Name: substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

G.H. werd ondersteund door een graduate fellowship van de Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. werd ondersteund door een graduate fellowship van het Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), terwijl Q.T. werd ondersteund door een overheidssubsidie onder toezicht van het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR) als onderdeel van het tweede "Investissements d'Avenir" programma FIGHT-HF (referentie: ANR-15-RHU4570004). Dit werk werd gefinancierd door CNRS en Université de Lorraine (UMR 7365).

LET OP: Gebruiksvriendelijke tutorials zijn beschikbaar op de website van Icy http://icy.bioimageanalysis.org.
1. Download Icy en het Substructure Analyzer protocol
<ol><li>Download Icy van de Icy website(http://icy.bioimageanalysis.org/download) en download het Substructure Analyzer protocol: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest. OPMERKING: ...

<ol>
	<li>M&#246;ckl, L., Lamb, D. C., Br&#228;uchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolved+fluorescence+microscopy:+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig,+Stefan+Hell,+and+William+E.+Moerner.">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li><li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imagining+the+future+of+bioimage+analysis.">Imagining the future of bioimage analysis.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).</li><li>Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., M&#252;nzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+free+software+tools+for+image+analysis+of+fluorescence+cell+micrographs.">Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs.</a> Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+image+analysis+using+NIH+Image/ImageJ.">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).</li><li>Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+on+image+segmentation+techniques.">Survey on image segmentation techniques.</a> Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).</li><li>. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy">https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy</a> (2018)</li><li>. NIS-Elements Imaging Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014)</li><li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+segmentation.">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress.">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>D'Autr&#233;aux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+as+signalling+molecules:+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews.">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+Cell+Senescence,+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases.">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53.">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li><li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2&#946;+(SFRS10)+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells.">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2&#946; (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene.">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+Structure+and+Function.">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation.">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation.">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+3.0:+Next-generation+image+processing+for+biology.">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).</li></ol>

Een toenemend aantal vrije software tools zijn beschikbaar voor de analyse van fluorescentie celbeelden. Gebruikers moeten correct kiezen voor de adequate software op basis van de complexiteit van hun problematische, om hun kennis in beeldverwerking, en de tijd die ze willen doorbrengen in hun analyse. Icy, CellProfiler of ImageJ/Fiji zijn krachtige tools die zowel bruikbaarheid als functionaliteitcombineren 3. Icy is een stand-alone tool die een duidelijke grafische gebruikersinterface (GUI) pres...

Lichte microscopie en, meer in het bijzonder, fluorescentiemicroscopie zijn robuuste en veelzijdige technieken die vaak worden gebruikt in de biologische wetenschappen. Ze geven toegang tot de precieze lokalisatie van verschillende biomoleculen zoals eiwitten of RNA door hun specifieke fluorescerende etikettering. Het afgelopen decennium is gekenmerkt door snelle vooruitgang in microscopie en imaging technologieën zoals blijkt uit de 2014 Nobelprijs voor de Scheikunde toekenning Eric Betzig, Stefan W. Hell en William E. Moerner voor de ontwikkeling van super-resolved fluorescentie microscopie (SRFM)1. SFRM omzeilt de diffractielimiet van traditionele optische microscopie om deze in de nanodimensie te brengen. Verbetering van technieken zoals live-imaging of hoge doorvoer screening benaderingen verhoogt ook de hoeveelheid en de complexiteit van de gegevens te behandelen voor elk experiment. De meeste van de tijd, onderzoekers worden geconfronteerd met hoge heterogene populaties van cellen en willen fenotypes te analyseren op het eencellige niveau.
Aanvankelijk werden analyses zoals foci tellen uitgevoerd door het oog, wat de voorkeur heeft van sommige onderzoekers, omdat het volledige visuele controle biedt over het telproces. Handmatige analyse van dergelijke gegevens is echter te tijdrovend, leidt tot variabiliteit tussen waarnemers en geeft geen toegang tot complexere functies, zodat computerondersteunde benaderingen op grote schaal worden gebruikt en bijna onvermijdelijk2. Bioimage informaticamethoden verhogen de efficiëntie van data-analyse aanzienlijk en zijn vrij van de onvermijdelijke operator subjectiviteit en potentiële bias van de handmatige telanalyse. De toegenomen vraag op dit gebied en de verbetering van computerkracht leidden tot de ontwikkeling van een groot aantal beeldanalyseplatforms. Sommigen van hen zijn vrij beschikbaar en geven toegang tot verschillende tools om analyse uit te voeren met personal computers. Een classificatie van open access tools is onlangs opgericht3 en presenteert Icy4 als een krachtige software die bruikbaarheid en functionaliteit combineert. Bovendien heeft Icy het voordeel van de communicatie met ImageJ.
Voor gebruikers zonder expertise op het gebied van beeldanalyse zijn de belangrijkste obstakels het kiezen van het juiste gereedschap op basis van de problematische en correct afgestemde parameters die vaak niet goed worden begrepen. Bovendien zijn de insteltijden vaak lang. Icy stelt een gebruiksvriendelijke point-and-click interface genaamd "Protocollen" voor om workflow te ontwikkelen door een aantal plug-ins te combineren die in een uitputtende verzameling zijn gevonden4. Het flexibele modulaire ontwerp en de point-and-click interface maken het opzetten van een analyse haalbaar voor niet-programmeurs. Hier presenteren we een workflow genaamd Substructure Analyzer, ontwikkeld in Icy's interface, wiens functie is om fluorescerende signalen in specifieke cellulaire compartimenten te analyseren en verschillende functies te meten als helderheid, foci-getal, foci-grootte en ruimtelijke verdeling. Deze workflow behandelt verschillende kwesties, zoals kwantificering van signaaltranslocatie, analyse van doorfecteerde cellen die een fluorescerende reporter uitdrukken, of analyse van foci uit verschillende cellulaire substructuren in individuele cellen. Hiermee u meerdere afbeeldingen gelijktijdig verwerken en worden uitvoerresultaten geëxporteerd naar een door tabbladen afgebakend werkblad dat kan worden geopend in veelgebruikte spreadsheetprogramma's.
De substructuuranalyzerpijplijn wordt gepresenteerd in figuur 1. Ten eerste worden alle afbeeldingen in een opgegeven map vooraf verwerkt om de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Deze stap verhoogt de efficiëntie van de volgende stappen en vermindert de looptijd. Vervolgens worden de regio's van belang (ROI's), die overeenkomen met de afbeeldingsgebieden waar het fluorescerende signaal moet worden gedetecteerd, geïdentificeerd en gesegmenteerd. Ten slotte wordt het fluorescerende signaal geanalyseerd en worden de resultaten geëxporteerd naar een door tabbladen afgebakend werkblad.
Objectsegmentatie (detectie van grenzen) is de meest uitdagende stap in beeldanalyse en de efficiëntie ervan bepaalt de nauwkeurigheid van de resulterende celmetingen. De eerste objecten geïdentificeerd in een afbeelding (de zogenaamde primaire objecten) zijn vaak kernen van DNA-gekleurde beelden (DAPI of Hoechst vlekken), hoewel primaire objecten kunnen ook hele cellen, kralen, spikkels, tumoren, of wat gekleurde objecten. In de meeste biologische beelden raken cellen of kernen elkaar of overlappen elkaar waardoor de eenvoudige en snelle algoritmen mislukken. Tot op heden kan geen enkel universeel algoritme een perfecte segmentatie van alle objecten uitvoeren, vooral omdat hun kenmerken (grootte, vorm of textuur) de efficiëntie van segmentatie5moduleren. De segmentatietools die gewoonlijk worden gedistribueerd met microscopiesoftware (zoals de MetaMorph Imaging Software by Molecular Devices6, of de NIS-Elements Advances Research software van Nikon7) zijn over het algemeen gebaseerd op standaardtechnieken zoals correlatiematching, thresholding of morfologische bewerkingen. Hoewel efficiënt in basissystemen, deze overgegeneraliseerde methoden snel presenteren beperkingen bij gebruik in meer uitdagende en specifieke contexten. Segmentatie is namelijk zeer gevoelig voor experimentele parameters zoals celtype, celdichtheid of biomarkers en vereist vaak herhaalde aanpassing voor een grote gegevensset. De Substructure Analyzer workflow integreert zowel eenvoudige als meer geavanceerde algoritmen om verschillende alternatieven voor te stellen die zijn aangepast aan de complexiteit van het beeld en de behoeften van de gebruiker. Het stelt met name de marker-gebaseerde waterscheiding algoritme8 voor sterk geclusterde objecten. De efficiëntie van deze segmentatiemethode is afhankelijk van de selectie van afzonderlijke markeringen op elk object. Deze markeringen worden meestal handmatig gekozen om de juiste parameters voor volledige segmentatie te krijgen, wat zeer tijdrovend is wanneer gebruikers geconfronteerd worden met een groot aantal objecten. Substructuur Analyzer stelt een automatische detectie van deze markers voor, wat een zeer efficiënt segmentatieproces biedt. Segmentatie is meestal de beperkende stap van beeldanalyse en kan de verwerkingstijd aanzienlijk wijzigen, afhankelijk van de resolutie van de afbeelding, het aantal objecten per afbeelding en het niveau van clustering van objecten. Typische pijplijnen vereisen enkele seconden tot 5 minuten per afbeelding op een standaard desktopcomputer. Analyse van complexere beelden kan een krachtigere computer en enige basiskennis in beeldanalyse vereisen.
De flexibiliteit en functionaliteit van deze workflow worden geïllustreerd met verschillende voorbeelden in de representatieve resultaten. De voordelen van deze workflow worden met name weergegeven door de studie van nucleaire substructuren onder oxidatieve stress (OS) omstandigheden. OS komt overeen met een onbalans van de redox homeostase ten gunste van oxidanten en wordt geassocieerd met hoge niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS). Aangezien ROS fungeren als signaalmoleculen, beïnvloeden veranderingen in hun concentratie en subcellulaire lokalisatie positief of negatief een groot aantal trajecten en netwerken die fysiologische functies reguleren, waaronder signaaltransductie, reparatiemechanismen, genexpressie, celdood en proliferatie9,10. OS is dus direct betrokken bij verschillende pathologieën (neurodegeneratieve en hart- en vaatziekten, kankers, diabetes, enz.), maar ook cellulaire veroudering. Daarom is het ontcijferen van de gevolgen van OS op de organisatie en functie van de menselijke cel een cruciale stap in het begrijpen van de rol van OS in het begin en de ontwikkeling van menselijke pathologieën. Er is vastgesteld dat OS genexpressie reguleert door transcriptie te moduleren via verschillende transcriptiefactoren (p53, Nrf2, FOXO3A)11, maar ook door de regulering van verschillende co- en posttranscriptieprocessen zoals alternatieve splicing (AS) van pre-RNAs12,13,,14. Alternatieve splicing van primaire codering en niet-coderende transcripties is een essentieel mechanisme dat de coderingscapaciteit van de genomen verhoogt door transcriptie-isovormen te produceren. AS wordt uitgevoerd door een enorm ribonucleoprotein complex genaamd spliceosoom, met bijna 300 eiwitten en 5 U-rijke kleine nucleaire RNAs (UsnRNAs)15. Spliceosoom assemblage en AS zijn strak gecontroleerd in cellen en sommige stappen van de spliceosoom rijping optreden binnen membraan-minder nucleaire compartimenten genaamd Cajal Bodies. Deze nucleaire substructuren worden gekenmerkt door de dynamische aard van hun structuur en hun samenstelling, die voornamelijk worden uitgevoerd door multivalente interacties van hun RNA en eiwitcomponenten met het coilin-eiwit. Analyse van duizenden cellen met de Substructure Analyzer-workflow liet karakterisering toe van nooit beschreven effecten van OS op Cajal Bodies. Inderdaad, verkregen gegevens suggereren dat OS wijzigt de nucleatie van Cajal Bodies, het induceren van een nucleoplasmische herverdeling van de coilin eiwit in tal van kleinere nucleaire foci. Een dergelijke verandering van de structuur van Cajal Bodies kan de rijping van het spliceosoom beïnvloeden en deelnemen aan AS-modulatie door OS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1105px;" width="1104">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">28908</td>
			<td style="width:472px;">to fix the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11008</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21425</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A34055</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Bovine serum albumin standard (BSA)</td>
			<td style="width:183px;">euromedex</td>
			<td style="width:137px;">04-100-812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D5796-500ml</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040-5ML</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human: HeLa S3 cells</td>
			<td>IGBMC, Strasbourg, France</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>cell line used to perform the experiments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">H1009-100ml</td>
			<td>used as a stressing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Mouse monoclonal anti-coilin</td>
			<td style="width:183px;">abcam</td>
			<td style="width:137px;">ab11822</td>
			<td>Coilin-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>epifluoresecence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">PBS pH 7.4 (10x)</td>
			<td style="width:183px;">gibco</td>
			<td style="width:137px;">70011-036</td>
			<td>to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Rabbit polyclonal anti-53BP1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-16565</td>
			<td>53BP1-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit polyclonal anti-EDC4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4200114</td>
			<td>EDC4-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683</td>
			<td>to permeabilize the cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images

Het laatste decennium werd gekenmerkt door doorbraken in fluorescentie microscopie technieken geïllustreerd door verbetering van de ruimtelijke resolutie, maar ook in live-cel beeldvorming en high-throughput microscopie technieken. Dit leidde tot een constante toename van de hoeveelheid en complexiteit van de microscopiegegevens voor één experiment. Omdat handmatige analyse van microscopiegegevens zeer tijdrovend, subjectief is en kwantitatieve analyses verbiedt, wordt automatisering van bioimageanalyse bijna onvermijdelijk. We bouwden een informatica workflow genaamd Substructure Analyzer om de signaalanalyse volledig te automatiseren in biobeelden van fluorescerende microscopie. Deze workflow is ontwikkeld op het gebruiksvriendelijke open-source platform Icy en wordt aangevuld met functionaliteiten van ImageJ. Het omvat de voorbewerking van beelden om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, de individuele segmentatie van cellen (detectie van celgrenzen) en de detectie/kwantificering van cellichamen verrijkt in specifieke celcompartimenten. Het belangrijkste voordeel van deze workflow is om complexe bio-imaging functionaliteiten voor te stellen aan gebruikers zonder kennisanalyse expertise via een gebruiksvriendelijke interface. Bovendien is het zeer modulair en aangepast aan verschillende kwesties van de karakterisering van nucleaire / cytoplasmische translocatie aan de vergelijkende analyse van verschillende cellichamen in verschillende cellulaire substructuren. De functionaliteit van deze workflow wordt geïllustreerd door de studie van de Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) voorwaarden. Gegevens van fluorescentiemicroscopie tonen aan dat hun integriteit in menselijke cellen een paar uur na de inductie van OS wordt beïnvloed. Dit effect wordt gekenmerkt door een afname van coilin nucleatie in karakteristieke Cajal Bodies, geassocieerd met een nucleoplasmische herverdeling van coilin in een verhoogd aantal kleinere foci. De centrale rol van coilin in de uitwisseling tussen CB-componenten en het omringende nucleoplasma suggereert dat os-geïnduceerde herverdeling van coilin de samenstelling en de functionaliteit van Cajal Bodies kan beïnvloeden.

Alle beschreven analyses zijn uitgevoerd op een standaard laptop (64-bits, quad-core processor op 2,80 GHz met 16 GB random-access memory (RAM)) werken met de 64-bits versie van Java. Random-access geheugen is een belangrijke parameter om rekening mee te houden, afhankelijk van de hoeveelheid en de resolutie van beelden te analyseren. Met behulp van de 32-bits versie van Java beperkt het geheugen tot ongeveer 1300 MB, die ongeschikt zou kunnen zijn voor big data-analyse, terwijl de 64-bits versie maakt het verhogen van h...

Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

We presenteren een vrij beschikbare workflow gebouwd voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in specifieke celcompartimenten in fluorescentiemicroscopie beelden. Deze gebruiksvriendelijke workflow is ontworpen op de open-source software Icy en maakt ook gebruik van ImageJ functionaliteiten. De pijplijn is betaalbaar zonder kennis van beeldanalyse.

Substructuur Analyzer: Een gebruiksvriendelijke workflow voor snelle verkenning en nauwkeurige analyse van cellulaire lichamen in fluorescentiemicroscopie beelden

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Substructure analyzer is een gebruiksvriendelijke workflow die automatische analyse uitvoert van meerdere procesmicroscopiestatistieken. Het betekent niet nul ton van open source software Icy en ook met behulp van machine functionaliteiten. Belangrijk is dat deze workflow is betaalbaar resort produceren kennis en beelden analyse.Multi-channel beelden worden geladen binnen de workflow en voorbewerkt om de signaal-ruisverhouding te verbeteren en om beeldvorming of defecten te verwijderen. Vervolgens isoleert beeldsegmentatie gebieden van belang, ook wel ROI's genoemd op de achtergrond. Afhankelijk van het clusteringniveau en de aard van de objecten van belang zijn er verschillende segmentatiemethoden beschikbaar.Gesegmenteerde objecten worden opgeslagen met een specifieke beschrijving in een specifieke map. Kracht en signalen worden vervolgens geanalyseerd binnen de rijen en meerdere functies zoals locatie, grootte, vorm in dichtheidstexturen, maar aantal en grootte worden geëxporteerd naar een automatisch gemaakte spreadsheet. Download Icy van de Icy website.Download vervolgens Substructure Analyzer Protocol uit de Icy-bibliotheek van protocollen. Open IJs en klik op gereedschappen in het lintmenu. Klik op protocollen om de interface van de protocolleneded te openen.Klik op belasting en open de protocolonderbouwanalyse. Het laden van protocollen kan enkele seconden duren. De werkstroom bestaat uit 13 algemene blokken die elk blok werken als een pijplijn die bestaat uit verschillende vakken die specifieke subtaken uitvoeren.Elk blok of vak is genummerd en heeft een specifieke rang binnen de werkstroom. Door op dit nummer te klikken, wijst u de hoogst mogelijke positie toe aan het eerste aan het geselecteerde blok. Posities van de andere blokken worden gereorganiseerd.Door op het pictogram linkerbovenhoek te klikken, kan het blok worden samengevouwen. Het kan ook worden vergroot, vernauwd of verwijderd. Elke pijplijn van de werkstroom is correct ontstaan door een netwerk van vakken die zijn verbonden door andere invoer en uitvoer.Als u een verbinding wilt maken, klikt u op een uitvoer en blijft u behouden totdat de cursor een invoer heeft. Verbindingen kunnen worden verwijderd door op de uitvoertag te klikken. Indien nodig de naam van de bestanden wijzigen, zodat sequenties worden samengevoegd, hebben dezelfde namen voorvoegsel gevolgd door verschillende scheidingsteken.Reeksen van afzonderlijke kanalen uit een afbeelding A worden bijvoorbeeld afbeelding A genoemd, afbeelding A onderstreept blauw, enzovoort. Maak in dezelfde map een nieuwe map per kanaal om samen te voegen. Als u bijvoorbeeld rode, groene en blauwe kanalen wilt samenvoegen, maakt u drie mappen en slaat u de bijbehorende reeksen in deze mappen op.Gebruik alleen de kanaals voor het samenvoegen van blokken, verwijder de andere blokken en sla het protocol op als samenvoegkanalen. Toegang tot de vakken om parameters in te stellen. Kies in het vak kanaalnummer x welk kanaal u wilt extraheren.In klassieke RGB-afbeeldingen is nul rood, één groen en twee is blauw. In het vak, map kanaal nummer x, Backslash de naam van de map met afbeeldingen van kanaal x. In het vak, afzonderlijk kanaalnummer x.Het scheidingstekengebruik voor afbeeldingsnaam. Geef in het vak kleurkaartkanaalnummer x aan met een getal welke kolom van het model moet worden gebruikt om het overeenkomstige kanaal in Icy te visualiseren. Schrijf in het vak de indeling van samengevoegde afbeeldingen en schrijf de extensie om samengevoegde afbeeldingen op te slaan.Klik in de linkerbovenhoek van het kanaalblok samenvoegen op de koppeling direct rechts van de map. Dubbelklik in het geopende dialoogvenster dat wordt weergegeven op de map met reeksen van het eerste kanaal dat is gedefinieerd in het mapkanaal nummer één van de vakmap. Klik dan op open, liep het protocol.Samengevoegde afbeeldingen worden opgeslagen in een samengevoegde map in dezelfde map als de mappen van afzonderlijke kanalen. Objectsegmentatie is de meest uitdagende stap in beeldanalyse. De efficiëntie bepaalt de nauwkeurigheid van de resulterende ingestelde metingen.Dus, structuur analyzer integreert zowel eenvoudige als meer complexe algoritmen om verschillende alternatieven aangepast aan de complexiteit van het beeld en de behoeften van de gebruiker voor te stellen. Als objecten elkaar niet raken, hoeft een andere gebruiker geclusterde objecten niet afzonderlijk te onderscheiden met de bloksegmentatie A.Wanneer objecten elkaar niet raken, maar sommige objecten zich in de nabijheid bevinden, gebruikt u de bloksegmentatie B.Voor objecten met een hoog clusteringniveau en een bolle vorm gebruikt u de bloksegmentatie C.Als objecten een hoog clusteringniveau vertonen en onregelmatige vormen hebben en onregelmatige vormen hebben , gebruik de bloksegmentatie D.Gebruik de bloksegmentatie in clusterscytoplasma om het aanraken van cytoplasma afzonderlijk te segmenteren met behulp van gesegmenteerde kernen als markeringen. Blokadaptief voor primaire objectsegmentatie kan onafhankelijk worden verwerkt, zodat meerdere blokken in dezelfde run kunnen worden gebruikt om hun efficiëntie voor een bepaalde substructuur te vergelijken of om verschillende typen substructuren te segmenteren.Ter illustratie van segmentatie, het blok segmentatie B, dat past bij een groter aantal problemen is gekozen. Om deze blog te gebruiken. Koppel het eerst aan de map.Roept vervolgens kanaalsignaal in om het kanaal van het object in te stellen op segment. Als u bijvoorbeeld overeenkomt met de B, wordt in vak HK de parameter intensiteitsklassen en de geschatte minimum- en maximumgrootte in pixels van te detecteren objecten ingesteld. Voor intensiteitsklassen wordt een waarde van twee pixels ingedeeld in twee klassen, achtergrond en voorgrond.Het wordt dus aangepast wanneer het contrast tussen de objecten en de achtergrond hoog is. Als objecten op de voorgrond de oorsprongsintensiteiten hebben of als het contrast met de achtergrond laag is, verhoogt u het aantal klassen. In vak actieve contouren optimaliseren de detectie van objecten randen.Tijdens het proces wordt een map gemaakt om afbeeldingen van gesegmenteerde objecten op te slaan. Geef deze map in vaktekst bijvoorbeeld een naam, waarbij ze kernen segmenteert. Als u de indeling wilt instellen voor het opslaan van afbeeldingen van gesegmenteerde objecten, vult u de vaknotatie van afbeeldingen van gesegmenteerde objecten en heeft u het protocol uitgevoerd.De map wordt gemaakt in de map met samengevoegde afbeeldingen. Er zijn verschillende blokken ontwikkeld om zich aan te passen aan het aantal wetten en kanalen en celcompartimenten dat in gesegmenteerde objecten moet worden geanalyseerd. Kies in het volgende voorbeeld voor de analyse de blokfluorescentieanalyse P.Two-kanalen in hetzelfde compartiment en koppel deze aan de map.Het segmentatieblok had moeten worden verwerkt voordat deze analyse de ROI van de parameters inboxmapafbeeldingen instelt, de naam van de map met afbeeldingen van gesegmenteerde objecten die zijn voorafgegaan door een backslash. Inbox-indeling van afbeeldingen van gesegmenteerde objecten, schrijf de indeling die wordt gebruikt om afbeeldingen van gesegmenteerde objecten op te slaan. Inbox doden randen om beide objecten te verwijderen.Anders, op dit moment, de installatie van de meer volledig J-collectie van beeldvorming is vereist om deze functie te gebruiken. In dozen kanaal spot signaal, stel het kanaal waar vlekken moeten worden gedetecteerd. In klassieke RTP-afbeeldingen is nul rood Een is groen en twee is blauw.In dozen naam van gelokaliseerde molecuul, schrijf de naam van het molecuul lokaliseren in de vlekken. Het aantal velden dat moet worden beantwoord, is afhankelijk van het aantal moleculen. In dozen golflengten per detector blok, stel vlekken detectie parameters voor elk individueel kanaal.Als u verschillende blokken in een ruimte wilt verwerken, moet u verbindingen van gekozen blokken behouden, met de map blok selecteren. Zorg ervoor dat hun gelederen onder de goede verwerking van de workflow. Voordat u de werkstroom uitvoert, wordt het ook aanbevolen om ongebruikte blokken te verwijderen en het nieuwe protocol met een andere naam op te slaan.Klik op hardlopen om de werkstroom te starten. Wanneer het opent ogen kijken boeken verschijnt. Dubbelklik op de map met de verpleegkundige afbeeldingen Klik vervolgens op Openen, de werkstroom wordt automatisch uitgevoerd.Als de verwerking is voltooid, wordt de met succes uitgevoerde werkstroom weergegeven in de rechterbenedenhoek, alle blokken worden gemarkeerd met het groene teken. Zo niet, dan geven het blok en het binnenvak met het pijlteken de juiste elementen aan. Belangrijk is dat verschillende displays het mogelijk maken om de tussenliggende resultaten tijdens elke run te visualiseren om de verwerking te controleren.De snelheid, flexibiliteit en functionaliteit van deze workflow zal worden beperkt tot verschillende voorbeelden. In dit eerste voorbeeld analyseren we de nucleaire translocatie van NF kappa B.After simulatie met toenemende concentraties van TNF alpha. Kernen en cytoplasma werden afgebakend met behulp van segmentatie C en E blokken.De NF kappa B floreren in signaal werd geanalyseerd met behulp van de wereldwijde translocatie analyse blok. Meer dan 40.000 cellen in 96 beelden werden geanalyseerd in 26 minuten. De gegenereerde gegevens werden gebruikt om deze dosisresponscurve vast te stellen die de inductie van NF Kappa B nucleaire translocatie door TNF alpha weergeeft.De werkstroom kan ook worden gebruikt om bestandsgrootte te detecteren en specifieke informatie over hun functies te extraheren. Hier werden eigenschappen in individuele cellen gedetecteerd door de EDC te lokaliseren voor eiwitten. Kernen in cytoplasma werden afgebakend met behulp van segmentatie A en E blokken.EDC4 werd geanalyseerd met behulp van fluorescentie analyse blokken C.In dit voorbeeld, cytoplasma EDC4 teken zijn gedetecteerd in beide geanalyseerde cellen. De grootte in pixels van elke volledige zijde wordt gegeven in de spreadsheet. In dit voorbeeld maakten we gebruik van de veelzijdigheid van de workflow om koolhydraten te bestuderen een langere kinetiek van oxidatieve stress.Nucleaire kracht teken van coilin zijn de belangrijkste structurele componenten van koolhydraten Hun aantal en grootte werden geanalyseerd op basis van grootte, stress status, beoordeeld door dubbele streng breekt gelokaliseerd met 53BP1. Kernen werden afgebakend met behulp van segmentatie proxy, Nucleaire kracht en signalen van coillin en 53BP1, werden gelijktijdig geanalyseerd met behulp van fluorescentie analyse Block B.Using gegevens van 2300 individuele cellen, we bewezen een aanzienlijke toename van het aantal Greenfield site na stress inductie geassocieerd met een afname van hun grootte. Deze gegevens suggereren sterk dat oxidatieve stress verandert de nucleatie kracht van een koolhydraten in het gebruik van een nucleaire plasmische distributie in het aantal kleinere nucleaire voor de site om een verandering in coilin expressie te rechtvaardigen kan veranderen de lokalisatie en de nucleatie van curve lichamen te veranderen.Een exogene GFP coilin fusion eiwit werd overuitgedrukt. Kenmerken van ons lichaam werden geanalyseerd volgens GFP coilin overexpressie niveau. Kernen werden afgebakend met behulp van segmentatie blok A.De fluorescerende signalen van coilin en GFP coilin, werden gelijktijdig geanalyseerd met behulp van fluorescentie analyse blok B.The overexpression niveau van GFP coilin werd weerspiegeld door de betekenis dichtheid van het GFP-signaal in individuele kernen.Gegevens gegenereerd door substructuur analyzer blijkt dat GFP coilin in overexpressie aanzienlijk verhoogt de grootte en het aantal koolhydraten. Sinds oxidatieve stress verhoogt het aantal koolhydraten, maar vermindert hun grootte. Deze gegevens kunnen weerspiegelen dat oxidatieve stress effect op de structuur van koolhydraten wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een verandering van hun samenstelling in plaats van door een effect op bepaalde hoeveelheid coilin.Dus structuur analyzer is een zeer modulaire workflow voor bio-beeldanalyse. Het kan worden aangepast aan verschillende contexten, van het eenvoudig samenvoegen van kanalen tot de kwantificering van meerdere verdiepingen en signalen in duizenden cellen. Het integreert ook eenvoudige en complexe segmentatiealgoritmen, afhankelijk van de complexiteit van het beeld en automatiseert de extractie van fluorescerende signaalfuncties.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Low-Cost Cryo-Light Microscopie Stage Fabrication voor Gecorreleerde Light / Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Specimen Voorbereiding, Imaging, en Analyse Protocollen voor Knife-edge Scanning Microscopie

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Gericht Cellular Self-Assembly to Cell-Derived weefsel Rings fabriceren voor Biomechanische Analyse en Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellulaire vetextractie voor gerichte stabiele isotopen Verdunning vloeistofchromatografie-massaspectrometrie Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisatie van Cortex Organisatie en Dynamiek in Micro-organismen, met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...