Name: determination of chemical inhibitor efficiency against intracellular toxoplasma gondii growth using a luciferase-based growth assay
Uploaded: 2020-04-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לד. סיבלי וקארותרס לשיתוף pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT פלאמיד ואנטי-TgCPL ו-TgActin נוגדנים. עבודה זו נתמכת על ידי קרן ההפעלה קלמסון (כדי Z.D.), אבירים הטמפלרים עין קרן רפואת עיניים הקריירה-Starter מחקר מענק (כדי Z.D.), מענק הטייס של מענק NIH COBRE P20GM109094 (כדי Z.D.), ו-NIH R01AI143707 (כדי Z.D.). לתורמים לא היה כל תפקיד בתכנון לימוד, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

טוקסופלזמה gondii מסווג בקבוצת סיכון 2 ויש לטפל ברמת בטיחות ביולוגית 2 (bsl-2). הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת הביובטיחות המוסדית באוניברסיטת קלמסון.
1. לוציפראז מבוסס טוקסופלזמה הצמיחה המבוססת
<ol><li>זרעי העורלה האנושית (HFFs) 1 שבוע לפני הטפיל חיסון כדי להבטיח כי תאים מאר...

<ol>
	<li>Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lytic+Cycle+of+Toxoplasma+gondii:+15+Years+Later.">Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).</li><li>Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+Seroprevalence+in+the+United+States+2009-2010+and+Comparison+with+the+Past+Two+Decades.">Toxoplasma gondii Seroprevalence in the United States 2009-2010 and Comparison with the Past Two Decades.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 90 (6), (2014).</li><li>Kieffer, F., Wallon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+toxoplasmosis.">Congenital toxoplasmosis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 112, 1099-1101 (2013).</li><li>Hoffmann, S., Batz, M. B., Morris, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annual+cost+of+illness+and+quality-adjusted+life+year+losses+in+the+United+States+due+to+14+foodborne+pathogens.">Annual cost of illness and quality-adjusted life year losses in the United States due to 14 foodborne pathogens.</a> Journal of Food Protection. 75 (7), 1292-1302 (2012).</li><li>Dubey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasmosis.">Toxoplasmosis.</a> Journal of the American Veterinary Medical Association. 205 (11), 1593-1598 (1994).</li><li>Lindsay, D., Dubey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+changing+paradigm+of+congenital+toxoplasmosis.">Toxoplasma gondii: the changing paradigm of congenital toxoplasmosis.</a> Parasitology. 138 (14), 1-3 (2011).</li><li>Deng, Y., Wu, T., Zhai, S., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+on+anti-Toxoplasma+drugs+discovery:+Design,+synthesis+and+screening.">Recent progress on anti-Toxoplasma drugs discovery: Design, synthesis and screening.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 183, 111711 (2019).</li><li>Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+toxoplasmosis+II:+clinical+features,+pathology+and+management.">Ocular toxoplasmosis II: clinical features, pathology and management.</a> Clinical &amp; Experimental Ophthalmology. 41 (1), 95-108 (2013).</li><li>Pfefferko, E., Pfefferko, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Labeling+of+Intracellular+Toxoplasma+gondii+with+Uracil.">Specific Labeling of Intracellular Toxoplasma gondii with Uracil.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 24 (3), 449-453 (1977).</li><li>Merli, A., Canessa, A., Melioli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+immunoassay+for+evaluation+of+Toxoplasma+gondii+growth+in+tissue+culture.">Enzyme immunoassay for evaluation of Toxoplasma gondii growth in tissue culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 21 (1), 88-91 (1985).</li><li>Derouin, F., Chastang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+immunoassay+to+assess+effect+of+antimicrobial+agents+on+Toxoplasma+gondii+in+tissue+culture.">Enzyme immunoassay to assess effect of antimicrobial agents on Toxoplasma gondii in tissue culture.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 32 (3), 303-307 (1988).</li><li>McFadden, D., Seeber, F., Boothroyd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Growth+Assay+for+Toxoplasma+gondii+Using+Yellow+Fluorescent+Protein.">High-Throughput Growth Assay for Toxoplasma gondii Using Yellow Fluorescent Protein.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (1), 309-316 (2003).</li><li>Touquet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+assay+to+evaluate+Toxoplasma+gondii+infection+and+proliferation:+A+multiparametric+assay+to+screen+new+compounds.">High-content imaging assay to evaluate Toxoplasma gondii infection and proliferation: A multiparametric assay to screen new compounds.</a> PLoS ONE. 13 (8), e0201678 (2018).</li><li>Thornton, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ortholog+of+Plasmodium+falciparum+chloroquine+resistance+transporter+(PfCRT)+plays+a+key+role+in+maintaining+the+integrity+of+the+endolysosomal+system+in+Toxoplasma+gondii+to+facilitate+host+invasion.">An ortholog of Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) plays a key role in maintaining the integrity of the endolysosomal system in Toxoplasma gondii to facilitate host invasion.</a> PLOS Pathogens. 15 (6), e1007775 (2019).</li><li>Larson, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+cathepsin+L+is+the+primary+target+of+the+invasion-inhibitory+compound+morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl+sulfone+phenyl.">Toxoplasma gondii cathepsin L is the primary target of the invasion-inhibitory compound morpholinurea-leucyl-homophenyl-vinyl sulfone phenyl.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284 (39), 26839-26850 (2009).</li><li>Dou, Z., McGovern, O. L., Cristina, M., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+Ingests+and+Digests+Host+Cytosolic+Proteins.">Toxoplasma gondii Ingests and Digests Host Cytosolic Proteins.</a> mBio. 5 (4), e01188-14 (2014).</li><li>Cristina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+depends+on+lysosomal+consumption+of+autophagosomes+for+persistent+infection.">Toxoplasma depends on lysosomal consumption of autophagosomes for persistent infection.</a> Nature Microbiology. 2, 17096 (2017).</li><li>Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+L+occupies+a+vacuolar+compartment+and+is+a+protein+maturase+within+the+endo/exocytic+system+of+Toxoplasma+gondii.">Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).</li><li>Huynh, M. H., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tagging+of+endogenous+genes+in+a+Toxoplasma+gondii+strain+lacking+Ku80.">Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80.</a> Eukaryotic cell. 8 (4), 530-539 (2009).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8 (4), 520-529 (2009).</li><li>Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Genome+Engineering+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/Cas9.">Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9.</a> PLoS ONE. 9 (6), e100450 (2014).</li><li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR/CAS9.">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), e01114-14 (2014).</li><li>Radke, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+cell+cycle+for+the+tachyzoite+stage+of+Toxoplasma+gondii.">Defining the cell cycle for the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (2), 165-175 (2001).</li><li>Ran, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li><li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-CRISP:+fast+CRISPR+target+site+identification.">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nature Methods. 11 (2), 2812 (2014).</li><li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EuPaGDT:+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens.">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomics. 1 (4), e000033 (2015).</li><li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes.">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li></ol>

+ + פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול לוציפראז מבוסס להערכת צמיחה טוקסופלזמה תאיים ולהעריך את היעילות עיכוב של תרכובות כימיות נגד גידול טפיל. בהשוואה אסטרטגיות קיימות זמין למדידת צמיחה תאיים טוקסופלזמה , שיטה זו מציגה רגישות גבוהה וספציפיות. בעת ניטור הצמיחה טפיל, שינון מבוים ברור 96 היט?...

טוקסופלזמה gondii הוא טפיל מצליח מאוד מאוד מחייב, אשר מדביק כ שליש מהאוכלוסייה האנושית. שיעור התמסורת הגבוה ברובו נובע מנתיבי שידור מגוונים, כולל צריכת בשר מבושל, חשיפה למאגרים ממיונקים ושידור מולד במהלך הלידה. T. gondii בעיקר גורם לזיהומים אופורטוניסטים שיכולים להוביל לתחלואה חמורה ותמותה באנשים בסכנה1,2,3,4,5,6. האנטיביוטיקה המשמשת כיום לטיפול בטוקסופלזמוזיס חריפה יעילה במיוחד לטיפול בזיהומים מולדים וסמויים ולגרום לתגובות חמורות אצל אנשים מסוימים3,7,8. לכן, יש צורך דחוף לזהות therapeutics הרומן קיים. הבנת ההבדלים בתהליכים תת-תאיים בתוך טוקסופלזמה והמחשב המארח שלה יסייע לזהות יעדי סמים פוטנציאליים. לכן, יעיל ונוח טכניקות מניפולציה הגנום נדרשים ללמוד את התפקידים של גנים בודדים בתוך טוקסופלזמה. בנוסף, הטוקסופלזמה שייך ל-מערכה apicomplexa, הכולל מספר פתוגנים אנושיים משמעותיים, כגון פלסטלינה והצפנה . מכאן, טוקסופלזמה יכול לשמש כאורגניזם מודל לעזור ללמוד ביולוגיה בסיסית של טפילים apicomplexan אחרים.
כדי לזהות אנטיביוטיקה הרומן נגד פתוגנים חיידקים, הקרנת תפוקה גבוהה של ספרייה של תרכובות כימיות מבוצעת בתחילה כדי לקבוע את יעילותה בדיכוי של גידול חיידקים. עד כה, מספר הצמיחה מבוססי מיקרופלייט מבוסס כבר פותחו למדידת צמיחה תאיים של T. gondii (כלומר, רדיואקטיבי 3H-uracil התאגדות המבוססת על כימות9, מבוססי אליסה מבוסס על זיהוי טפיל באמצעות T. gondii-נוגדנים ספציפיים10,11, כתבת חלבון מדידה באמצעות β-גלטוסידאז או yfp-הביע טוקסופלזמה זנים12,13, ו שפותחה לאחרונה תוכן גבוה הדמיה ה14
לכל האסטרטגיות הבודדות יש יתרונות ייחודיים; עם זאת, מגבלות מסוימות גם מגבילות את יישומותיהם. לדוגמה, מכיוון ש- טוקסופלזמה יכול לשכפל רק בתוך תאי בעלי חיים מסוימים, התאמה אוטומטית ומחייבת לא ספציפית של נוגדנים אנטי-T. gondii כדי לארח תאים גורמים להפרעות במידות המבוססות על קרינה פלואורסצנטית. יתר על כן, השימוש באיזוטופים רדיואקטיביים דורש תאימות בטיחות מיוחדת ובעיות בטיחות פוטנציאליות. חלק מהאספניות הללו מתאימות יותר להערכת הצמיחה בנקודת זמן יחידה ולא בניטור רציף של הצמיחה.
מוצג כאן הוא פרוטוקול לוציפראז מבוסס על כימות הצמיחה טוקסופלזמה תאיים. במחקר הקודם, הננו גן לוציפראז היה משוכפל תחת טוקסופלזמה טובולין יזם, ואת זה ביטוי לוציפראז לבנות היה מנוכר לתוך פראי סוג (RHΔku80Δhxg המתח) טפילים כדי ליצור RHΔKu80Δhxg::nluc זן (המכונה RHΔku80::nluc להלן)15. זן זה שימש את זן הורים לקביעת צמיחה תאיים ומחיקה גנטית במחקר זה. שימוש RHΔku80::nluc זן, הגידול הטפיל בפיברותקיעות העורלה האנושית (hffs) היה מנוטר מעל 96 h תקופה לאחר הדלקת כדי לחשב את זמן ההכפלה של טפיל.
בנוסף, את היעילות עיכוב של LHVS נגד הצמיחה טפיל יכול להיקבע על ידי התוויית טוקסופלזמה שיעורי גדילה נגד ריכוזי lhvs סדרתי כדי לזהות את הערך IC50 . הספרות הקודמות דיווחה כי tgcpl הוא מטרה מרכזית של lhvs בטפילים, כי הטיפול עם lhvs מקטין את ההתפתחות של זיהומים טוקסופלזמה כרוניים חריפה16,17,18,19. בנוסף, RHΔku80:: nluc שימש זן הורים לשינוי הגנום כדי ליצור מאמץ לקוי של tgcpl(RHΔku80Δcpl::nluc), ואת העיכוב של lhvs נמדד נגד מוטציה זו. על ידי התבוננות upshift של IC50 ערכים עבור LHVS ב tgcplלקויה טפילים לעומת זן WT, זה היה מאומת כי tgcpl הוא ממוקד על ידי lhvs ב vivo.
בפרוטוקול זה, RHΔku80::nluc משמש זן הורים, אשר חסר יעיל בלתי הומוולוגי מסלול להצטרף בסוף (nhej), ובכך להקל כפול מוצלב הומולוגיה התלויים שילוב מחדש (HDR)20,21. בנוסף, האזורים 50 bp הומולוגיים מקיפים בשני קצותיו של קלטת התנגדות לסמים על ידי ה-PCR. המוצר PCR משמש תבנית תיקון כדי להסיר את מקום הגן כולו באמצעות HDR באמצעות CRISPR-Cas9-מבוססי הגנום כלים לעריכת. ניתן לשלב בקלות את אזורי ההומוולוגי הקצרים האלה לתוך התחל, ולספק אסטרטגיה נוחה לייצור תבנית התיקון. פרוטוקול זה ניתן לשנות כדי לבצע מחיקה גנטית אוניברסלית תיוג גנים אנדוגני.
למשל, בפרסום האחרון שלנו, שלושה גנים הפרוטאז, Tgcpl, tgcpb (טוקסופלזמה צנתור psin B-כמו פרוטאז), ו TgSUB1 (טוקסופלזמה sub sin כמו פרוטאז 1), היו מבחינה גנטית בתוך tgcpl (טוקסופלזמה כלורוקין-התנגדות טרנספורטר)-טפילים לקוי בשיטה זו15. בנוסף, tgamn (הבנה n [tgamn, TGGT1_221310]) היה מתויג באופן שורש15. מעבדת Lourido דיווחו גם באמצעות אזורים הומולוגיים קצרים בטווח של 40-43 bp למבוא של מוטציה באתר מכוון גנים והתיוג הגן אנדודוגני בגנום טוקסופלזמה באמצעות שיטה דומה22. אלה שינויים הגנום מוצלחת מראים כי אזור bp הומולוגי 40-50 מספיק עבור DNA יעיל שילוב מחדש במתח TgKU80-לקוי, אשר מפשט מאוד את מניפולציה הגנום ב טוקסופלזמה gondii.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel extraction kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>T1020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0316S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek Instuments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically competent E. coli cells</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C29871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CloneAmp HiFi PCR premix</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>639298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine h</td>
			<td>Prolume</td>
			<td>301-10 hCTZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRV</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phire Tissue Direct PCR Master Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F170L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid miniprep kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Site-Directed Mutagenesis kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E0554S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneious software for sgRNA design (version: R11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software (8th version)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of chemical inhibitor efficiency against intracellular toxoplasma gondii growth using a luciferase-based growth assay

טוקסופלזמה gondii הוא מעין פתוגן שמשפיע רבות על אוכלוסיית האדם. האנטיביוטיקה הנוכחית המשמשת לטיפול בטוקסופלזמוזיס קלינית מוגבלת. בנוסף, הם מפגינים תופעות לוואי שליליות בקבוצות מסוימות של אנשים. לכן, גילוי של therapeutics הרומן עבור טוקסופלזמוזיס קליני הוא הכרחי. השלב הראשון של פיתוח אנטיביוטי הרומן הוא לזהות תרכובות כימיות מראה יעילות גבוהה בעיכוב של גידול טפיל באמצעות אסטרטגיית הקרנת תפוקה גבוהה. כפתוגן מחייב, טוקסופלזמה יכול רק לשכפל בתוך תאים מארחים, אשר אוסרת על שימוש במידות ספיגה אופטית כאינדיקטור מהיר לצמיחה. המוצג כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור שיטת הצמיחה מבוססי לוציפראז. כדוגמה, שיטה זו משמשת כדי לחשב את זמן ההכפלה של מסוג פראי טוקסופלזמה טפילים ולמדוד את היעילות של מוראואינאוריאה-leucyl-הומוסקסיל-ויניל סולפון פניאיל (lhvs, מתחם המיקוד של ציטוקינים ציסטאין) לגבי עיכוב של הצמיחה האנטיתאיים הטפיל. מתואר גם, הוא מבוסס CRISPR-Cas9 מבוססי הגן הפרוטוקול בטוקסופלזמה באמצעות 50 bp הומולוגי אזורים עבור שילוב מחדש תלויי הומולוגיה (HDR). על ידי כימות efficacies העכבות של LHVS ב פראי-סוג ו Tgcpl (טוקסופלזמה צנתור psin L-כמו פרוטאז)-טפילים לקוי, זה מראה כי lhvs מעכב את הצמיחה פראי סוג טפיל ביעילות רבה יותר מאשר Δcpl צמיחה, הרומז כי TGCPL הוא מטרה כי lhvs נקשר ב טוקסופלזמה. רגישות גבוהה ותפעול קל של שיטת הגדילה הזאת לוציפראז מבוססי להפוך אותו מתאים ניטור טוקסופלזמה התפשטות והערכת יעילות הסמים באופן תפוקה גבוהה.

איור 1 מייצג דוגמה לעקומת גדילה עבור RHΔKu80::nluc זן והחישוב הנגזר עבור זמן ההכפלה שלו. באופן כללי, המנה מבוצעת בשלוש משכפל טכני עבור כל אחד משלושת המשכפלת הביולוגית לחשבון עבור וריאציות של קריאות פעילות לוציפראז. על מנת לחשב את שינוי קיפול מנורמל של ...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay at JoVE.com

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay (Video) | JoVE

מוצג כאן הוא פרוטוקול להעריך את היעילות עכבות של תרכובות כימיות נגד הצמיחה מחוץ למוח טוקסופלזמה gondii באמצעות שיטת לוציפראז מבוססי צמיחה. הטכניקה משמשת כדי לאשר את העיכוב ספציפיות על ידי מחיקה גנטית של הגן היעד המתאים. עיכוב של LHVS נגד TgCPL פרוטאז מוערך כדוגמה.

קביעת יעילות מעכבי כימית נגד הצמיחה טוקסופלזמה Gondii באמצעות שיטת לוציפראז מבוססי צמיחה

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

אסטרטגיות רגישות אלה ניתן להשתמש כדי להעריך את יעילות עיכוב של מעכבים כימיים בשילוב עם מחיקת גנים CRISPR-Cas9 כדי לחקור את מטרות התרופה. במקום להשתמש בהקדשה נקודת קצה, צמיחת טפילים יכולה להיות מנוטרת לאורך זמן כדי לאפשר חישוב של זמן הכפלת טפיל באמצעות חלבון כתב רגיש. בדיקה זו יכולה להיות קנה מידה עד 384 או 1, 536 microplates היטב לבדיקה של תרכובות מרובות או להקרנה של ספריות באופן תפוקה גבוהה.אסטרטגיה זו ניתן לשנות כדי לכמת את הצמיחה של פתוגנים מיקרוביאליים תאיים אחרים ואת התגובות שלהם לתרופה של עניין. כדי לבצע בדיקה לצמיחה Toxoplasma מבוסס לוציפראז, להתחיל על ידי שאיפה בזהירות המדיום מן תרבויות microplate מראש 96 היטב של fibroblasts העורלה האנושית לחסן 150 microliters של השעיית טפיל B לתוך הבארים בפורמט שלוש עמודה וחמש שורה. לאחר אינקובציה של ארבע שעות באינקובטור תרבות התא, בזהירות שאפו את המדיום מכל באר כדי להסיר את הטפילים שאינם פלשו ולמלא את הבארים בכל אחד מלבד השורה הראשונה עם טמפרטורת החדר פנול אדום חינם מדיום.לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון מצע לוציפראז מיקרומולרי 12.5 ב- PBS לכל באר של השורה העליונה והדקירה את המיקרופלאטים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר תות תא מלא. בסוף הדגירה, למדוד את פעילות luciferase על קורא מיקרופלסטיק. כל קריאה מייצגת את המספר הראשוני של טפילים פלשו בארבע שעות לאחר ההדבקה.חזור על הניתוח כל 24 שעות במשך ארבעת הימים הבאים מבלי לשנות את המדיום. כדי לחשב את השינוי המנורמל של צמיחת טפילים, כל קריאה יכולה להיות מחולקת על ידי הקריאה הראשונית בארבע שעות לאחר ההדבקה. יומן 2 של קיפול-שינוי מנורמל של צמיחת טפילים אז יכול להיות התווה נגד כל נקודת זמן נתון פונקציית רגרסיה ליניארית כדי להשיג את השיפוע המייצג את זמן ההכפלה.כדי להעריך את היעילות של עיכוב של תרכובת של עניין על צמיחת Toxoplasma, תרבות סיבי העורלה האנושית ב 96-גם microplates לפחות שבעה ימים לפני חיסון כל באר של תאים עם 150 microliters של טפילים כפי שהוכח במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. במהלך הדגירה, להכין את המתחם של ריבית בשמונה ריכוזים שונים במאגר 12 באר על ידי דילול סדרתי. מדללים את התרכובות במאגר של 12 באר בדילול של 1-3 על ידי צינורות כל תערובת למעלה ולמטה מספר פעמים עם פיפיטר מיליליטר אחד.בארבע שעות לאחר ההדבקה, החלף את המדיום בכל באר מעמודים 2 עד 9 עם 150 microliters של בינוני בתוספת כל דילול של המתחם, משאיר את העמודה הראשונה מלא בינוני רגיל לשמש שליטה שאינה מטופלת. לאחר מכן להחזיר את תרבות התאים לאנקובטור תרבות התא במשך 96 שעות ולמדוד את פעילות luciferase עבור כל באר כדי לקבוע את אחוז עיכוב הצמיחה בתרבויות בכל ריכוז של מתחם. כדי לחשב את פעילות לוציפראז מנורמל כאחוז, לחלק את פעילות luciferase הממוצע עבור כל ריכוז מורכב על ידי פעילות luciferase הממוצע נגזר טפילים שאינם מטופלים.לאחר מכן השתמש בתוכנת גרפים מתאימה כדי להתוות את פעילויות luciferase מנורמל נגד המתחם הבודד כדי לחשב את הריכוז מעכבות חצי מקסימלי עבור כל תרכובת. כדי ליצור מבנה פלסמיד המבטא RNA חד-מדריך ו- Cas9 למחיקת גן מעניין, נווט אל דף המשאבים הגנומיים של Toxoplasma ואחזר את רצף קידוד הגנים כולו כולל האינטרונים והאקסונים יחד עם 1.5 קילו-באז חמישה ושלושה אזורים עיקריים שאינם מיועדים. העתק את רצף TgCPL שאוחזר לתוכנה לניתוח רצף ותייג את חמשת ושלושת האזורים הלא מתורגמים.בדף משאב טוקסופלזמה גנומיקה, לחץ על הורד, קבצי נתונים Current_Release. בתיקיה T.gondii GT1, בחר FASTA. מתקיית הנתונים, הורד את קובץ רצף הגנום של זן Toxoplasma gondii GT1.לאחר מכן צור תיקיה מקומית בשם Toxoplasma Genome בתוכנת ניתוח רצף ה- DNA וייבא את קובץ רצף הגנום של Toxoplasma לתיקיה. בחר כלים, שיבוט ולמצוא אתרי CRISPR והגדר שלושה ראשי Cas9 ראשוני עבור מיקום אתר PAM. בחר RNA עם קו מנחה יחיד המדגים ציון ספציפיות גבוה, בדרך כלל גדול מ- 98%וחסר G לאחר NGG.ה- RNA החד-מדריך שנבחר ממוקם בדרך כלל באתרים הקרובים להתחלה ולעצור קודונים של גן העניין. לאחר מכן השתמש בקדם-מיקס PCR עם ההגדרות כפי שצוין בטבלה כדי לבצע תגובת PCR כדי לשנות את הפלסמיד המתקדם המבטא RNA חד-מדריך שמטרתו הגן TgUPRT. עבור Transfection Toxoplasma, לערבב שני מיקרוגרם של DNA תבנית מתוקנת עם 20 מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי RNA Cas9 מדריך יחיד ומערבבים 400 microliters של resuspension טפיל, DNA, וחמישה microliters של 200 מילימולאר ATP 500 מילימולרית מופחת גלוטתיון בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.הוסף חיץ ציטומיקס כדי להביא את הנפח הכולל עד 500 microliters לפי הצורך ולהעביר את תערובת DNA טפיל לפער של ארבעה מילימטר עם קולט אלקטרופורציה. ואז אלקטרופולאט הטפילים בשני קילו-וולט ו-50 אוהם של התנגדות. כדי לשכפל טפילי נוקאאוט, בצע תחילה דילול דו-שלבי של הטפילים כדי להשיג 10 טפילים למיליליטר של מדיום D10 בתוספת הריכוז האנטיביוטי המתאים.לאחר מכן, מעבירים 150 מיקרוליטרים של הטפילים המטוהרים המתווסכלים מחדש לכל באר של מיקרופלסטיק 96 בארות עם פיברובלסטים מעורלה ודגירה של המיקרופלסטיק ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שבעה ימים. בסוף הדגירה, לזהות את בארות המכילות לוחית אחת ולהעביר 75 microliters של toxoplasma נגוע טוקסופלזמה פיברובלסטים אנושיים מכל באר של תרבות מיקרופלסטיק 96 היטב לתוך צינורות בודדים 1.5 מיליליטר. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה resuspend כדורי ב 10.25 microliters של מאגר תמוגה המכיל מאגר דילול תוסף שחרור DNA.לאחר מכן להדגיר את הדגימות במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר ושתי דקות ב 98 מעלות צלזיוס לפני ביצוע PCR כדי לבדוק את השילוב של קלטת ההתנגדות לסמים ואובדן הגן של עניין. יעילות העיכוב של LHVS וסוג פראי בזני CPL דלתא ניתן לקבוע על ידי התוויית פעילות luciferase שלהם נגד ריכוזי מעכבים שונים. לאחר PCR, הפלסמיד שעבר מוטציה הוא ליניארי וטעון לתוך ג'ל 1%agarose לאימות הגברה מוצלחת.לאחר מיצוי ג'ל וטרנספורמציה E.coli, שיבוטים המכילים את הפלסמידים הצפויים ניתן לסנן על ידי הגבלת עיכול אנדונוקלאז ברצף DNA. לאחר הגברה תבנית תיקון, אלקטרופורזה ג'ל agarose ניתן להשתמש כדי לאמת את הגודל הנכון של מוצר PCR. בדרך כלל, שבעה עד שמונה שיבוטים נבחרים להקרנה הראשונית כדי לבדוק את מחיקת רצף הקידוד של גן העניין, ואחריו זיהוי של חמש ושלוש הזרועות העיקריות כדי לעזור להפחית את המספר הכולל של שיבוטים להיות מוקרן.אימות נוסף יכול להסתיים על ידי immunoblotting אם כל נוגדן מזהה את חלבון היעד זמין. לפני קבלת מדידות פעילות לוציפראז, microplate ברור עם זיהום מדומה צריך להיבדק תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כי הטפילים לא באופן מלא lyse התאים המארחים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient (Video) | JoVE

קבלת מטוהרים Toxoplasma gondii שביצים ידי Gradient כלוריד רציפה וצזיום

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions (Video) | JoVE

Toxoplasma וול gondii ציסטה כינונה ב הופעל מח עצם הנגזרות המקרופאגים והגבלות Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT (Video) | JoVE

עכברים Transnuclear עם מוגדרים מראש תא קולטן T ספציפיות נגד Toxoplasma gondii לקבל ע&quot;י SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants (Video) | JoVE

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms (Video) | JoVE

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line (Video) | JoVE

Assay הצלה וטרנספורמציה טפילה להקרנת Antileishmanial נגד תאי<em&gt; ישמניה donovani</em&gt; Amastigotes בקו THP1 אדם חריף Monocytic וקמיה של תאים

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source (Video) | JoVE

צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetic Manipulation in ÃŽâ€ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii (Video) | JoVE

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-ÃŽÂ³-Dependent Cell Autonomous Immunity (Video) | JoVE

קדימה גנטיקה מסכי שימוש המקרופאגים לזיהוי<em&gt; Toxoplasma gondii</emחסינות אוטונומית נייד להתנגדות לIFN-γ-Dependent&gt; גנים חשובים

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses (Video) | JoVE

Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...