Name: substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

وقد تم دعم G.H. من قبل زمالة الدراسات العليا من Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. وقد تم دعمها من قبل زمالة الدراسات العليا من معهد الكانتيرولوجيا دي لورين (ICL)، في حين تم دعم Q.T. من قبل منحة عامة أشرفت عليها وكالة البحوث الوطنية الفرنسية (ANR) كجزء من "Investissements d'Avenir" برنامج FIGHT-HF (المرجع: ANR-15-RHU4570004). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل CNRS وجامعة لورين (UMR 7365).

ملاحظة: الدروس سهلة الاستخدام متوفرة على موقع أيسي http://icy.bioimageanalysis.org.
1. تحميل الجليدية وبروتوكول محلل تحت البنية
<ol><li>تحميل الجليدية من موقع على شبكة الإنترنت الجليدية (http://icy.bioimageanalysis.org/download) وتحميل بروتوكول محلل الهيكل الفرعي</...

<ol>
	<li>M&#246;ckl, L., Lamb, D. C., Br&#228;uchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolved+fluorescence+microscopy:+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig,+Stefan+Hell,+and+William+E.+Moerner.">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li><li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imagining+the+future+of+bioimage+analysis.">Imagining the future of bioimage analysis.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).</li><li>Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., M&#252;nzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+free+software+tools+for+image+analysis+of+fluorescence+cell+micrographs.">Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs.</a> Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+image+analysis+using+NIH+Image/ImageJ.">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).</li><li>Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+on+image+segmentation+techniques.">Survey on image segmentation techniques.</a> Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).</li><li>. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy">https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy</a> (2018)</li><li>. NIS-Elements Imaging Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014)</li><li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+segmentation.">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress.">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>D'Autr&#233;aux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+as+signalling+molecules:+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews.">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+Cell+Senescence,+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases.">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53.">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li><li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2&#946;+(SFRS10)+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells.">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2&#946; (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene.">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+Structure+and+Function.">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation.">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation.">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+3.0:+Next-generation+image+processing+for+biology.">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).</li></ol>

عدد متزايد من البرمجيات الحرة المتاحة لتحليل الصور الخلايا المفلورة. يجب على المستخدمين اختيار البرامج المناسبة بشكل صحيح وفقا لتعقيد إشكالية ، إلى معرفتهم في معالجة الصور ، والوقت الذي يريدون قضاءه في تحليلهم. الجليدية، CellProfiler، أو ImageJ / فيجي هي أدوات قوية تجمع بين قابلية الاستخدام والوظ...

المجهر الخفيف، وبشكل خاص، المجهر الفلوري هي تقنيات قوية ومتعددة الاستخدامات تستخدم عادة في العلوم البيولوجية. أنها تعطي الوصول إلى التعريب الدقيق للجزيئات الحيوية المختلفة مثل البروتينات أو الحمض النووي الريبي من خلال وضع العلامات الفلورية المحددة. وقد تميز العقد الماضي من التقدم السريع في تقنيات المجهر والتصوير كما يتضح من جائزة نوبل في الكيمياء 2014 منح اريك Betzig, ستيفان W. الجحيم ووليام E. Moerner لتطوير المجهر الفلورانس فائقة حل (SRFM)1. تتجاوز SFRM حد الانعراج من المجهر البصري التقليدي لإدخاله في نانوديمينسين. كما أن تحسين تقنيات مثل التصوير الحي أو نهج الفرز عالي الإنتاجية يزيد من كمية البيانات التي يجب معالجتها لكل تجربة وتعقيدها. في معظم الأحيان، يواجه الباحثون مجموعات سكانية غير متجانسة عالية من الخلايا ويريدون تحليل الأنماط الظاهرية على مستوى الخلية الواحدة.
في البداية، تم إجراء تحليلات مثل عد البؤر بالعين، وهو ما يفضله بعض الباحثين لأنه يوفر تحكمًا بصريًا كاملًا في عملية العد. ومع ذلك ، فإن التحليل اليدوي لهذه البيانات يستغرق وقتا طويلا للغاية ، ويؤدي إلى التباين بين المراقبين ، ولا يتيح الوصول إلى ميزات أكثر تعقيدا بحيث أصبحت النهج بمساعدة الكمبيوتر تستخدم على نطاق واسع ولا يمكن تجنبها تقريبا2. أساليب المعلوماتية الحيوية تزيد بشكل كبير من كفاءة تحليل البيانات وخالية من الذاتية المشغل لا يمكن تجنبها والتحيز المحتمل لتحليل العد اليدوي. أدى الطلب المتزايد في هذا المجال وتحسين قوة الكمبيوتر إلى تطوير عدد كبير من منصات تحليل الصور. وبعضها متاح مجاناً ويمنح إمكانية الوصول إلى أدوات مختلفة لإجراء التحليل باستخدام أجهزة الكمبيوتر الشخصية. وقد تم مؤخرا وضع تصنيف لأدوات الوصول المفتوح3 ويعرض Icy4 كبرمجيات قوية تجمع بين سهولة الاستخدام والوظائف. وعلاوة على ذلك ، فإن الجليدية لديها ميزة التواصل مع ImageJ.
بالنسبة للمستخدمين الذين لا يتمتعون بخبرة في تحليل الصور، فإن العقبات الرئيسية هي اختيار الأداة المناسبة وفقاً للمحددات الإشكالية والمتناغمة بشكل صحيح التي غالباً ما تكون غير مفهومة جيداً. وعلاوة على ذلك، غالباً ما تكون أوقات الإعداد طويلة. يقترح Icy واجهة نقطة وانقر سهلة الاستخدام تسمى "بروتوكولات" لتطوير سير العمل من خلال الجمع بين بعض الإضافات الموجودة ضمن مجموعة شاملة4. تصميم وحدات مرنة وواجهة نقطة وانقر جعل إعداد تحليل ممكن بالنسبة لغير المبرمجين. هنا نقدم سير العمل يسمى محلل الهيكل الفرعي، وضعت في واجهة الجليدية ، وظيفتها هي تحليل الإشارات الفلورية في مقصورات خلوية محددة وقياس ميزات مختلفة مثل السطوع ، وعدد بؤر ، وحجم بؤر ، والتوزيع المكاني. هذا سير العمل يعالج العديد من القضايا مثل الكم من نقل إشارة، وتحليل الخلايا المُصابة التي تعبر عن مراسل الفلورسنت، أو تحليل بؤر من الهياكل الفرعية الخلوية المختلفة في الخلايا الفردية. وهو يسمح بمعالجة صور متعددة في وقت واحد، ويتم تصدير نتائج المخرجات إلى ورقة عمل محددة بعلامات الجدولة يمكن فتحها في برامج جداول البيانات شائعة الاستخدام.
يتم عرض خط أنابيب محلل البنية الفرعية في الشكل 1. أولاً، يتم معالجة كافة الصور الموجودة في مجلد محدد مسبقًا لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. هذه الخطوة يزيد من كفاءة الخطوات التالية ويقلل من وقت التشغيل. ثم يتم تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) ، المقابلة لمناطق الصورة التي يجب اكتشاف إشارة الفلورسنت فيها ، وتقسيمها. وأخيراً، يتم تحليل إشارة الفلورسنت، ويتم تصدير النتائج إلى ورقة عمل محددة بعلامات الجدولة.
تجزئة الكائنات (الكشف عن الحدود) هي الخطوة الأكثر صعوبة في تحليل الصور، والكفاءة يحدد دقة القياسات الخلية الناتجة. الكائنات الأولى التي تم تحديدها في صورة (تسمى الكائنات الأولية) غالبا ما تكون نوية من الصور الملطخة بالحمض النووي (DAPI أو Hoechst تلطيخ)، على الرغم من أن الكائنات الأولية يمكن أن تكون أيضا خلايا كاملة، الخرز، البقع، الأورام، أو أيا كانت الكائنات الملطخة. في معظم الصور البيولوجية، الخلايا أو النوى لمس بعضها البعض أو التداخل مما تسبب في الخوارزميات البسيطة والسريعة للفشل. حتى الآن، لا يمكن لأي خوارزمية عالمية تنفيذ تجزئة مثالية لجميع الكائنات، ويرجع ذلك في الغالب إلى خصائصها (الحجم أو الشكل أو الملمس) تعدل كفاءة تجزئة5. تعتمد أدوات التقسيم التي يتم توزيعها عادةً مع برامج الفحص المجهري (مثل برنامج التصوير المتحول بواسطة الأجهزة الجزيئية6، أو برنامج أبحاث تقدمات NIS-Elements بواسطة Nikon7)بشكل عام على التقنيات القياسية مثل مطابقة الارتباط أو العتبة أو العمليات المورفولوجية. وعلى الرغم من كفاءة هذه الأساليب العامة في النظم الأساسية، فإن هذه الأساليب التي تتسم بالإفراط في التعميم تفرض بسرعة قيوداً عند استخدامها في سياقات أكثر صعوبة وتحديداً. في الواقع، تجزئة حساسة للغاية لالمعلمات التجريبية مثل نوع الخلية، وكثافة الخلية، أو المؤشرات الحيوية، وكثيراً ما يتطلب التعديل المتكرر لمجموعة بيانات كبيرة. يدمج سير عمل محلل الهيكل الفرعي كلاً من الخوارزميات البسيطة والأكثر تعقيدًا لاقتراح بدائل مختلفة تتكيف مع تعقيد الصورة واحتياجات المستخدم. ومن الجدير بالذكر أنه يقترح خوارزمية مستجمعات المياه القائمة على العلامة8 للكائنات متفاوتة المسافات العالية. تعتمد كفاءة أسلوب التجزئة هذا على تحديد علامات فردية على كل كائن. يتم اختيار هذه العلامات يدويا معظم الوقت للحصول على المعلمات الصحيحة لتقسيم كامل، والتي تستغرق وقتا طويلا للغاية عندما يواجه المستخدمون عددا كبيرا من الكائنات. محلل البنية الفرعية يقترح الكشف التلقائي لهذه العلامات، وتوفير عملية تجزئة عالية الكفاءة. تجزئة هو ، في معظم الأحيان ، والحد من خطوة تحليل الصور ويمكن أن تعديل بشكل كبير في وقت المعالجة اعتمادا على دقة الصورة ، وعدد الكائنات في الصورة الواحدة ، ومستوى التجمع من الكائنات. خطوط الأنابيب النموذجية تتطلب بضع ثوان إلى 5 دقائق لكل صورة على كمبيوتر سطح المكتب القياسية. تحليل الصور أكثر تعقيدا يمكن أن تتطلب جهاز كمبيوتر أكثر قوة وبعض المعرفة الأساسية في تحليل الصور.
ويتضح من مرونة هذا العمل ووظيفته مع مختلف الأمثلة في النتائج التمثيلية. وتظهر مزايا هذا العمل بشكل ملحوظ من خلال دراسة الهياكل الفرعية النووية في ظل ظروف الإجهاد التأسدي .( نظام التشغيل يتوافق مع اختلال التوازن في الأكسدة الحمراء لصالح المؤكد ويرتبط مع مستويات عالية من أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS). منذ ROS بمثابة جزيئات الإشارة، والتغيرات في تركيزها وتوطين الخلايا الفرعية تؤثر إيجابا أو سلبا على عدد لا يحصى من المسارات والشبكات التي تنظم الوظائف الفسيولوجية، بما في ذلك نقل الإشارة، وآليات الإصلاح، والتعبير الجيني، وموت الخلايا، وانتشار9،,10. وبالتالي فإن نظام التشغيل يشارك بشكل مباشر في مختلف الأمراض (أمراض الأعصاب والقلب والأوعية الدموية والسرطان والسكري، وما إلى ذلك)، ولكن أيضا الشيخوخة الخلوية. لذلك، فك نتائج نظام التشغيل على تنظيم الخلية البشرية ووظيفته يشكل خطوة حاسمة في فهم أدوار نظام التشغيل في بداية وتطور الأمراض البشرية. وقد ثبت أن نظام التشغيل ينظم التعبير الجيني عن طريق تعديل النسخ من خلال عدة عوامل النسخ (P53، Nrf2، FOXO3A)11، ولكن أيضا عن طريق التأثير على تنظيم عدة عمليات المشاركة وما بعد النسخ مثل الربط البديل (AS) من ما قبل RNAs12،13،14. إن الربط البديل للنصوص الأولية للتشفير والنصوص غير البرمجةية هو آلية أساسية تزيد من قدرة الترميز على الجينوم عن طريق إنتاج أشكال متساوية. يتم تنفيذ AS بواسطة مجمع كبير ribonucleoprotein يسمى spliceosome ، يحتوي على ما يقرب من 300 بروتين و 5 U-الغنية RNAs النووية الصغيرة (UsnRNAs)15. يتم التحكم بإحكام في تجميع spliceosome و AS في الخلايا وتحدث بعض خطوات نضج الطمي داخل المقصورات النووية أقل غشاء اسمه الهيئات Cajal. وتتميز هذه الهياكل الفرعية النووية بالطبيعة الديناميكية لهيكلها وتكوينها، والتي تتم بشكل رئيسي من خلال التفاعلات متعددة التكافؤ لمكونات الحمض النووي الريبي والبروتين مع بروتين اللفائف. تحليل الآلاف من الخلايا مع سير عمل محلل الهيكل الفرعي سمح توصيف أبدا وصفها من آثار نظام التشغيل على الهيئات Cajal. في الواقع، تشير البيانات التي تم الحصول عليها إلى أن نظام التشغيل يعدل نووية الأجسام Cajal، مما يحفز إعادة توزيع نووكلوباسميك من بروتين اللفائف إلى العديد من بؤر النووية الصغيرة. مثل هذا التغيير في هيكل الهيئات Cajal قد تؤثر على نضوج spliceosome والمشاركة في تعديل AS بواسطة نظام التشغيل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1105px;" width="1104">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">28908</td>
			<td style="width:472px;">to fix the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11008</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21425</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A34055</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Bovine serum albumin standard (BSA)</td>
			<td style="width:183px;">euromedex</td>
			<td style="width:137px;">04-100-812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D5796-500ml</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040-5ML</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human: HeLa S3 cells</td>
			<td>IGBMC, Strasbourg, France</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>cell line used to perform the experiments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">H1009-100ml</td>
			<td>used as a stressing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Mouse monoclonal anti-coilin</td>
			<td style="width:183px;">abcam</td>
			<td style="width:137px;">ab11822</td>
			<td>Coilin-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>epifluoresecence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">PBS pH 7.4 (10x)</td>
			<td style="width:183px;">gibco</td>
			<td style="width:137px;">70011-036</td>
			<td>to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Rabbit polyclonal anti-53BP1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-16565</td>
			<td>53BP1-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit polyclonal anti-EDC4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4200114</td>
			<td>EDC4-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683</td>
			<td>to permeabilize the cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images

وقد اتسم العقد الماضي باختراقات في تقنيات المجهر المفلورية التي يتضح منها تحسين الدقة المكانية ولكن أيضا في التصوير بالخلايا الحية وتقنيات المجهر عالية الإنتاجية. وأدى ذلك إلى زيادة مستمرة في كمية وتعقيد بيانات المجهر لتجربة واحدة. لأن التحليل اليدوي لبيانات المجهر يستغرق وقتا طويلا جدا، وذاتية، ويحظر التحليل الكمي، أتمتة تحليل الصورة الحيوية أصبح من المحتم تقريبا. لقد قمنا ببناء سير عمل معلوماتي يسمى محلل البنية الفرعية لأتمتة تحليل الإشارة بالكامل في الصور الحيوية من المجهر الفلورسنت. تم تطوير هذا العمل على منصة مفتوحة المصدر سهلة الاستخدام Icy ويتم إكمالها من قبل وظائف من ImageJ. ويشمل المعالجة المسبقة للصور لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وتجزئة الخلايا الفردية (الكشف عن حدود الخلايا) والكشف/القياس الكمي للأجسام الخلوية التي يتم إثراؤها في مقصورات خلايا محددة. وتتمثل الميزة الرئيسية لسير العمل هذا في اقتراح وظائف معقدة للتصوير الحيوي للمستخدمين الذين لا يتمتعون بخبرة في تحليل الصور من خلال واجهة سهلة الاستخدام. وعلاوة على ذلك، فهي وحدات معيارية بدرجة عالية ومتكيفة مع عدة مسائل من توصيف نقل التكنولوجيات النووية/السيتوبلازمية إلى التحليل المقارن لمختلف أجسام الخلايا في مختلف الهياكل الفرعية الخلوية. ويتضح من وظيفة هذا العمل من خلال دراسة الهيئات Cajal (ملفوف) في ظروف الإجهاد التأسدي (OS). تظهر البيانات المستقاة من المجهر المفلور أن سلامتها في الخلايا البشرية تتأثر بعد ساعات قليلة من تحريض نظام التشغيل. ويتميز هذا التأثير بانخفاض نوى اللفائف في الأجسام Cajal مميزة، المرتبطة إعادة توزيع نووكلوباسميك من الملف إلى عدد متزايد من بؤر أصغر. يشير الدور المركزي لللفائف في التبادل بين مكونات CB والنيوكلوباسم المحيطة به إلى أن نظام التشغيل المستحث بإعادة توزيع اللفائف يمكن أن يؤثر على تكوين ووظائف هيئات Cajal.

وقد تم تنفيذ جميع التحليلات الموصوفة على كمبيوتر محمول قياسي (معالج رباعي النواة 64 بت بسرعة 2.80 جيجاهرتز مع ذاكرة وصول عشوائي 16 جيجابايت (RAM)) يعمل مع إصدار 64 بت من Java. ذاكرة الوصول العشوائي هو معلمة هامة للنظر، اعتمادا على كمية ودقة الصور لتحليل. باستخدام نسخة 32 بت من جافا يحد من الذاكرة إلى ح...

Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

نقدم سير العمل المتوفرة مجانا بنيت لاستكشاف سريع وتحليل دقيق للأجسام الخلوية في مقصورات خلية محددة في الصور المجهرية الفلوريس. تم تصميم سير العمل سهل الاستخدام هذا على برنامج المصدر المفتوح Icy ويستخدم أيضًا وظائف ImageJ. خط الأنابيب بأسعار معقولة دون معرفة في تحليل الصور.

محلل البنية الفرعية: سير عمل سهل الاستخدام للاستكشاف السريع والتحليل الدقيق للأجسام الخلوية في صور المجهر الفلوري

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

محلل البنية الفرعية هو سير عمل سهل الاستخدام يقوم بإجراء تحليل تلقائي لمقاييس المجهر متعددة العمليات. وهذا لا يعني صفر طن من البرمجيات المفتوحة المصدر الجليدية وأيضا باستخدام وظائف الجهاز. الأهم من ذلك، هذا العمل هو منتجع بأسعار معقولة إنتاج المعرفة وتحليل الصور.يتم تحميل صور متعددة القنوات داخل سير العمل ومعالجتها مسبقا من أجل تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء وإزالة التصوير أو العيوب. ثم، يعزل تجزئة الصورة المناطق ذات الاهتمام، والمعروفة أيضا باسم ROIs من الخلفية. تتوفر عدة طرق للتجزئة حسب مستوى التجميع وطبيعة الكائنات ذات الأهمية.يتم حفظ الكائنات المجزأة باستخدام واصف معين في مجلد معين. ثم يتم تحليل القوة والإشارات داخل الصفوف وميزات متعددة مثل الموقع والحجم والشكل في القوام الكثافة ولكن يتم تصدير العدد والحجم إلى جدول بيانات يتم إنشاؤه تلقائيًا. تحميل الجليدية من موقع على شبكة الإنترنت الجليدية.ثم تحميل بروتوكول محلل الهيكل الفرعي من مكتبة الجليدية للبروتوكولات. افتح Icy، وانقر على الأدوات الموجودة في قائمة الشريط. انقر على البروتوكولات لفتح واجهة محرر البروتوكولات.انقر فوق تحميل وفتح محلل الهيكل الفرعي البروتوكول. يمكن أن يستغرق تحميل البروتوكول بضع ثوانٍ. يتكون سير العمل من 13 كتلة عامة تعمل كل كتلة كـ خط أنابيب يتكون من عدة مربعات تؤدي مهام فرعية معينة.يتم ترقيم كل كتلة أو مربع، ويكون له رتبة معينة ضمن سير العمل. بالنقر فوق هذا الرقم، قم بتعيين أقرب موضع ممكن إلى الأول إلى الكتلة المحددة. يتم إعادة تنظيم مواقع الكتل الأخرى.بالنقر على أيقونة الزاوية اليسرى العليا، يمكن طي الكتلة. ويمكن أيضا أن تكون الموسعة، وتضييق أو إزالتها. كل خط أنابيب سير العمل هو نشأت الصحيح من قبل شبكة من مربعات متصلة معا من قبل المدخلات والمخرجات الأخرى.لإنشاء اتصال، انقر فوق إخراج والاحتفاظ بها حتى يتعلق المؤشر بأي إدخال. يمكن إزالة الاتصالات بالنقر على علامة الإخراج. إذا لزم الأمر إعادة تسمية الملفات بحيث تسلسل إلى أن يتم دمجها، يكون نفس بادئة الأسماء متبوعة فاصل مميزة.على سبيل المثال، يتم تسمية تسلسلات القنوات الفردية من صورة A الصورة بالأحمر سفلية و الصورة أ سفلية زرقاء وهكذا. في نفس المجلد، قم بإنشاء مجلد جديد لكل قناة لدمج. على سبيل المثال، لدمج القنوات الحمراء والأخضرة والزرقاء، قم بإنشاء ثلاثة مجلدات وتخزين التسلسلات المطابقة داخل هذه المجلدات.استخدم قنوات دمج الكتلة فقط، وإزالة الكتل الأخرى وحفظ البروتوكول كقنوات دمج. الوصول إلى المربعات من أجل تعيين المعلمات. في المربع، رقم القناة x، اختر القناة التي تريد استخراجها.في صور RGB الكلاسيكية ، الصفر أحمر ، واحد أخضر واثنين من اللون الأزرق. في المربع، رقم قناة المجلد x، مائل للخلف اسم المجلد الذي يحتوي على صور للقناة x. في المربع، رقم قناة منفصل x.استخدام الفاصل لاسم الصورة. في المربع، لون خريطة قناة رقم x، تشير مع عدد أي عمود من النموذج لاستخدامها لتصور القناة المقابلة في الجليدية. في المربع، تنسيق الصور المدمجة، اكتب الملحق لحفظ الصور المدمجة.في الزاوية اليسرى العليا من كتلة قنوات الدمج، انقر على الرابط مباشرة إلى يمين المجلد. في مربع الحوار المفتوح الذي يظهر، انقر نقراً مزدوجاً فوق المجلد الذي يحتوي على تسلسلات القناة الأولى التي تم تعريفها في مربع المجلد قناة رقم واحد. ثم انقر على فتح، ركض البروتوكول.يتم حفظ الصور المدمجة في مجلد مدمج في نفس الدليل كمجلدات القنوات الفردية. تجزئة الكائن، هي الخطوة الأكثر تحديا في تحليل الصور. انها كفاءة يحدد دقة القياسات مجموعة الناتجة.لذا ، محلل هيكل يدمج كل من الخوارزميات بسيطة وأكثر تعقيدا لاقتراح بدائل مختلفة تتكيف مع تعقيد الصورة واحتياجات المستخدم. إذا لم تلمس الكائنات بعضها البعض، لا يحتاج المستخدم الآخر إلى تمييز الكائنات متفاوتة المسافات بشكل فردي استخدام تجزئة كتلة A.When الكائنات لا تلمس بعضها البعض، ولكن بعضها على مقربة، واستخدام كتلة B.for الكائنات مع مستوى التجمع العالي وشكل محدب، استخدم كتلة تجزئة الكائنات C.If تقديم مستوى التجمع عالية ولها أشكال غير منتظمة ، استخدم تجزئة الكتلة D.Use تجزئة الكتلة في مجموعات السيتوبلازم لتجزئة السيتوبلازم بشكل فردي باستخدام النوى المجزأة كعلامات. يمكن أن تتم عملية منع التكييف لتجزئة الكائن الأساسي بشكل مستقل بحيث يمكن استخدام عدة كتل في نفس التشغيل لمقارنة كفاءتها لبنية فرعية معينة أو إلى تقسيم أنواع مختلفة من الهياكل الفرعية.لتوضيح تجزئة، تم اختيار تجزئة كتلة B، التي تناسب عدد أكبر من القضايا. لاستخدام هذا بلوق. أولاً، قم بربطه لتحديد المجلد.ثم استدعاء إشارة قناة تعيين قناة الكائن إلى مقطع. على سبيل المثال، لتتوافق مع B، في المربع HK يعني، تعيين المعلمة فئات الكثافة والحد الأدنى التقريبي والحد الأقصى للأحجام في بكسل الكائنات التي سيتم الكشف عنها. بالنسبة لفئات الكثافة، ستصنف قيمة اثنين وحدات البكسل في فئتين، الخلفية والمقدمة.وهكذا يتم تكييفها عندما يكون التباين بين الكائنات والخلفية عالية. إذا كان الكائنات الأمامية لها شدة أصولها أو التباين مع الخلفية منخفضة، قم بزيادة عدد الفئات. في الإطار ملامح نشطة تحسين الكشف عن حدود الكائنات.أثناء العملية، سيتم إنشاء مجلد لحفظ صور الكائنات المجزأة. في نص مربع، اسم هذا المجلد، على سبيل المثال، تجزئة النوى. لتعيين تنسيق لحفظ صور الكائنات المجزأة، قم بتعبئة تنسيق مربع صور الكائنات المجزأة، تشغيل البروتوكول.يتم إنشاء المجلد في المجلد الذي يحتوي على الصور المدمجة. وقد تم تطوير كتل مختلفة للتكيف مع عدد من القوانين والقنوات وحجرات الخلية ليتم تحليلها في الكائنات مجزأة. في المثال التالي، للتحليل، اختر القنوات تحليل الفلوريسينت كتلة P.Two في نفس المقصورة وربطه لتحديد المجلد.يجب أن يكون قد تمت معالجة كتلة التجزئة قبل هذا التحليل تعيين المعلمات علبة الوارد مجلد الصور ROI ، كتابة اسم المجلد الذي يحتوي على صور الكائنات المجزأة مسبوقة مائلة. تنسيق علبة الوارد من الصور من الكائنات المجزأة ، وكتابة تنسيق المستخدمة لحفظ الصور من الكائنات المجزأة. علبة الوارد قتل الحدود لإزالة كلا الكائنين.خلاف ذلك ، في الوقت الحالي ، مطلوب تركيب مجموعة أكثر من التصوير J بالكامل لاستخدام هذه الوظيفة. في مربعات قناة إشارة النقطة، تعيين القناة حيث يجب الكشف عن البقع. في الصور RTP الكلاسيكية، صفر هو الأحمر واحد هو الأخضر واثنين هو الأزرق.في خانات اسم جزيء مترجمة، اكتب اسم جزيء المترجمة في البقع. عدد الحقول للرد يعتمد على عدد من الجزيئات. في أطوال موجية لكل كتلة كاشف، قم بتعيين معلمات الكشف عن البقع لكل قناة على حدة.من أجل معالجة كتل مختلفة في غرفة، والحفاظ على اتصالات من القطع المختارة، مع مجلد تحديد كتلة. تأكد من أن رتبهم تحت المعالجة الجيدة لسير العمل. قبل تشغيل سير العمل، من المستحسن أيضاً إزالة الكتل غير المستخدمة وحفظ البروتوكول الجديد باسم آخر.انقر على تشغيل لبدء سير العمل. عندما يفتح العين تبدو الكتب يظهر. انقر نقرا مزدوجا فوق المجلد الذي يحتوي على الصور ممرضة ثم انقر على فتح، وسير العمل سيتم تشغيل تلقائيا.إذا تم إكمال معالجة الرسالة، سير العمل المنفذة بنجاح سوف تظهر في الزاوية اليمنى السفلى، سيتم وضع علامة على كافة الكتل مع علامة خضراء. إذا لم يكن كتلة وداخل مربع تقديم علامة السهم سوف تشير إلى العناصر الصحيحة. الأهم من ذلك، عدة شاشات تسمح لتصور النتائج المتوسطة أثناء كل تشغيل من أجل التحكم في المعالجة.وستقتصر سرعة سير العمل ومرونته ووظيفته على أمثلة مختلفة. في هذا المثال الأول، نحلل النقل النووي للمحاكاة NF kappa B.After مع تركيزات متزايدة من TNF ألفا. تم تحديد النوى والسيتوبلازم باستخدام كتل تجزئة C و E.تم تحليل NF kappa B تزدهر في إشارة باستخدام كتلة تحليل النقل العالمي. تم تحليل أكثر من 40,000 خلية في 96 صورة في 26 دقيقة. واستخدمت البيانات المتولدة لتحديد منحنى استجابة الجرعة هذا الذي يبين تحريض NF Kappa B نقل النووية بواسطة TNF ألفا.يمكن استخدام سير العمل أيضاً للكشف عن حجم الملف واستخراج معلومات محددة حول ميزاتها. هنا، تم الكشف عن خصائص في الخلايا الفردية عن طريق توطين EDC للبروتين. تم تحديد النوى في السيتوبلازم باستخدام كتل تجزئة A و E.تم تحليل EDC4 باستخدام كتل تحليل الفلوريسنس C.In هذا المثال ، تم الكشف عن علامة EDC4 CYtoplasmic في كل من الخلايا التي تم تحليلها. يتم إعطاء حجم كل جانب كامل بالبكسل في جدول البيانات. في هذا المثال، أخذنا الاستفادة من براعة سير العمل لدراسة الكربوهيدرات حركية أطول من الإجهاد التأكيدي.علامة القوة النووية من اللوين هي المكونات الهيكلية الرئيسية للكربوهيدرات تم تحليل عددهم وحجمهم وفقا لحجم, حالة الإجهاد, تقييمها من قبل فواصل حبلا مزدوجة المترجمة مع 53BP1. تم تحديد Nuclei باستخدام وكيل التجزئة والقوة النووية وإشارات الملف و53BP1 ، تم تحليلها في وقت واحد باستخدام تحليل الفلوريسنس بلوك B.Using بيانات من 2300 خلية فردية ، ونحن أظهرنا زيادة كبيرة في عدد موقع غرينفيلد بعد تحريض الإجهاد المرتبطة بانخفاض في حجمها. هذه البيانات تشير بقوة إلى أن الإجهاد التأسدي يغير قوة نوية الكربوهيدرات في استخدام توزيع نووي في عدد من النووية الأصغر للموقع لتبرير تغيير في التعبير اللوين يمكن أن يغير توطينه وتغيير نوى الهيئات المنحنى.وكان فرط التعبير عن بروتين الانصهار GFP الانصهار exged. تم تحليل ملامح أجسادنا وفقا لGFP ملفين overexpression مستوى. تم تحديد Nuclei باستخدام كتلة التجزئة A.The الإشارات الفلورية من اللفائف ولفائف GFP ، تم تحليلها في وقت واحد باستخدام كتلة تحليل الفلوريسنس B.The وينعكس مستوى فرط التعبير من ملف GFP من خلال كثافة معنى إشارة GFP في النوى الفردية.تظهر البيانات الناتجة عن محلل البنية الفرعية أن ملف GFP في التعبير الزائد يزيد بشكل كبير من حجم وعدد الكربوهيدرات. منذ الإجهاد التأاكسى يزيد من عدد الكربوهيدرات ولكن يقلل من حجمها. قد تعكس هذه البيانات أن تأثير الإجهاد التأسدي على بنية الكربوهيدرات هو الأكثر إثارة على الأرجح عن طريق تغيير تكوينها بدلاً من تأثير على كمية معينة من اللفائف.لذلك هيكل محلل هو سير العمل وحدات للغاية لتحليل الصور الحيوية. ويمكن تكييفها مع سياقات عدة من دمج القنوات البسيطة إلى القياس الكمي لطوابق متعددة وإشارات في آلاف الخلايا. كما أنه يدمج خوارزميات التجزئة البسيطة والمعقدة اعتمادًا على تعقيد الصورة ويُتمكّن من استخراج ميزات الإشارة الفلورية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

منخفضة التكلفة المرحلة الميكروسكوب البرد الخفيفة التصنيع الخفيف مربوط / مجهرية إلكترون

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

تحضير العينة ، والتصوير ، وتحليل بروتوكولات لالميكروسكوب الضوئي سكين الحافة

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

توجه الخلوي الذاتي الجمعية الى افتعال خواتم نسيج الخلايا المستمدة من النشاط الحيوي لتحليل وهندسة الأنسجة

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

الخلوية لاستخراج الدهن المستهدفة التخفيف النظائر المستقرة تحليل السائل الطيف اللوني القداس

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

تصور منظمة اللحاء وحيوية في الكائنات الدقيقة، وذلك باستخدام المجموع الإسفار التأمل الداخلي المجهر

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

الميكروسكوب المتلازم لتحليل الهيكلية 3D من التفاعلات الدينامية

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...