuele verbinding en om de half maximale remmende concentratie voor elke verbinding te berekenen. Om een plasmidconstructie te genereren die single-guide RNA en Cas9 uitdrukt voor het verwijderen van een gen van belang, navigeer je naar de Toxoplasma Genomics Resource-pagina en haal je de volledige gencoderende sequentie op, inclusief de intronen en exonen, samen met de vijf en drie eerste onvertaalde regio's van 1,5 kilobasis. Kopieer de opgehaalde TgCPL-reeks in de sequentieanalysesoftware en label de vijf en drie eerste onvertaalde gebieden.Klik op de pagina Toxoplasma Genomics Resource op Downloaden, Gegevensbestanden en Current_Release. Selecteer FASTA in de map T.gondii GT1. Download uit de gegevensmap het Toxoplasma gondii GT1-stamgenoomsequentiebestand.Maak vervolgens een lokale map met de naam Toxoplasma Genome in de DNA-sequentieanalysesoftware en importeer het Toxoplasma-genoomsequentiebestand in de map. Selecteer Gereedschappen, Klonen en CRISPR-sites zoeken en stel drie prime Cas9-objecten in voor de PAM-sitelocatie. Selecteer een RNA met één gids dat een hoge specificiteitsscore aantoont, over het algemeen groter dan 98%, en een G mist na de NGG.De geselecteerde single-guide RNA bevindt zich meestal op locaties dicht bij het begin en stop codons van het gen van belang. Gebruik vervolgens een PCR premix met de instellingen zoals aangegeven in de tabel om een PCR-reactie uit te voeren om de reeds bestaande plasmide uit te drukken single-guide RNA dat zich richt op de TgUPRT gen te wijzigen. Voor Toxoplasma transfectie, meng twee microgram van gerepareerde sjabloon DNA met 20 microgram van de single-guide RNA Cas9 expressie plasmiden en meng 400 microliter van parasiet resuspensie, DNA, en vijf microliter van 200 millimolar ATP 500 millimolar verminderde glutathion in een 1,5 liter centrifuge buis.Voeg cytomix buffer toe om het totale volume tot 500 microliters te brengen als dat nodig is en breng het parasiet-DNA-mengsel over naar een gat van vier millimeter met elektroporatie cuvette. Elektroporate de parasieten op twee kilovolts en 50 ohm weerstand. Om knock-outparasieten te klonen, voer eerst een verdunning in twee stappen uit van de parasieten om een 10 parasieten per milliliter D10-medium te bereiken, aangevuld met de juiste antibioticaconcentratie.Breng vervolgens 150 microfiliter van de geresuspendeerde gezuiverde parasieten over naar elke put van een 96-bron microplaat voorgezaaid met voorhuidfibroblasten en broed de microplaat zeven dagen lang uit op 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide. Aan het einde van de incubatie, identificeer de putten met een enkele plaque en breng 75 microliter van de geresuspended Toxoplasma geïnfecteerde menselijke voorhuid fibroblasten uit elke put van de 96-well microplate cultuur in individuele 1,5 milliliter buizen. Verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellets in 10,25 microliter lyse buffer met verdunning buffer in DNA release additief.Vervolgens broeden de monsters gedurende vier minuten bij kamertemperatuur en twee minuten bij 98 graden Celsius voor het uitvoeren van PCR om te testen op de integratie van de drug resistentie cassette en verlies van het gen van belang. De remmingswerking van LHVS en het wilde type in delta CPL-stammen kan worden bepaald door hun luciferase-activiteiten in kaart te brengen tegen verschillende remmerconcentraties. Na PCR wordt het gemuteerde plasmid gelinealiseerd en geladen in een 1%agarose gel voor de verificatie van een succesvolle versterking.Na gelextractie en E.coli-transformatie kunnen de klonen met de verwachte plasmiden worden gescreend door beperking endonucleasevertering in DNA-sequencing. Na reparatie sjabloon versterking, agarose gel elektroforese kan worden gebruikt om de juiste grootte van het PCR-product te controleren. Over het algemeen worden zeven tot acht klonen geselecteerd voor de eerste screening om te controleren op verwijdering van de codering van het gen van belang, gevolgd door detectie van de vijf en drie priemgewapens om het totale aantal te screenen klonen te minimaliseren.Verdere verificatie kan worden voltooid door immunoblotting als er een antilichaam dat het doeleiwit herkent beschikbaar is. Voordat luciferase activiteitsmetingen worden verkrijgt, moet een duidelijke microplaat met een schijninfectie onder een microscoop worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de parasieten de gastheercellen niet volledig lyse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient (Video) | JoVE

Het verkrijgen van zeer zuivere Toxoplasma gondii Oöcysten door een discontinue Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions (Video) | JoVE

Toxoplasma gondii Cyste muur Vorming in actieve beenmerg afgeleide Macrofagen en Bradyzoite voorwaarden

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT (Video) | JoVE

Transnuclear Muizen met vooraf gedefinieerde T-cel-receptor Bijzonderheden tegen Toxoplasma gondii Verkregen via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants (Video) | JoVE

Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms (Video) | JoVE

Groei Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line (Video) | JoVE

Een Parasiet Rescue and Transformation Assay voor antileishmania Screening tegen intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Human acute monocytische leukemiecellijn

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source (Video) | JoVE

Staphylococcus aureus Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃŽâ€ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii (Video) | JoVE

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃŽÂ³-Dependent Cell Autonomous Immunity (Video) | JoVE

Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genen Belangrijk voor Weerstand tegen IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immuniteit

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses (Video) | JoVE

Paarsgewijze Groei Competitie Assay voor het bepalen van de Replicatie Fitness van Human Immunodeficiency Virussen

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...