Name: substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

G.H. blev støttet af et stipendium fra Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. blev støttet af et stipendium fra Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), mens Q.T. blev støttet af et offentligt tilskud under tilsyn af det franske nationale forskningsagentur (ANR) som en del af det andet "Investissements d'Avenir"-program FIGHT-HF (reference: ANR-15-RHU4570004). Dette arbejde blev finansieret af CNRS og Université de Lorraine (UMR 7365).

BEMÆRK: Brugervenlige tutorials er tilgængelige på Icy's hjemmeside http://icy.bioimageanalysis.org.
1. Download iskolde og substructure Analyzer protokol
<ol><li>Download Iskolde fra det iskolde websted (http://icy.bioimageanalysis.org/download) og download substrukturanalyseprotokollen: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest. BEMÆRK: Hvis...

<ol>
	<li>M&#246;ckl, L., Lamb, D. C., Br&#228;uchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolved+fluorescence+microscopy:+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig,+Stefan+Hell,+and+William+E.+Moerner.">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li><li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imagining+the+future+of+bioimage+analysis.">Imagining the future of bioimage analysis.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).</li><li>Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., M&#252;nzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+free+software+tools+for+image+analysis+of+fluorescence+cell+micrographs.">Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs.</a> Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+image+analysis+using+NIH+Image/ImageJ.">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).</li><li>Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+on+image+segmentation+techniques.">Survey on image segmentation techniques.</a> Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).</li><li>. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy">https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy</a> (2018)</li><li>. NIS-Elements Imaging Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014)</li><li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+segmentation.">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress.">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>D'Autr&#233;aux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+as+signalling+molecules:+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews.">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+Cell+Senescence,+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases.">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53.">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li><li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2&#946;+(SFRS10)+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells.">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2&#946; (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene.">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+Structure+and+Function.">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation.">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation.">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+3.0:+Next-generation+image+processing+for+biology.">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).</li></ol>

Et stigende antal gratis software værktøjer er til rådighed til analyse af fluorescens cellebilleder. Brugerne skal korrekt vælge den passende software i henhold til kompleksiteten af deres problematiske, deres viden i billedbehandling, og til den tid, de ønsker at bruge i deres analyse. Icy, CellProfiler, eller ImageJ / Fiji er kraftfulde værktøjer, der kombinerer både brugervenlighed og funktionalitet3. Isnende er et enkeltstående værktøj, der præsenterer en klar grafisk brugergræns...

Lysmikroskopi og især fluorescensmikroskopi er robuste og alsidige teknikker, der almindeligvis anvendes i biologiske videnskaber. De giver adgang til den præcise lokalisering af forskellige biomolekyler som proteiner eller RNA gennem deres specifikke fluorescerende mærkning. Det sidste årti har været præget af hurtige fremskridt inden for mikroskopi og billeddannelse teknologier som det fremgår af 2014 Nobelprisen i kemi tildeling Eric Betzig, Stefan W. Helvede og William E. Moerner for udvikling af super-løst fluorescens mikroskopi (SRFM)1. SFRM omgår diffraktionsgrænsen for traditionel optisk mikroskopi for at bringe den ind i nanodimensionen. Forbedring af teknikker som live-imaging eller høj gennemløb screening tilgange øger også mængden og kompleksiteten af de data til behandling for hvert eksperiment. Det meste af tiden, forskere står over for høje heterogene populationer af celler og ønsker at analysere fænotyper på encelleniveau.
I første omgang blev analyser som foci-optælling udført af øjet, hvilket foretrækkes af nogle forskere, da det giver fuld visuel kontrol over optællingsprocessen. Manuel analyse af sådanne data er imidlertid for tidskrævende, fører til variation mellem observatører og giver ikke adgang til mere komplekse funktioner, således at computerassisterede tilgange bliver udbredt og næsten uundgåelige2. Bioimageinformatikmetoder øger dataanalysens effektivitet betydeligt og er fri for den uundgåelige erhvervsdrivendes subjektivitet og potentielle bias i den manuelle optællingsanalyse. Den øgede efterspørgsel på dette område og forbedringen af computerkraften førte til udviklingen af et stort antal billedanalyseplatforme. Nogle af dem er frit tilgængelige og giver adgang til forskellige værktøjer til at udføre analyser med personlige computere. En klassificering af open access-værktøjer er for nylig blevet etableret3 og præsenterer Icy4 som en kraftfuld software, der kombinerer brugervenlighed og funktionalitet. Desuden icy har den fordel at kommunikere med ImageJ.
For brugere uden ekspertise inden for billedanalyse er de vigtigste hindringer at vælge det rigtige værktøj i henhold til de problematiske og korrekt justere parametre, der ofte ikke er godt forstået. Desuden er opsætningstiderne ofte lange. Icy foreslår en brugervenlig peg-og-klik-grænseflade med navnet "Protokoller" for at udvikle arbejdsgange ved at kombinere nogle plugins fundet i en udtømmende samling4. Det fleksible modulære design og peg-og-klik-grænsefladen gør det muligt at oprette en analyse for ikke-programmører. Her præsenterer vi en arbejdsgang kaldet Substructure Analyzer, udviklet i Icy's interface, hvis funktion er at analysere fluorescerende signaler i specifikke cellulære rum og måle forskellige funktioner som lysstyrke, foci nummer, foci størrelse, og rumlig fordeling. Denne arbejdsgang omhandler flere spørgsmål såsom kvantificering af signaltranslokation, analyse af transficerede celler, der udtrykker en fluorescerende reporter, eller analyse af foci fra forskellige cellulære understrukturer i de enkelte celler. Det giver mulighed for samtidig behandling af flere billeder, og outputresultater eksporteres til et faneafgrænset regneark, der kan åbnes i almindeligt anvendte regnearksprogrammer.
Pipelinen Substructure Analyzer er præsenteret i figur 1. For det første er alle billederne i en bestemt mappe forbehandlet for at forbedre deres signal til støjforhold. Dette trin øger effektiviteten af følgende trin og reducerer køretiden. Derefter identificeres og segmenteres de interesseområder, der svarer til de billedområder, hvor lysstofsignalet skal detekteres. Endelig analyseres fluorescerende signalet, og resultaterne eksporteres til et faneafgrænset regneark.
Objektsegmentering (detektion af grænser) er det mest udfordrende trin i billedanalyse, og dets effektivitet bestemmer nøjagtigheden af de resulterende cellemålinger. De første objekter identificeret i et billede (kaldet primære objekter) er ofte kerner fra DNA-farvede billeder (DAPI eller Hoechst farvning), selv om primære objekter også kan være hele celler, perler, pletter, tumorer, eller hvad farvede objekter. I de fleste biologiske billeder, celler eller kerner røre hinanden eller overlapper forårsager enkle og hurtige algoritmer til at mislykkes. Til dato kan ingen universel algoritme udføre perfekt segmentering af alle objekter, mest fordi deres egenskaber (størrelse, form eller tekstur) modulerer effektiviteten af segmentering5. De segmenteringsværktøjer, der almindeligvis distribueres med mikroskopisoftware (f.eks. MetaMorph Imaging Software by Molecular Devices6eller NIS-Elements Advances Research-softwaren fra Nikon7),er generelt baseret på standardteknikker som korrelationsmatchning, tærskelværdi eller morfologiske operationer. Selv om de er effektive i grundlæggende systemer, udgør disse overgeneraliserede metoder hurtigt begrænsninger, når de anvendes i mere udfordrende og specifikke sammenhænge. Segmentering er meget følsom over for eksperimentelle parametre som celletype, celletæthed eller biomarkører og kræver ofte gentagen justering for et stort datasæt. Arbejdsgangen For Understrukturanalyse integrerer både enkle og mere avancerede algoritmer for at foreslå forskellige alternativer, der er tilpasset billedkompleksiteten og brugernes behov. Den foreslår især den markørbaserede vandskelalgoritme8 for stærkt grupperede objekter. Effektiviteten af denne segmenteringsmetode afhænger af valget af individuelle markører på hvert objekt. Disse markører vælges manuelt det meste af tiden for at få korrekte parametre for fuld segmentering, hvilket er meget tidskrævende, når brugerne står over for et stort antal objekter. Substructure Analyzer foreslår en automatisk påvisning af disse markører, hvilket giver en yderst effektiv segmenteringsproces. Segmentering er det meste af tiden det begrænsende trin i billedanalysen og kan ændre behandlingstiden betydeligt afhængigt af billedets opløsning, antallet af objekter pr. billede og niveauet for gruppering af objekter. Typiske rørledninger kræver et par sekunder til 5 minutter pr. billede på en almindelig stationær computer. Analyse af mere komplekse billeder kan kræve en mere kraftfuld computer og nogle grundlæggende viden i billedanalyse.
Fleksibiliteten og funktionaliteten af denne arbejdsproces illustreres med forskellige eksempler i de repræsentative resultater. Fordelene ved denne arbejdsgang vises især gennem undersøgelse af nukleare understrukturer under oxidative stressforhold .). OS svarer til en ubalance i redox homøostase til fordel for oxidanter og er forbundet med høje niveauer af reaktive ilt arter (ROS). Da ROS fungerer som signalmolekyler, påvirker ændringer i deres koncentration og subcellulære lokalisering positivt eller negativt et utal af veje og netværk, der regulerer fysiologiske funktioner, herunder signaltransduktion, reparationsmekanismer, genekspression, celledød og spredning9,10. OS er således direkte involveret i forskellige patologier (neurodegenerative og hjerte-kar-sygdomme, kræft, diabetes, osv.), men også cellulære aldring. Derfor udgør dechifrering af os's konsekvenser for den menneskelige celles organisation og funktion et afgørende skridt i forståelsen af OS's roller i starten og udviklingen af menneskelige patologier. Det er blevet fastslået, at OS regulerer genekspression ved at modulere transskription gennem flere transskriptionsfaktorer (p53, Nrf2, FOXO3A)11, men også ved at påvirke reguleringen af flere co- og post-transskriptionelle processer såsom alternativ splejsning (AS) af præ-RNAs12,13,14. Alternativ splejsning af primær kodning og ikke-kodning udskrifter er en væsentlig mekanisme, der øger kodning kapacitet af genomer ved at producere udskrift isoforms. AS udføres af en enorm ribonucleoprotein kompleks kaldet splejseosom, der indeholder næsten 300 proteiner og 5 U-rige små nukleare RNAs (UsnRNAs)15. Splejsning og AS er stramt kontrolleret i celler og nogle trin i splejsning forekommer inden for membran-mindre nukleare rum ved navn Cajal Organer. Disse nukleare understrukturer er karakteriseret ved den dynamiske karakter af deres struktur og deres sammensætning, som hovedsagelig udføres af multivalente interaktioner mellem deres RNA og proteinkomponenter med coilinproteinet. Analyse af tusindvis af celler med substruktur analyzer workflow tilladt karakterisering af aldrig beskrevet virkningerne af OS på Cajal Organer. Faktisk, opnåede data tyder på, at OS ændrer nukleation af Cajal Organer, inducere en nukleoplasmatisk omfordeling af coilin protein i mange mindre nukleare foci. En sådan ændring af cajalorganernes struktur kan påvirke modningen af splejsning og deltage i AS-modulering af OS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1105px;" width="1104">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">28908</td>
			<td style="width:472px;">to fix the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11008</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21425</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A34055</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Bovine serum albumin standard (BSA)</td>
			<td style="width:183px;">euromedex</td>
			<td style="width:137px;">04-100-812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D5796-500ml</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040-5ML</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human: HeLa S3 cells</td>
			<td>IGBMC, Strasbourg, France</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>cell line used to perform the experiments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">H1009-100ml</td>
			<td>used as a stressing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Mouse monoclonal anti-coilin</td>
			<td style="width:183px;">abcam</td>
			<td style="width:137px;">ab11822</td>
			<td>Coilin-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>epifluoresecence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">PBS pH 7.4 (10x)</td>
			<td style="width:183px;">gibco</td>
			<td style="width:137px;">70011-036</td>
			<td>to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Rabbit polyclonal anti-53BP1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-16565</td>
			<td>53BP1-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit polyclonal anti-EDC4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4200114</td>
			<td>EDC4-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683</td>
			<td>to permeabilize the cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images

Det seneste årti har været præget af gennembrud inden for fluorescensmikroskopiteknikker illustreret ved forbedring af rumlig opløsning, men også i levende cellebilleddannelse og mikroskopiteknikker med høj gennemløb. Dette førte til en konstant stigning i mængden og kompleksiteten af mikroskopidataene for et enkelt eksperiment. Da manuel analyse af mikroskopidata er meget tidskrævende, subjektiv og forbyder kvantitative analyser, er automatisering af bioimageanalyse næsten uundgåelig. Vi byggede en informatik workflow kaldet Substructure Analyzer til fuldt ud at automatisere signalanalyse i bioimages fra fluorescerende mikroskopi. Denne arbejdsgang er udviklet på den brugervenlige open source-platform Icy og er afsluttet af funktionaliteter fra ImageJ. Det omfatter forbehandling af billeder for at forbedre signal-støjforholdet, den individuelle segmentering af celler (påvisning af cellegrænser) og detektion/kvantificering af cellekroppe beriget i specifikke cellerum. Den største fordel ved denne arbejdsgang er at foreslå komplekse biobilledbehandlingsfunktioner til brugere uden ekspertise inden for billedanalyse via en brugervenlig grænseflade. Desuden er det meget modulopbygget og tilpasset til flere spørgsmål fra karakterisering af nukleare / cytoplasmatiske translokation til den sammenlignende analyse af forskellige celleorganer i forskellige cellulære substrukturer. Funktionaliteten af denne arbejdsgang er illustreret gennem studiet af Cajal (oprullet) Organer under oxidative stress (OS) betingelser. Data fra fluorescensmikroskopi viser, at deres integritet i humane celler påvirkes få timer efter induktionen af OS. Denne effekt er karakteriseret ved et fald i coilin nucleation i karakteristiske Cajal Organer, forbundet med en nucleoplasmic omfordeling af coilin i et øget antal mindre foci. Coilins centrale rolle i udvekslingen mellem CB-komponenter og den omgivende kerneoplasme tyder på, at os-induceret omfordeling af coilin kan påvirke Cajal-organernes sammensætning og funktionalitet.

Alle de beskrevne analyser er blevet udført på en standard laptop (64-bit, quad-core processor på 2,80 GHz med 16 GB random-access memory (RAM)) arbejder med 64-bit version af Java. Random-access hukommelse er en vigtig parameter at overveje, afhængigt af mængden og opløsningen af billeder til at analysere. Ved hjælp af 32-bit versionen af Java begrænser hukommelsen til omkring 1300 MB, hvilket kunne være uegnet til big data-analyse, mens 64-bit versionen gør det muligt at øge den hukommelse, der er allokeret ...

Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

Vi præsenterer en frit tilgængelig arbejdsgang bygget til hurtig udforskning og præcis analyse af cellulære organer i specifikke celle rum i fluorescens mikroskopi billeder. Denne brugervenlige arbejdsgang er designet på open source-software iskolde og bruger også ImageJ funktionaliteter. Rørledningen er overkommelig uden viden i billedanalyse.

Substructure Analyzer: En brugervenlig workflow for hurtig udforskning og nøjagtig analyse af cellulære organer i fluorescens mikroskopi Billeder

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Understrukturanalysator er en brugervenlig arbejdsgang, der udfører automatisk analyse af flere procesmikroskopimålinger. Det betyder ikke nul tonsvis af open source-software iskolde og også ved hjælp af maskinen funktionaliteter. Vigtigere er det, at denne arbejdsgang er overkommelig udvej producere viden og billeder analyse.Multikanalbilleder indlæses i arbejdsprocessen og behandles på forhånd for at forbedre signal-støjforholdet og fjerne billeddannelse eller defekter. Derefter isolerer billedsegmentering områder af interesse, også kendt som ROI'er fra baggrunden. Der findes flere segmenteringsmetoder afhængigt af klyngeniveauet og arten af de objekter, der er af interesse.Segmenterede objekter gemmes med en bestemt beskrivelse i en bestemt mappe. Force og signaler analyseres derefter i rækkerne og flere funktioner som placering, størrelse, form i tæthedsteksturer, men antal og størrelse eksporteres til et automatisk oprettet regneark. Download Icy fra Icy hjemmeside.Download derefter Substructure Analyzer Protocol fra iskolde bibliotek af protokoller. Åbn Iscy, og klik på værktøjer i båndmenuen. Klik på protokoller for at åbne protokollerne editor interface.Klik på belastning og åbne protokollen understruktur analysator. Protokolindlæsning kan tage få sekunder. Arbejdsprocessen består af 13 generelle blokke hver blok, der fungerer som en pipeline, der består af flere bokse, der udfører specifikke underopgaver.Hver blok eller boks er nummereret og har en bestemt rang i arbejdsprocessen. Ved at klikke på dette nummer skal du tildele den nærmeste mulige position til den første til den valgte blok. Positioner af de andre blokke er reorganiseret.Ved at klikke på ikonet øverste venstre hjørne kan blokken skjules. Det kan også forstørres, indsnævres eller fjernes. Hver pipeline af arbejdsprocessen er korrekt opstod af et netværk af kasser forbundet sammen med andre input og output.Hvis du vil oprette en forbindelse, skal du klikke på et output og vedligeholde, indtil markøren vedrører input. Forbindelser kan fjernes ved at klikke på output-tagget. Omdøbe filerne om nødvendigt, så sekvenser, der skal flettes, har samme navnepræfiks efterfulgt af en særskilt separator.Sekvenser af individuelle kanaler fra et billede A navngives f.eks. Opret en ny mappe pr. kanal, der skal flettes, i samme mappe. For eksempel, for at fusionere røde, grønne og blå kanaler, skal du oprette tre mapper og gemme de tilsvarende sekvenser i disse mapper.Brug kun blokfletningskanalerne, fjern de andre blokke, og gem protokollen som flettekanaler. Adgang til felterne for at angive parametre. Vælg, hvilken kanal der skal udtrækkes, i feltet, kanalnummer x.I klassiske RGB-billeder er nul rød, den ene er grøn, og to er blå. I feltet, mappe kanal nummer x, Backslash navnet på den mappe, der indeholder billeder af kanal x. Adskjj 000.Separatoren bruger til billednavn. I feltet, farvekort kanal nummer x, angive med et tal, hvilken kolonne af model til at bruge til at visualisere den tilsvarende kanal i Icy. Skriv udvidelsen i feltet, formatet af flettede billeder, for at gemme flettede billeder.I øverste venstre hjørne af fletningskanalblokken skal du klikke på linket direkte til højre for mappen. I den åbne dialogboks, der vises, skal du dobbeltklikke på den mappe, der indeholder sekvenser af den første kanal, der er defineret i boksmappekanal nummer et. Klik derefter på åben, løb protokollen.Flettede billeder gemmes i en flettet mappe i samme mappe som mapperne i de enkelte kanaler. Objektsegmentering er det mest udfordrende trin i billedanalysen. Det er effektivitet bestemmer nøjagtigheden af de resulterende sæt målinger.Så struktur analysator integrerer både enkle og mere komplekse algoritmer til at foreslå forskellige alternativer tilpasset billedet kompleksitet og brugernes behov. Hvis objekter ikke rører hinanden, behøver andre brugere ikke at skelne mellem gruppeobjekter, der enkeltvis bruger bloksegmenteringen A.Når objekter ikke rører hinanden, men nogle af dem er i nærheden, skal du bruge bloksegmenteringen B.For objekter med et højt klyngeniveau og en konveks form skal du bruge bloksegmenteringen C.Hvis objekter udgør et højt klyngeniveau og har uregelmæssige former , skal du bruge bloksegmenteringen D.Use block segmentationen i klynger cytoplasma til at segmentere berøring af cytoplasmaer individuelt ved hjælp af segmenterede kerner som markører. Bloktilpasset til segmentisering af primære objekter kan behandles uafhængigt, så flere blokke kan bruges i samme løb til at sammenligne deres effektivitet for en bestemt understruktur eller til at segmentere forskellige typer understrukturer.For at illustrere segmentering er bloksegmenteringen B, der passer til et større antal problemer, valgt. For at bruge denne blog. Først skal du sammenkæde den for at vælge mappe.Aktiverer derefter kanalsignalet, der er objektets kanal til at segmentere. For eksempel, at svare til B, i boksen HK midler, indstille intensitet klasser parameter og den omtrentlige minimum og maksimum størrelser i pixels af objekter, der skal detekteres. For intensitetsklasser klassificeres en værdi på to pixel i to klasser, baggrund og forgrund.Den tilpasses således, når kontrasten mellem objekterne og baggrunden er høj. Hvis forgrundsobjekter har sin oprindelse intensiteter, eller kontrast til baggrunden er lav, øge antallet af klasser. I boks aktive konturer optimere detektion af objekter kanter.Under processen oprettes der en mappe for at gemme billeder af segmenterede objekter. I bokstekst skal du navngive denne mappe, f.eks. Hvis du vil angive formatet til lagring af billeder af segmenterede objekter, skal du udfylde boksformatet for billeder af segmenterede objekter og kørte protokollen.Mappen oprettes i den mappe, der indeholder flettede billeder. Der er udviklet forskellige blokke for at tilpasse sig antallet af love og kanaler og cellerum, der skal analyseres i segmenterede objekter. I følgende eksempel skal du vælge blokfluorescensanalysen P.Two-kanaler i samme rum til analysen og sammenkæde den for at vælge mappe.Segmentering blok skulle have været behandlet, før denne analyse indstille parametre indbakken mappe billeder ROI, skrive navnet på den mappe, der indeholder billeder af segmenterede objekter indledes med en backslash. Indbakkeformat af billeder af segmenterede objekter, skrive formatet bruges til at gemme billeder af segmenterede objekter. Indbakke dræbe kanter for at fjerne begge objekter.Ellers, lige nu, installation af mere fuldt J samling af billedbehandling er nødvendig for at bruge denne funktion. I bokse kanal spot signal, indstille den kanal, hvor pletter skal detekteres. I klassiske RTP-billeder er nul rød Dene er grøn, og to er blå.I kasser navn lokaliseret molekyle, skrive navnet på molekylet lokalisere i pletter. Antallet af felter, der skal besvares, afhænger af antallet af molekyler. I kasser bølgelængder pr detektor blok, sæt pletter afsløring parametre for hver enkelt kanal.For at behandle forskellige blokke i et rum, holde forbindelser af valgte blokke, med blokken vælge mappe. Sørg for, at deres rækker under den gode behandling af arbejdsprocessen. Før du kører arbejdsprocessen, anbefales det også at fjerne ubrugte blokke og gemme den nye protokol med et andet navn.Klik på kør for at starte arbejdsprocessen. Når det åbner øjet se bøger vises. Dobbeltklik på den mappe, der indeholder sygeplejersken billeder Derefter skal du klikke på Åbn, vil arbejdsprocessen automatisk køre.Hvis behandlingen er fuldført, vises den udførte arbejdsproces i nederste højre hjørne, alle blokke markeres med det grønne tegn. Hvis ikke blokken og den indvendige boks præsenterer pilen tegn vil angive elementerne korrekte. Det er vigtigt, at flere skærme gør det muligt at visualisere de mellemliggende resultater under hver kørsel for at styre behandlingen.Hurtigheden, fleksibiliteten og funktionaliteten af denne arbejdsproces vil være begrænset til forskellige eksempler. I dette første eksempel analyserer vi den nukleare translokation af NF kappa B.After simulering med stigende koncentrationer af TNF alpha. Kerner og cytoplasmaer blev afgrænset ved hjælp af segmentations C- og E-blokke.NF kappa B blomstre i signal blev analyseret ved hjælp af den globale translokation analyse blok. Mere end 40.000 celler i 96 billeder blev analyseret på 26 minutter. De genererede data blev anvendt til at fastslå denne dosisresponskurve, der viser induktionen af NF Kappa B nuklear translokation ved TNF alpha.Arbejdsprocessen kan også bruges til at registrere filstørrelse og udtrække specifikke oplysninger om deres funktioner. Her blev egenskaber i de enkelte celler opdaget ved at lokalisere EDC for protein. Kerner i cytoplasma blev afgrænset ved hjælp af segmentation A og E blokke.EDC4 blev analyseret ved hjælp af fluorescens analyseblokke C.In dette eksempel, cytoplasmatisk EDC4 tegn er blevet opdaget i begge analyserede celler. Størrelsen i pixel på hver fuld side er angivet i regnearket. I dette eksempel benyttede vi os af alsidigheden i arbejdsprocessen til at studere kulhydrater en længere kinetik af oxidativstress.Nuclear force tegn på coilin er de vigtigste strukturelle komponenter af kulhydrater Deres antal og størrelse blev analyseret i henhold til størrelse, stress status, vurderet af dobbelt streng pauser lokaliseret med 53BP1. Kerner blev afgrænset ved hjælp af segmentering proxy, nuklear kraft og signaler af coillin og 53BP1, blev samtidig analyseret ved hjælp af fluorescens analyse Block B.Using data fra 2300 individuelle celler, vi viste en betydelig stigning i antallet af Greenfield site efter stress induktion forbundet med et fald i deres størrelse. Disse data tyder stærkt på, at oxidativ stress ændrer kernen i en kulhydrater i at bruge en nuklear plasmisk fordeling i antallet af mindre nukleare for anlæg til at retfærdiggøre en ændring i coilin udtryk kan ændre sin lokalisering og ændre kernen i kurve organer.Et eksogent GFP coilinfusionsprotein var overudtrykt. Funktioner af vores kroppe blev analyseret i henhold til GFP coilin overexpression niveau. Kerner blev afgrænset ved hjælp af segmentering blok A.De fluorescerende signaler af coilin og GFP coilin, blev samtidig analyseret ved hjælp af fluorescens analyse blok B.Overexpression niveau af GFP lyv blev afspejlet af betydningen tæthed af GFP signal i de enkelte kerner.Data genereret af understruktur analysator viser, at GFP coilin i overexpression øger størrelsen og antallet af kulhydrater. Da oxidativ stress øger antallet af kulhydrater, men reducerer deres størrelse. Disse data kan afspejle, at oxidativ stress effekt på strukturen af kulhydrater er sandsynligvis induceret af en ændring af deres sammensætning snarere end af en effekt på en vis mængde coilin.Så struktur analysator er en meget modulær arbejdsgang for bio image analyse. Det kan tilpasses flere sammenhænge fra simpel sammenlægning af kanaler til kvantificering af flere etager og signaler i tusindvis af celler. Det integrerer også enkle og komplekse segmentering algoritmer afhængigt af billedets kompleksitet og automatiserer udvinding af fluorescerende signal funktioner.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Prøvepræparation, Imaging, og Analyse protokoller for knivsæg Scanning Mikroskopi

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Instrueret Cellular saml-selv at fabrikere Cell-afledt Tissue Ringe til Biomekanisk analyse og Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Ekstraktion for målrettet stabile isotoper Fortynding Liquid Chromatography-massespektrometri Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering af Cortex Organisation og Dynamics i mikroorganismer, ved hjælp af total indre refleksion Fluorescens Mikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Korrelativ mikroskopi til 3D Strukturel analyse af dynamiske vekselvirkning

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høj opløsning Spatiotemporal Analyse af receptor Dynamics ved Single-molekyle fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modificeret to-foton mikroskop: en ansøgning til sporing af intracellulære vesikler

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Hurtig fluorescensimagografi til molekylær diffusion lov om levende cellemembraner i en kommerciel mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-quenching af et liposomalt indkapslet Near-infrarøde fluorofor som et værktøj til<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...