Name: substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

G.H. 获得来自微型德莱古埃和辅助技术的研究生奖学金的支持。L.H. 获得洛林大学（ICL）研究生研究金的支持，而Q.T.则由法国国家研究机构（ANR）监督的公共赠款支持，作为第二个"Avenir投资"方案的一部分，FIGHT-HF（参考：ANR-15-RHU457004）。这项工作由全国抵抗军和洛林大学（UMR 7365）资助。

注：用户友好的教程可在 Icy 的网站http://icy.bioimageanalysis.org 。
1. 下载"结冰"和"子结构分析器"协议
<ol><li>从结冰网站http://icy.bioimageanalysis.org/download（http://icy.bioimageanalysis.org/download）下载冰，下载子结构分析器协议：http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest。. 注意：如果使?...

<ol>
	<li>M&#246;ckl, L., Lamb, D. C., Br&#228;uchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolved+fluorescence+microscopy:+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig,+Stefan+Hell,+and+William+E.+Moerner.">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li><li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imagining+the+future+of+bioimage+analysis.">Imagining the future of bioimage analysis.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).</li><li>Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., M&#252;nzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+free+software+tools+for+image+analysis+of+fluorescence+cell+micrographs.">Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs.</a> Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+image+analysis+using+NIH+Image/ImageJ.">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).</li><li>Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+on+image+segmentation+techniques.">Survey on image segmentation techniques.</a> Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).</li><li>. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy">https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy</a> (2018)</li><li>. NIS-Elements Imaging Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014)</li><li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+segmentation.">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress.">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>D'Autr&#233;aux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+as+signalling+molecules:+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews.">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+Cell+Senescence,+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases.">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53.">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li><li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2&#946;+(SFRS10)+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells.">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2&#946; (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene.">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+Structure+and+Function.">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation.">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation.">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+3.0:+Next-generation+image+processing+for+biology.">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).</li></ol>

越来越多的自由软件工具可用于分析荧光细胞图像。用户必须根据问题的复杂性、图像处理知识以及在分析中花费的时间正确选择适当的软件。冰，细胞产品，或图像J/斐济是强大的工具，结合了可用性和功能3。Icy 是一个独立工具，它呈现清晰的图形用户界面 （GUI），特别是其"协议"点和点击界面，通过该界面可以轻松设计或操作工作流 4。该软件的功能通过?...

光显微镜，特别是荧光显微镜是生物科学中常用的坚固和通用的技术。它们通过特定的荧光标签，获得各种生物分子（如蛋白质或RNA）的精确定位。过去十年的特点是显微镜和成像技术的飞速发展，2014年诺贝尔化学奖授予埃里克·贝齐格、斯特凡·赫尔和威廉·默纳，用于开发超解析荧光显微镜（SRFM）1。SFRM绕过传统光学显微镜的衍射极限，将它引入纳米测量。现场成像或高吞吐量筛选方法等技术的改进也增加了每个实验要处理的数据的数量和复杂性。大多数时候，研究人员面临着细胞的高异质群体，并且想要在单细胞水平上分析表型。
最初，分析，如foci计数是由眼睛执行，这是一些研究人员的首选，因为它提供了对计数过程的完全视觉控制。然而，对此类数据的手动分析过于耗时，导致观察者之间的变异，并且不能访问更复杂的功能，因此计算机辅助方法正在得到广泛使用，几乎不可避免。生物图像信息学方法大大提高了数据分析的效率，没有人工计数分析不可避免的操作主体性和潜在偏差。这一领域需求的增加和计算机功率的提高，导致了大量图像分析平台的发展。其中一些是免费提供的，并允许访问各种工具，以执行分析与个人电脑。开放访问工具的分类最近已建立3，并提出了Icy4作为一个强大的软件结合可用性和功能。此外，冰具有与 ImageJ 通信的优势。
对于没有图像分析专业知识的用户，主要障碍是根据有问题和正确调整通常不被很好地理解的参数选择适当的工具。此外，设置时间通常很长。Icy 提出了一个名为"协议"的用户友好的点击界面，通过组合在详尽的集合 4 中的一些插件来开发工作流。灵活的模块化设计和点击式界面使得非程序员的分析变得可行。在这里，我们提出了一个名为"子结构分析仪"的工作流程，该分析器是在冰的界面中开发的，其功能是分析特定蜂窝隔间中的荧光信号，并测量亮度、foci编号、foci 大小和空间分布等不同要素。此工作流程解决了几个问题，如信号转移的量化、表达荧光报告器的转染细胞分析，或分析单个细胞中不同细胞子结构的 foci。它允许同时处理多个图像，输出结果将导出到选项卡分隔工作表，该工作表可以在常用的电子表格程序中打开。
子结构分析器管道如图1 所示。首先，对指定文件夹中包含的所有图像进行预处理，以提高其信噪比。此步骤可提高以下步骤的效率并缩短运行时间。然后，对与应检测荧光信号的图像区域对应的感兴趣区域 （RO） 进行标识和分段。最后，对荧光信号进行分析，结果导出到选项卡分隔工作表中。
对象分割（边界检测）是图像分析中最具挑战性的一步，其效率决定了生成的细胞测量的准确性。在图像中识别的第一个对象（称为原对象）通常是DNA染色图像（DAPI或霍奇斯特染色）的核，尽管原对象也可以是整个细胞、珠子、斑点、肿瘤或任何染色物体。在大多数生物图像中，细胞或核相互接触或重叠，导致简单而快速的算法失效。迄今为止，没有通用算法能够对所有对象执行完美的分割，主要是因为它们的特性（大小、形状或纹理）调节了分割效率5。通常与显微镜软件一起分发的分段工具（如分子设备变形成像软件6，或尼康7的NIS-元素推进研究软件）通常基于标准技术，如相关匹配、阈值或形态操作。虽然在基本系统中效率很高，但这些过度泛化的方法在更具挑战性和特定性的情况下使用时会迅速产生局限性。事实上，分割对实验参数（如细胞类型、细胞密度或生物标志物）非常敏感，并且经常需要对大型数据集进行重复调整。子结构分析器工作流集成了简单和更复杂的算法，以提出适合图像复杂性和用户需求的不同替代方案。它特别提出了基于标记的流域算法8，用于高聚类对象。此分段方法的效率取决于每个对象上各个标记的选择。这些标记是大多数时间手动选择的，以获得正确的参数进行完全分段，当用户面对大量对象时，这非常耗时。子结构分析仪建议自动检测这些标记，提供高效的分段过程。分割是图像分析的极限步骤，可以根据图像的分辨率、每个图像的对象数和对象的聚类级别大幅修改处理时间。在标准台式计算机上，每个映像需要几秒钟到 5 分钟。分析更复杂的图像可能需要更强大的计算机和图像分析的一些基本知识。
此工作流的灵活性和功能在代表性结果中用各种示例进行了说明。通过研究氧化应激（OS）条件下的核子结构，可以显著地展示这一工作流程的优点。OS 对应于氧化剂的氧化平衡不平衡，并且与高活性氧物种 （ROS） 相关。由于ROS作为信号分子，其浓度和亚细胞定位的变化对无数调节生理功能的通路和网络产生正或负影响，包括信号转导、修复机制、基因表达、细胞死亡和增殖9,9、10。因此，操作系统直接参与各种疾病（神经退行性疾病和心血管疾病，癌症，糖尿病等），但也细胞老化。因此，破译操作系统对人体细胞组织和功能的影响是理解操作系统在人类病理发病和发育中作用的关键一步。已经确定，OS通过调节转录因子（p53，Nrf2，FOXO3A）11来调节基因表达，但也通过影响几个共同和后转录过程的调节，如前RNA12，13，14,13,14的替代拼接（AS）。11主编码和非编码转录的替代方案拼接是一种基本机制，通过生成转录器等构形式来提高基因组的编码能力。AS由一个巨大的核糖核蛋白复合物称为拼接体，包含近300蛋白质和5个U丰富的小型核RNA（UsnRNA）15。拼接体组装和 AS 在细胞中受到严格控制，拼接体成熟的一些步骤发生在名为 Cajal 实体的无膜核隔间内。这些核子结构的特点是其结构及其组成的动态性质，主要通过RNA和蛋白质成分与线圈蛋白的多价相互作用进行。使用子结构分析器工作流程对数千个细胞进行分析，可以对从未描述的操作系统对 Cajal 实体的影响进行表征。事实上，获得的数据表明，OS修改了Cajal实体的核，诱导线圈蛋白的核质再分配到许多较小的核源。卡哈尔体结构的这种变化可能会影响拼接体的成熟，并参与OS的 AS 调制。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1105px;" width="1104">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">28908</td>
			<td style="width:472px;">to fix the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11008</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21425</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A34055</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Bovine serum albumin standard (BSA)</td>
			<td style="width:183px;">euromedex</td>
			<td style="width:137px;">04-100-812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D5796-500ml</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040-5ML</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human: HeLa S3 cells</td>
			<td>IGBMC, Strasbourg, France</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>cell line used to perform the experiments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">H1009-100ml</td>
			<td>used as a stressing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Mouse monoclonal anti-coilin</td>
			<td style="width:183px;">abcam</td>
			<td style="width:137px;">ab11822</td>
			<td>Coilin-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>epifluoresecence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">PBS pH 7.4 (10x)</td>
			<td style="width:183px;">gibco</td>
			<td style="width:137px;">70011-036</td>
			<td>to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Rabbit polyclonal anti-53BP1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-16565</td>
			<td>53BP1-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit polyclonal anti-EDC4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4200114</td>
			<td>EDC4-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683</td>
			<td>to permeabilize the cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images

过去十年的特点是荧光显微镜技术的突破，表现为空间分辨率的提高，但也表现在活细胞成像和高通量显微镜技术。这导致单个实验的显微镜数据的数量和复杂性不断增加。由于对显微镜数据的手动分析非常耗时、主观，并且禁止定量分析，生物图像分析的自动化几乎不可避免。我们构建了一个名为子结构分析器的信息学工作流程，以完全自动化荧光显微镜生物图像中的信号分析。此工作流是在用户友好的开源平台 Icy 上开发的，由 ImageJ 的功能完成。它包括图像的预处理，以提高信号与噪声比，细胞的单独分割（细胞边界的检测）和检测/定量的细胞体丰富在特定的细胞隔间。此工作流程的主要优点是通过用户友好的界面向没有图像分析专业知识的用户提出复杂的生物成像功能。此外，它具有高度模块化，适应几个问题，从核/细胞质转移的特征到不同细胞亚结构中不同细胞体的比较分析。通过研究氧化应激（OS）条件下的Cajal（线圈）体，可以说明此工作流程的功能。来自荧光显微镜的数据表明，在进入操作系统几小时后，它们在人体细胞中的完整性会受到影响。这种效应的特点是线圈核化减少为特征的Cajal体，与线圈素的核质再分配成增加的较小 foci 的数量有关。线圈在CB组件与周围核质之间的交换中的核心作用表明，OS诱导的线圈的再分配可能会影响Cajal实体的组成和功能。

所有描述的分析都在标准笔记本电脑（64 位四核处理器，2.80 GHz，16 GB 随机访问内存 （RAM））上执行，使用 64 位版本的 Java。随机访问内存是需要考虑的重要参数，具体取决于要分析的图像的数量和分辨率。使用 32 位版本的 Java 将内存限制在 1300 MB，这可能不适合大数据分析，而 64 位版本允许增加分配给 Icy 的内存。图 3报告不同类型图像和不同分辨率的分割所需时间。它?...

Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

我们提出了一个自由可用的工作流程，用于在荧光显微镜图像中快速探索和准确分析特定细胞腔中的细胞体。此用户友好的工作流在开源软件 Icy 上设计，并且还使用 ImageJ 功能。在没有图像分析知识的情况下，管道是负担得起的。

子结构分析仪：用于荧光显微镜图像中细胞体快速探索和精确分析的用户友好型工作流程

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

子结构分析仪是一个用户友好的工作流程，可对多个过程显微镜指标进行自动分析。这并不意味着零吨的开源软件冰，也使用机器功能。重要的是，这个工作流程是负担得起的度假村产生知识和图像分析。多通道图像在工作流程中加载和预处理，以提高信噪比并消除成像或缺陷。然后，图像分割将感兴趣的区域（也称为 RBI）与背景隔离。根据聚类级别和感兴趣对象的性质，有几种分段方法可供选择。分段对象在特定文件夹中使用特定描述符保存。然后在行内分析力和信号，并导出多个要素，如位置、大小、密度纹理中的形状，但数量和大小将导出到自动创建的电子表格中。从冰网站下载冰。然后从 Icy 协议库下载子结构分析器协议。打开"结冰"，然后单击功能区菜单中的工具。单击协议以打开协议编辑器接口。单击负载并打开协议子结构分析器。协议加载可能需要几秒钟。工作流由 13 个常规块组成，每个块作为管道工作，该管道由几个执行特定子任务的框组成。每个块或框都有编号，并且工作流中具有特定的排名。单击此编号，将最接近的第一个位置分配给所选块。其他块的位置将重新组织。通过单击左上角图标，可以折叠展开块。它也可以放大、缩小或删除。工作流的每个管道都是正确的，由其他输入和输出连接在一起的盒子网络产生。要创建连接，请单击输出并维护，直到光标涉及任何输入。可以通过单击输出标记来删除连接。如有必要，重命名文件以便合并序列，则具有相同的名称前缀，后跟不同的分隔符。例如，图像 A 中的单个通道序列被命名为图像 A 下划线红色，图像 A 下划线蓝色，等等。在同一文件夹中，为每个通道创建一个新文件夹进行合并。例如，要合并红色、绿色和蓝色通道，请创建三个文件夹并将相应的序列存储在这些文件夹中。仅使用块合并通道，删除其他块并将协议另存为合并通道。访问框以设置参数。在"通道号 x"框中，选择要提取的通道。在经典 RGB 图像中，零是红色，一个是绿色，两个是蓝色。在"文件夹通道号 x"框中，反斜杠包含通道 x 图像的文件夹的名称。在框中，单独的通道号 x。分隔符用于图像名称。在框中，彩色贴图通道编号 x 用数字指示要使用哪个模型列来可视化 Icy 中的相应通道。在合并图像的格式框中，编写扩展以保存合并的图像。在合并通道块的左上角，单击文件夹右侧的链接。在显示的打开对话框中，双击包含在框文件夹通道 1 中定义的第一个通道序列的文件夹。然后单击打开，运行协议。合并的图像与单个通道的文件夹保存在同一目录中的合并文件夹中。对象分割是图像分析中最具挑战性的一步。它的效率决定了生成的集测量的准确性。因此，结构分析器集成了简单和更复杂的算法，提出了适应图像复杂性和用户需求的不同替代方案。如果对象不相互接触，其他用户不需要单独使用块分割 A 来区分聚类对象。，使用块分割D.使用聚类细胞质中的块分割，使用分段核作为标记单独分割接触细胞质。对于主对象分割的自适应块可以独立处理，以便多个块可以在同一运行中用于比较其特定子结构的效率，或对不同类型的子结构进行分段。为了说明分段，已选择了适合更多问题的块分割 B。使用此博客。首先，链接它选择文件夹。然后，调用通道信号将对象的通道设置为分段。例如，要与 B 对应，在框 HK 中，设置强度类参数和要检测的对象像素的近似最小和最大大小。对于强度类，值 2 将对两个类中的像素进行分类，背景和前景。因此，当对象和背景之间的对比度很高时，它进行调整。如果前景对象具有其源强度，或者与背景的对比度较低，则增加类数。在框中，活动轮廓可优化对象边框的检测。在此期间，将创建一个文件夹来保存分段对象的图像。在框文本中，命名此文件夹，例如，分段核。若要设置保存分段对象图像的格式，请填充分段对象图像的框格式，请运行协议。该文件夹在包含合并图像的文件夹中创建。为了适应在分段对象中分析的定律、通道和单元室的数量，已经开发了不同的块。在下面的示例中，对于分析，选择同一隔间中的块荧光分析 P.2 通道，然后链接它以选择文件夹。在此分析设置参数收件箱文件夹映像 ROI 之前，应处理分段块，编写包含分段对象图像的文件夹名称，前面带有反斜杠。分段对象的图像的收件箱格式，编写用于保存分段对象图像的格式。收件箱终止边框以删除这两个对象。否则，现在需要安装更充分的 J 映像集合才能使用此功能。在盒通道点信号中，设置必须检测到点的通道。在经典 RTP 图像中，零为红色 一是绿色，二是蓝色。在局部分子的框名称中，将分子的名称写在斑点中。要回答的字段数取决于分子的数量。在每个检测器块的框波长中，为每个通道设置点检测参数。为了处理房间中的不同块，请使用块选择文件夹保留所选块的连接。确保他们的排名低于良好的工作流程处理。在运行工作流之前，还建议删除未使用的块，并保存使用另一个名称的新协议。单击"运行"以启动工作流。当它睁开眼睛看书出现。双击包含护士图像的文件夹 然后单击"打开"，工作流将自动运行。如果处理完成消息，成功执行的工作流将显示在右下角，所有块都将用绿色符号标记。如果不是块，显示箭头符号的内框将指示元素正确。重要的是，多个显示器允许在每次运行期间可视化中间结果，以便控制处理。此工作流的快速性、灵活性和功能将仅限于各种示例。在第一个示例中，我们分析了NF kappa B.的核迁移，模拟后TNFα浓度增加。使用分段C和E块对核和细胞质进行划分。利用全局位位分析块对NF kappa B在信号中的蓬勃发展进行了分析。在26分钟内对96个图像中的4万多个细胞进行了分析。生成的数据用于建立此剂量响应曲线，显示 TNF alpha 诱导 NF Kappa B 核转移。工作流还可用于检测文件大小并提取有关其功能的特定信息。在这里，通过本地化EDC的蛋白质，可以检测到单个细胞的特性。利用分段 A 和 E 块对细胞质中的核进行划分。EDC4使用荧光分析块C.In本示例中，在两个分析的细胞中检测到细胞质EDC4符号。电子表格中给出每个完整边的大小（以像素为单位）。在此示例中，我们利用工作流程的多功能性来研究碳水化合物的氧化应激动力学时间更长。线圈的核力标志是碳水化合物的主要结构成分，其数量和大小根据大小、应力状态进行分析，由双股断裂与53BP1进行局部评估。使用分段代理、核力和线圈和53BP1信号对核进行描述，同时使用荧光分析块B进行分析。这些数据有力地表明，氧化应激改变碳水化合物的成核能力，使用核质分布到更小的核站点的数量，以证明线圈表达的变化的合理性可以改变其定位和改变曲线体的成核。外源性GP线圈融合蛋白被过度表达。根据GGFP线圈过度表达水平分析我们身体的特点。利用分段块 A.使用荧光分析块B对线圈和GP线圈的荧光信号进行同步分析，GFP线圈蛋白的超表达水平由单个核中GP信号的表示密度反映出来。下部结构分析仪生成的数据表明，过度表达中的GRFP线圈可显著增加碳水化合物的大小和数量。由于氧化应激增加碳水化合物的数量，但减少其大小。这些数据可能反映，氧化应激对碳水化合物结构的影响很可能由碳水化合物成分的变化，而不是对一定量的线圈素的影响引起的。因此，结构分析仪是生物图像分析的一种高度模块化的工作流程。它可以适应多种环境，从简单的通道合并到数千个单元中多个楼层和信号的量化。它还根据图像复杂性集成了简单而复杂的分段算法，并自动提取荧光信号特征。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

低成本的低温光学显微镜舞台制作相关的光/电子显微镜

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

科研

生物工程

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

刀口扫描显微镜的样品制备，图像和分析协议

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

定向细胞自我组装制造，为生物力学分析与组织工程细胞衍生的组织环

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

有针对性的稳定同位素稀释液相色谱 - 质谱法分析细胞脂质提取

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

皮层组织和动态可视化的微生物，利用全内反射荧光显微镜

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

受体动力学通过单分子荧光显微镜的高分辨率时空分析

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3d轨道跟踪的改进双光子显微镜之应用：细胞内的囊泡的跟踪

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

从快速荧光成像在分子扩散法对活细胞的膜在商业显微镜

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

荧光淬一个脂质体包封的近红外荧光团的作为一个工具<em&gt;在体内</em&gt;光学成像

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...