Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidies HD043680, MH106392, DA013137 en NS100624.

Alle dierprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Universiteit van South Carolina (federaal betrouwbaarheidsnummer: D16-00028).
1. Bereiding van DiI/Tungsten kraalbuizen
<ol><li>Los 100 mg polyvinylpyrrolidone (PVP) op met 10 mL ddH2O. Vortex de PVP-oplossing licht.</li>
	<li>Vul de slang met de PVP-oplossing (zie Materiaaltafel)en laat deze 20 min staan. Vervolgens, verdrijven de PVP-oplossing door de andere kant ...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

In dit protocol beschrijven we een veelzijdige etiketteringstechniek voor neuronen uit zowel rattenhersenen als in vitro gekweekte neuronen. Verder rapporteren we de methodologie voor het gebruik van neuronale reconstructie software en neuronale reconstructie kwantitatieve analyse software om neuronale morfologie en dendritische stekels te beoordelen. De beoordeling van neuronale morfologie en dendritische stekels biedt een kans om veranderingen in dendritische vertakkingscomplexiteit, neuronale arbor complexiteit, dendr...

In 2000, Gan et al. beschreven een snelle etikettering techniek voor individuele neuronen en glia in het zenuwstelsel dat verschillende lipofiele kleurstoffen gecombineerd, waardoor voor de gelijktijdige etikettering van vele hersencellen met verschillende kleuren1,2. Meer recent, een ballistische etikettering techniek werd beschreven door Seabold et al.3 dat fluorescerende kleurstoffen (Dil) geïntroduceerd in de neuronen van de hersenen plakjes. Een veelzijdige kleuring techniek, ballistische etikettering wordt gewaardeerd om zijn vermogen om te worden gebruikt in meerdere diersoorten en over een breed scala van leeftijden. Bovendien kan het worden gecombineerd met immunokleuring om subpopulaties van hersencellen te identificeren3. In vergelijking met traditionele technieken (bijvoorbeeld Golgi-Cox zilverimpregnatie, micro-injectie)4biedt ballistische etikettering een mogelijkheid om morfologische kenmerken duidelijker te onderscheiden, waaronder dendritische stekels, een functie die van cruciaal belang is voor het tekenen van conclusies over neuronale complexiteit en synaptische connectiviteit5.
Excitatory piramidale neuronen worden gekenmerkt door een enkele, grote apicale dendriet, meerdere kortere basale dendrieten, en duizenden dendritische stekels6. Piramidale neuronen worden gevonden in meerdere hersengebieden in verband met hogere orde cognitieve verwerking, met inbegrip van de prefrontale cortex (PFC) en hippocampus. In de PFC worden piramidale neuronen waargenomen in lagen II/III en laag V, waarbij elk unieke morfologie vertoont. In het bijzonder, piramidale neuronen in laag II/III van de PFC hebben een kortere apicale dendriet en minder vertakking dan piramidale neuronen in laag V6. Binnen de hippocampus bevinden zich piramidale neuronen in zowel de CA1- als de CA3-regio's, waarbij elk verschillende morfologieën wordt weergegeven. In het bijzonder vertonen piramidale neuronen in de CA1-regio een meer onderscheidend apicale dendriet, waarbij vertakkingen verder van het soma plaatsvinden, ten opzichte van de CA3-regio6.
Dendritische stekels op piramidale neuronen in zowel de PFC en hippocampus zijn de primaire plaats van excitatory synapsen7. Morfologische kenmerken van dendritische stekels, die klassiek zijn gekarakteriseerd in drie primaire categorieën (d.w.z. dun, stomp, of paddestoel8),zijn gerelateerd aan de grootte van de excitatory synaps9. Dunne stekels, gekenmerkt door een lange, dunne nek, kleine bolvormige hoofd, en kleinere postsynaptische dichtheden, zijn meer onstabiel en ontwikkelen zwakkere verbindingen. Echter, paddestoel stekels, die een grotere dendritische wervelkolom hoofd hebben, worden erkend voor het vormen van sterkere synaptische verbindingen, een effect als gevolg van hun grotere omvang. In scherp contrast, stompe stekels zijn verstoken van een wervelkolom nek, vertonen een ongeveer gelijke hoofd en nek volume verhouding8. Binnen de hippocampus kunnen ook vertakte stekels worden waargenomen, waarbij de wervelkolom meerdere hoofden heeft die uit dezelfde dendritische wervelkolom nek10komen. Daarom kunnen de morfologische veranderingen van dendritische stekels de functionaliteit en de structurele capaciteit weerspiegelen. Bovendien hebben studies aangetoond dat de grootte en vorm van dendritische stekels betrekking heeft op hun structurele plasticiteit, wat leidt tot het idee dat kleine stekels betrokken zijn bij leren en aandacht, terwijl grotere, stabielere stekels, betrokken zijn bij langetermijnprocessen, waaronder geheugen11. Bovendien kan de verdeling van dendritische stekels langs het dendriet worden geassocieerd met synaptische connectiviteit5,12.
Zo heeft het huidige methodologische document drie doelen: 1) Presenteer ons protocol voor ballistische etikettering, dat is gebruikt met een slagingspercentage (d.w.z. neuronen die voldoen aan selectiecriteria en geschikt zijn voor analyse) van 83,3%5,12,13 en over meerdere hersengebieden (d.w.z. PFC, nucleus accumbens, hippocampus); 2) De generaliseerbaarheid van de techniek en de toepassing ervan op in vitro gekweekte neuronen aantonen; 3) Detail de methodologie gebruikt in neuronale reconstructie software en de conclusies die kunnen worden getrokken uit dergelijke gegevens.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

Er is gemeld dat de grootte en vorm van dendritische stekels is gerelateerd aan hun structurele plasticiteit. Om de morfologische structuur van piramidale neuronen en dendritische stekels te identificeren, kan een ballistische etiketteringstechniek worden gebruikt. In het huidige protocol worden piramidale neuronen gelabeld met DilC18(3) kleurstof en geanalyseerd met behulp van neuronale reconstructie software om neuronale morfologie en dendritische stekels te beoordelen. Om neuronale structuur te onderzoeken, worden dendritische vertakkingsanalyse en Sholl-analyse uitgevoerd, waardoor onderzoekers conclusies kunnen trekken over respectievelijk dendritische vertakkingcomplexiteit en neuronale arbor-complexiteit. De evaluatie van dendritische stekels wordt uitgevoerd met behulp van een automatische ondersteunde classificatie algoritme integraal onderdeel van de reconstructie software, die stekels ingedeeld in vier categorieën (dat wil zeggen, dun, paddestoel, stompe, filopodia). Bovendien worden ook drie extra parameters (d.w.z. lengte, hoofddiameter en volume) gekozen om veranderingen in de dendritische wervelkolommorfologie te beoordelen. Om het potentieel van brede toepassing van de ballistische etiketteringstechniek te valideren, werden piramidale neuronen uit in vitro celkweek met succes gelabeld. Over het algemeen is de ballistische etiketteringsmethode uniek en nuttig voor het visualiseren van neuronen in verschillende hersengebieden bij ratten, die in combinatie met geavanceerde reconstructiesoftware onderzoekers in staat stelt om de mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen te verduidelijken neurocognitieve disfunctie.

In figuur 2Awerden de typische piramidale neuronen in het hippocampal gebied in de rattenhersendelen geïdentificeerd door ballistische etiketteringstechnologie, gekenmerkt door één grote apicale dendrieten en een aantal kleinere basale dendrieten rond het soma. Figuur 2B toont het neuron in de neuronale reconstructie kwantitatieve analyse software na de soma werd gedetecteerd, dendritische takken werden getraceerd, en stekels werden gedetecteerd. Vervolgens w...

Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

We presenteren een protocol voor het etiketteren en analyseren van piramidale neuronen, wat essentieel is voor het evalueren van potentiële morfologische veranderingen in neuronen en dendritische stekels die ten grondslag kunnen liggen aan neurochemische en gedragsafwijkingen.

Ballistische etikettering van piramidale neuronen in hersenschijfjes en in de primaire celcultuur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Dit protocol maakt het mogelijk om mogelijke morfologische veranderingen in neuronen en dendritische stekels te evalueren die neurochemische en gedragsafwijkingen kunnen onderstrepen. Het is uniek en nuttig voor het visualiseren van neuronen in verschillende hersengebieden bij ratten, die in combinatie met geavanceerde reconstructie software onderzoekers in staat stelt om de mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen aan neurocognitieve disfunctie te verduidelijken. Begin met het voorbereiden van PVP-oplossing volgens manuscriptaanwijzingen.Vul de slang met PVP en laat het gedurende 20 minuten. En verdrijving het door het andere uiteinde met een 10 milliliter spuit. Combineer 170 milligram wolfraam microcarrier kralen met 250 microliter van methyleenchloride.Dan grondig vortex de schorsing. Voeg vervolgens 6 milligram lipofiele DilC18(3)kleurstof toe aan 300 microliter methyleenchloride en vortex. Pipet 250 microliters van de wolfraam kraal schorsing op een glazen glijbaan.Wacht tot de ophanging aan de lucht droog en voeg 300 microliter van de kleurstof oplossing. Eenmaal gedroogd, gebruik dan een scheermes om het mengsel te splitsen in twee 1,5 milliliter centrifuge buizen en vul de buizen met water. Sonicate het mengsel in een waterbad tot homogeen.Zorg ervoor dat de sonicator tip direct op de buizen ligt. Combineer de twee mengsels in een 15 milliliter conische buis. En sonicate voor nog eens drie minuten, ervoor te zorgen dat er geen grote bosjes verf gecoate kralen blijven.Na sonicatie, trek het mengsel in de PVP gecoate slang met een 10 milliliter spuit. En voer de slang in het voorbereidingsstation. Draai de slang gedurende een minuut.Verwijder voorzichtig al het water met behulp van een spuit. Zet het stikstofgas aan en pas de stikstofstroom aan op ongeveer 0,5 liter per minuut. Draai de slang in het bereidingsstation en droog deze 30 minuten met stikstof.Haal de slang van het station en snijd deze in 13 millimeter segmenten met een buizensnijder. Zorg ervoor dat de rat niet reageert op schadelijke stimuli en reflexen afwezig zijn. Zet het dan vast in de supine positie.Maak een incisie langs de thoracale middellijn. Scheid het middenrif en open de kist met een schaar. Steek vervolgens een 20-meterige naald van 25 millimeter in de linker ventrikel.Snijd onmiddellijk het rechteratrium met een schaar en doorsneed 15 milliliter 100 millimolar PBS met een stroomsnelheid van 5 millimeter per minuut. Dan doorsnede 100 milliliter van 4%PFA gebufferd in PBS. Na perfusie, verwijder de hele rat hersenen.En postfix het met 4% PFA gedurende 10 minuten. Gebruik een rat hersenen matrix te snijden 500 micrometer dikke coronale sectie. Maak een vuist snijden en houd het mes op zijn plaats.Maak vervolgens een tweede snede met een tweede mes en verwijder verticaal het eerste mes, waardoor het weefsel op het bladoppervlak blijft. Plaats de hersenen plakjes in de 24-put plaat met 1 milliliter PBS in elke put. En herhaal het proces totdat alle plakjes zijn gesneden.Verwijder PBS van elke gerichte goed. Laad het kraakbeen met een stuk Dil/wolfraambuizen en plaats het in de applicator. Plaats een stukje filterpapier tussen de twee mesh-schermen.En sluit de applicator aan op de heliumslang. Pas vervolgens de uitgangsdruk van helium aan tot 90 pond per vierkante inch. Plaats de applicator verticaal op het midden van de beoogde put 1,5 centimeter tussen het monster en het mesh-scherm.Vuur dan de Dil/wolfraambuizen af. Laad het kraakbeen met de volgende slang en continu vuur de kralen uit de slang op de resterende plakjes. Vul de 24-well plaat met 100 millimolar PBS.En was de plakjes drie keer met 500 microliter verse PBS. Zorg ervoor dat de plakjes niet omdraaien tijdens het wassen. Voeg 500 microliter verse PBS toe aan de plakjes.En broed ze drie uur lang uit op vier graden Celsius in het donker. Gebruik na de incubatie een fijne borstel om de hersenschijfjes over te zetten op glazen dia's. En voeg onmiddellijk een milliliter antifade montage medium aan elke sectie.Plaats een 22 bij 15 millimeter coverslip over de secties en droog de dia's in het donker. Zet het confocale microscoopsysteem aan en schakel over naar een 60X-doelstelling. Pas de beeldvormingsinstellingen aan op basis van de handschriftaanwijzing.En het verkrijgen van Z-stack beelden voor de beoogde neuron type op basis van hersenen regio grenzen en morfologische kenmerken van neuronen. Isoleer primaire corticale neuron van F344/N ratten op postnatale dag een en cultuur ze in een 35 millimeter glazen bodem schotel voor een week. Verfrissende helft van het medium op de derde dag na isolatie.Was de schotel twee maal met 1 milliliter 100 millimolar PBS. En bevestig de cellen met 4%PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Ballistically etiket de cellen zoals eerder beschreven.En was ze nog drie keer met 1 milliliter PBS. Voeg 500 microliter PBS toe aan de cellen en broed ze drie uur lang uit bij vier graden Celsius in het donker. Voeg vervolgens 200 microliter antifade montagemedium toe.En het verkrijgen van Z-stack beelden voor elk gericht neuron. Typische piramidale neuronen in hippocampal regio in de rat hersensecties werden geïdentificeerd met ballistische etikettering technologie gekenmerkt door een grote apicale dendriet en een aantal kleinere basale dendrieten rond de soma. Neuronale reconstructie kwantitatieve analyse software werd gebruikt om dendritische takken te traceren en stekels te detecteren.Vervolgens werd de software gebruikt om de dendritische vertakkingscomplexiteit en neuronale arbor complexiteit te beoordelen. Morfologische veranderingen in dendritische stekels werden beoordeeld met behulp van lengte, volume en hoofddiameter. Vervolgens werden stekels ingedeeld in dunne, stompe, en paddestoel stekels.En de relatieve frequentie van het aantal stekels tussen elke straal werd onderzocht. Verder werd de ballistische etiketteringstechniek gevalideerd op een primair piramidale neuron in celcultuur. Piramidale neuronen werden geïdentificeerd op basis van de driehoekvorm van de soma en grote apicale dendriet.Vervolgens werd neuronale reconstructie software gebruikt om de verdeling van dunne dendritische stekels en dendritische wervelkolom lengte te analyseren. Bij een poging dit protocol, is het belangrijk om te voorkomen dat grote klonten of clusters van ballistische kleurstof gecoate wolfraam kralen beginnen voorbereiding. Klontjes zou niet toestaan dat individuele neuronen worden onderscheiden.In combinatie met neuronale reconstructie software deze methode stelt ons in staat om neuronale en dendritische wervelkolom morfologie te onderzoeken in hippocampal piramidale neuronen. Neuronale reconstructie software gebruik maken van een algoritme om automatisch ondersteunde classificatie van dendritische stekels te bieden. De kwantificering van meerdere neuronale parameters biedt een kans om het mechanisme dat ten grondslag ligt aan neuronale cognitieve disfunctie beter te begrijpen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Labeling van neuronen van de knaagdieren en niet-menselijke primaten Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescerende Labeling Maakt Gerichte Extracellulair Single-unit Opnemen van geïdentificeerde neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Voltage-gevoelige kleurstof Opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primaire Cultuur van de Muis dopaminerge neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...