Name: substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00
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G.H. wurde durch ein Graduiertenstipendium des Ministére Délégué é la Recherche et aux Technologies unterstützt. L.H. wurde durch ein Graduiertenstipendium des Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL) unterstützt, während Q.T. durch ein öffentliches Stipendium unterstützt wurde, das von der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) im Rahmen des zweiten Programms "Investissements d'Avenir" FIGHT-HF (Referenz: ANR-15-RHU4570004) überwacht wurde. Diese Arbeit wurde von CNRS und der Université de Lorraine (UMR 7365) finanziert.

HINWEIS: Benutzerfreundliche Tutorials sind auf der Website von Icy http://icy.bioimageanalysis.orgverfügbar.
1. Herunterladen von Eis und dem Substructure Analyzer-Protokoll
<ol><li>Laden Sie Icy von der Icy-Website (http://icy.bioimageanalysis.org/download) herunter und laden Sie das Substructure Analyzer-Protokoll herunter: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest</...

<ol>
	<li>M&#246;ckl, L., Lamb, D. C., Br&#228;uchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolved+fluorescence+microscopy:+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig,+Stefan+Hell,+and+William+E.+Moerner.">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li><li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imagining+the+future+of+bioimage+analysis.">Imagining the future of bioimage analysis.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).</li><li>Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., M&#252;nzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+free+software+tools+for+image+analysis+of+fluorescence+cell+micrographs.">Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs.</a> Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+image+analysis+using+NIH+Image/ImageJ.">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).</li><li>Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+on+image+segmentation+techniques.">Survey on image segmentation techniques.</a> Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).</li><li>. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy">https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy</a> (2018)</li><li>. NIS-Elements Imaging Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014)</li><li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+segmentation.">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress.">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>D'Autr&#233;aux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+as+signalling+molecules:+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews.">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+Cell+Senescence,+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases.">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53.">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li><li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2&#946;+(SFRS10)+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells.">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2&#946; (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene.">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+Structure+and+Function.">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation.">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation.">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+3.0:+Next-generation+image+processing+for+biology.">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).</li></ol>

Für die Analyse von Fluoreszenzzellbildern stehen immer mehr freie Software-Tools zur Verfügung. Benutzer müssen die geeignete Software entsprechend der Komplexität ihres Problems, ihrem Wissen in der Bildverarbeitung und der Zeit, die sie in ihrer Analyse verbringen möchten, richtig auswählen. Icy, CellProfiler oder ImageJ/Fiji sind leistungsstarke Tools, die sowohl Benutzerfreundlichkeit als auch Funktionalität kombinieren3. Icy ist ein eigenständiges Tool, das eine klare grafische Benut...

Die Lichtmikroskopie und insbesondere die Fluoreszenzmikroskopie sind robuste und vielseitige Techniken, die in den biologischen Wissenschaften häufig eingesetzt werden. Sie geben Zugang zur präzisen Lokalisierung verschiedener Biomoleküle wie Proteine oder RNA durch ihre spezifische fluoreszierende Kennzeichnung. Das letzte Jahrzehnt war geprägt von rasanten Fortschritten in der Mikroskopie und Bildgebungstechnologien, wie der Nobelpreis für Chemie 2014 zeigt, der Eric Betzig, Stefan W. Hell und William E. Moerner für die Entwicklung der superaufgelösten Fluoreszenzmikroskopie (SRFM)1vergibt. SFRM umgeht die Beugungsgrenze der traditionellen optischen Mikroskopie, um sie in die Nanodimension zu bringen. Die Verbesserung von Techniken wie Live-Imaging oder Screening-Ansätzen mit hohem Durchsatz erhöht auch die Menge und Komplexität der daten, die für jedes Experiment behandelt werden sollen. Meistens sind Forscher mit hohen heterogenen Zellpopulationen konfrontiert und wollen Phänotypen auf einzelliger Ebene analysieren.
Zunächst wurden Analysen wie die Brennweite mit dem Auge durchgeführt, was von einigen Forschern bevorzugt wird, da es eine vollständige visuelle Kontrolle über den Zählprozess bietet. Die manuelle Analyse solcher Daten ist jedoch zu zeitaufwändig, führt zu Einer Variabilität zwischen den Beobachtern und bietet keinen Zugriff auf komplexere Merkmale, so dass computergestützte Ansätze weit verbreitet und nahezu unvermeidbar werden2. Bioimage-Informatik-Methoden erhöhen die Effizienz der Datenanalyse erheblich und sind frei von der unvermeidbaren Bedienersubjektivität und potenziellen Verzerrung der manuellen Zählanalyse. Die gestiegene Nachfrage in diesem Bereich und die Verbesserung der Computerleistung führten zur Entwicklung einer vielzahl von Bildanalyseplattformen. Einige von ihnen sind frei verfügbar und ermöglichen den Zugriff auf verschiedene Tools, um Analysen mit PCs durchzuführen. Eine Klassifizierung von Open-Access-Tools wurde vor kurzem3 eingeführt und präsentiert Icy4 als leistungsstarke Software, die Benutzerfreundlichkeit und Funktionalität kombiniert. Darüber hinaus hat Eis den Vorteil, mit ImageJ zu kommunizieren.
Für Anwender ohne Bildanalyse-Expertise besteht das Haupthindernis darin, das passende Werkzeug entsprechend den problematischen und korrekt abgestimmten Parametern auszuwählen, die oft nicht gut verstanden werden. Darüber hinaus sind die Rüstzeiten oft lang. Icy schlägt eine benutzerfreundliche Point-and-Click-Schnittstelle namens "Protokolle" vor, um den Workflow zu entwickeln, indem einige Plugins kombiniert werden, die in einer erschöpfenden Sammlung gefunden wurden4. Der flexible modulare Aufbau und die Point-and-Click-Schnittstelle machen die Einrichtung einer Analyse für Nicht-Programmierer möglich. Hier stellen wir einen Workflow namens Substructure Analyzervor, der in der Icy-Schnittstelle entwickelt wurde und dessen Funktion darin besteht, fluoreszierende Signale in bestimmten zellulären Kompartimenten zu analysieren und verschiedene Merkmale wie Helligkeit, Brennziffer, Brennpunktegröße und räumliche Verteilung zu messen. Dieser Workflow befasst sich mit mehreren Fragen wie der Quantifizierung der Signaltranslokation, der Analyse transfizierter Zellen, die einen fluoreszierenden Reporter exdrücken, oder der Analyse von Brennpunkten aus verschiedenen zellulären Unterstrukturen in einzelnen Zellen. Es ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer Bilder, und Ausgabeergebnisse werden in ein von Registerkarten getrenntes Arbeitsblatt exportiert, das in häufig verwendeten Tabellenkalkulationsprogrammen geöffnet werden kann.
Die Substructure Analyzer-Pipeline ist in Abbildung 1dargestellt. Erstens werden alle Bilder, die in einem angegebenen Ordner enthalten sind, vorverarbeitet, um ihr Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Dieser Schritt erhöht die Effizienz der folgenden Schritte und verringert die Laufzeit. Dann werden die Regionen des Interesses (ROIs), die den Bildbereichen entsprechen, in denen das Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden soll, identifiziert und segmentiert. Schließlich wird das Fluoreszenzsignal analysiert, und die Ergebnisse werden in ein durch Tabstopps getrenntes Arbeitsblatt exportiert.
Die Objektsegmentierung (Erkennung von Grenzen) ist der anspruchsvollste Schritt in der Bildanalyse, und ihre Effizienz bestimmt die Genauigkeit der resultierenden Zellmessungen. Die ersten Objekte, die in einem Bild identifiziert werden (primäre Objekte genannt) sind oft Kerne aus DNA-befleckten Bildern (DAPI- oder Hoechst-Färbung), obwohl primäre Objekte auch ganze Zellen, Perlen, Flecken, Tumoren oder was auch immer gefärbte Objekte sein können. In den meisten biologischen Bildern berühren sich Zellen oder Kerne oder überlappen sich, wodurch die einfachen und schnellen Algorithmen versagen. Bis heute kann kein universeller Algorithmus eine perfekte Segmentierung aller Objekte durchführen, vor allem, weil ihre Eigenschaften (Größe, Form oder Textur) die Effizienz der Segmentierung5modulieren. Die Segmentierungstools, die üblicherweise mit Mikroskopiesoftware vertrieben werden (z. B. die MetaMorph Imaging Software von Molecular Devices6oder die NIS-Elements Advances Research Software von Nikon7), basieren im Allgemeinen auf Standardtechniken wie Korrelationsabgleich, Schwellenwertierung oder morphologischen Operationen. Obwohl diese übergeneralisierten Methoden in grundlegenden Systemen effizient sind, stellen sie schnell Einschränkungen dar, wenn sie in anspruchsvolleren und spezifischeren Kontexten eingesetzt werden. Tatsächlich ist die Segmentierung sehr empfindlich gegenüber experimentellen Parametern wie Zelltyp, Zelldichte oder Biomarkern und erfordert häufig eine wiederholte Anpassung für einen großen Datensatz. Der Substructure Analyzer-Workflow integriert sowohl einfache als auch anspruchsvollere Algorithmen, um verschiedene Alternativen vorzuschlagen, die an die Bildkomplexität und die Benutzeranforderungen angepasst sind. Sie schlägt insbesondere den markerbasierten Wasserscheidealgorithmus8 für stark gruppierte Objekte vor. Die Effizienz dieser Segmentierungsmethode hängt von der Auswahl der einzelnen Marker für jedes Objekt ab. Diese Marker werden die meiste Zeit manuell ausgewählt, um korrekte Parameter für die vollständige Segmentierung zu erhalten, was sehr zeitaufwändig ist, wenn Benutzer mit einer hohen Anzahl von Objekten konfrontiert sind. Substructure Analyzer schlägt eine automatische Erkennung dieser Marker vor und bietet so einen hocheffizienten Segmentierungsprozess. Die Segmentierung ist meistens der einschränkende Schritt der Bildanalyse und kann die Verarbeitungszeit je nach Auflösung des Bildes, der Anzahl der Objekte pro Bild und der Ebene des Clusterings von Objekten erheblich ändern. Typische Pipelines benötigen auf einem Standarddesktopcomputer einige Sekunden bis 5 Minuten pro Bild. Die Analyse komplexerer Bilder kann einen leistungsfähigeren Computer und einige Grundlegendes in der Bildanalyse erfordern.
Die Flexibilität und Funktionalität dieses Workflows wird anhand verschiedener Beispiele in den repräsentativen Ergebnissen veranschaulicht. Die Vorteile dieses Workflows werden vor allem durch die Untersuchung nuklearer Unterstrukturen unter oxidativen Stressbedingungen (OS) deutlich. OS entspricht einem Ungleichgewicht der Redoxhomöostase zugunsten von Oxidationsmitteln und ist mit hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) verbunden. Da ROS als Signalmoleküle fungieren, wirken sich Veränderungen in ihrer Konzentration und subzellulären Lokalisation positiv oder negativ auf eine Vielzahl von Signalwegen und Netzwerken aus, die physiologische Funktionen regulieren, einschließlich Signaltransduktion, Reparaturmechanismen, Genexpression, Zelltod und Proliferation9,10. OS ist somit direkt an verschiedenen Pathologien (neurodegenerative und herzkarvaskuläre Erkrankungen, Krebs, Diabetes, etc.), aber auch zelluläreAlterung beteiligt. Daher stellt die Entschlüsselung der Folgen von OS für die Organisation und Funktion der menschlichen Zelle einen entscheidenden Schritt im Verständnis der Rolle von OS beim Beginn und der Entwicklung menschlicher Pathologien dar. Es wurde festgestellt, dass OS die Genexpression reguliert, indem es die Transkription durch mehrere Transkriptionsfaktoren moduliert (p53, Nrf2, FOXO3A)11, aber auch durch die Beeinflussung mehrerer ko- und posttranskriptionaler Prozesse wie alternatives Spleißen (AS) von Pre-RNAs12,13,14. Das alternative Spleißen von primären Kodierungs- und Nicht-Codierungs-Transkripten ist ein wesentlicher Mechanismus, der die Kodierungskapazität der Genome durch die Produktion von Transkript-Isoformen erhöht. AS wird von einem riesigen Ribonukleoprotein-Komplex namens Spliceoom durchgeführt, der fast 300 Proteine und 5 U-reiche kleine nukleare RNAs (UsnRNAs)15enthält. Spliceosome Montage und AS werden in den Zellen streng kontrolliert und einige Schritte der spliceosome Reifung treten in membranlosen Kernräumen namens Cajal Bodies. Diese kerntechnischen Unterstrukturen zeichnen sich durch die Dynamik ihrer Struktur und ihre Zusammensetzung aus, die hauptsächlich durch multivalente Wechselwirkungen ihrer RNA- und Proteinkomponenten mit dem Coilin-Protein erfolgen. Die Analyse von Tausenden von Zellen mit dem Substructure Analyzer-Workflow ermöglichte die Charakterisierung nie beschriebener Os-Effekte auf Cajal Bodies. Tatsächlich deuten die erhaltenen Daten darauf hin, dass OS die Keimbildung von Cajal Bodies modifiziert und eine nukleoplasmatische Umverteilung des Coilin-Proteins in zahlreiche kleinere Kernbrennpunkte induzieren. Eine solche Änderung der Struktur von Cajal Bodies könnte die Reifung des Spliceooms beeinflussen und an der AS-Modulation durch OS teilnehmen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1105px;" width="1104">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">28908</td>
			<td style="width:472px;">to fix the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11008</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21425</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A34055</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Bovine serum albumin standard (BSA)</td>
			<td style="width:183px;">euromedex</td>
			<td style="width:137px;">04-100-812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D5796-500ml</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040-5ML</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human: HeLa S3 cells</td>
			<td>IGBMC, Strasbourg, France</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>cell line used to perform the experiments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">H1009-100ml</td>
			<td>used as a stressing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Mouse monoclonal anti-coilin</td>
			<td style="width:183px;">abcam</td>
			<td style="width:137px;">ab11822</td>
			<td>Coilin-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>epifluoresecence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">PBS pH 7.4 (10x)</td>
			<td style="width:183px;">gibco</td>
			<td style="width:137px;">70011-036</td>
			<td>to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Rabbit polyclonal anti-53BP1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-16565</td>
			<td>53BP1-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit polyclonal anti-EDC4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4200114</td>
			<td>EDC4-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683</td>
			<td>to permeabilize the cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images

Das letzte Jahrzehnt war durch Durchbrüche in Fluoreszenzmikroskopie-Techniken gekennzeichnet, die durch die Verbesserung der räumlichen Auflösung, aber auch in Live-Zell-Bildgebung und Hochdurchsatzmikroskopie-Techniken veranschaulicht wurden. Dies führte zu einer stetigen Zunahme der Menge und Komplexität der Mikroskopiedaten für ein einzelnes Experiment. Da die manuelle Analyse von Mikroskopiedaten sehr zeitaufwändig, subjektiv und quantitative Analysen verbietet, wird die Automatisierung der Biobildanalyse nahezu unvermeidbar. Wir haben einen Informatik-Workflow namens Substructure Analyzer entwickelt, um die Signalanalyse in Biobildern aus der fluoreszierenden Mikroskopie vollständig zu automatisieren. Dieser Workflow wird auf der benutzerfreundlichen Open-Source-Plattform Icy entwickelt und durch Funktionalitäten von ImageJ ergänzt. Es umfasst die Vorverarbeitung von Bildern zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses, die individuelle Segmentierung von Zellen (Erkennung von Zellgrenzen) und die Erkennung/Quantifizierung von Zellkörpern, die in bestimmten Zellkompartimen angereichert sind. Der Hauptvorteil dieses Workflows besteht darin, Benutzern komplexe Bio-Imaging-Funktionalitäten ohne Bildanalyse-Expertise über eine benutzerfreundliche Oberfläche vorzuschlagen. Darüber hinaus ist es hochmodular und an mehrere Themen angepasst, von der Charakterisierung der kern-zytoplasmatischen Translokation bis hin zur vergleichenden Analyse verschiedener Zellkörper in verschiedenen zellulären Substrukturen. Die Funktionalität dieses Workflows wird durch die Untersuchung der Cajal (gewickelt) Körper unter oxidativen Stressbedingungen (OS) veranschaulicht. Daten aus der Fluoreszenzmikroskopie zeigen, dass ihre Integrität in menschlichen Zellen wenige Stunden nach der Induktion des Betriebssystems beeinträchtigt wird. Dieser Effekt ist durch eine Abnahme der Coilin-Kernbildung in charakteristische Cajal-Körper gekennzeichnet, verbunden mit einer nukleoplasmatischen Umverteilung von Coilin in eine erhöhte Anzahl kleinerer Brennpunkte. Die zentrale Rolle von Coilin beim Austausch zwischen CB-Komponenten und dem umgebenden Nukleoplasma legt nahe, dass OS-induzierte Umverteilung von Coilin die Zusammensetzung und Die Funktionalität von Cajal Bodies beeinflussen könnte.

Alle beschriebenen Analysen wurden auf einem Standard-Laptop (64-Bit- Quad-Core-Prozessor bei 2,80 GHz mit 16 GB Ram-Speicher (Random-Access Memory) durchgeführt, der mit der 64-Bit-Version von Java arbeitet. Der Arbeitsspeicher mit zufälligem Zugriff ist ein wichtiger Parameter, der je nach Menge und Auflösung der zu analysierenden Bilder zu berücksichtigen ist. Die Verwendung der 32-Bit-Version von Java beschränkt den Speicher auf ca. 1300 MB, was für big Data-Analysen ungeeignet sein könnte, während die 64-Bit...

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Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

Wir präsentieren einen frei verfügbaren Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in bestimmten Zellkompartimenten in Fluoreszenzmikroskopiebildern. Dieser benutzerfreundliche Workflow wurde auf der Open-Source-Software Icy entwickelt und verwendet auch ImageJ-Funktionalitäten. Die Pipeline ist ohne Kenntnisse in der Bildanalyse erschwinglich.

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Der Unterstrukturanalysator ist ein benutzerfreundlicher Workflow, der die automatische Analyse mehrerer Prozessmikroskopiemetriken durchführt. Es bedeutet nicht null Tonnen Open-Source-Software Eis und auch mit Maschinenfunktionalitäten. Wichtig ist, dass dieser Workflow erschwinglich ist Resort produzieren Wissen und Bilder Analyse.Mehrkanalbilder werden innerhalb des Workflows geladen und vorverarbeitet, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern und Bildgebung oder Defekte zu entfernen. Anschließend isoliert die Bildsegmentierung Interessenbereiche, die auch als ROIs bezeichnet werden, vom Hintergrund aus. Je nach Clusterebene und Art der Objekte stehen verschiedene Segmentierungsmethoden zur Verfügung.Segmentierte Objekte werden mit einem bestimmten Deskriptor in einem bestimmten Ordner gespeichert. Kraft und Signale werden dann innerhalb der Zeilen analysiert und mehrere Features wie Position, Größe, Form in Dichtetexturen, aber Anzahl und Größe werden in eine automatisch erstellte Kalkulationstabelle exportiert. Laden Sie Icy von der Icy-Website herunter.Laden Sie dann Substructure Analyzer Protocol aus der Icy-Protokollbibliothek herunter. Öffnen Sie Eig, und klicken Sie auf die Werkzeuge im Menümenü. Klicken Sie auf Protokolle, um die Protokoll-Editor-Schnittstelle zu öffnen.Klicken Sie auf Laden und öffnen Sie den Protokoll-Unterstrukturanalysator. Das Laden des Protokolls kann einige Sekunden dauern. Der Workflow besteht aus 13 allgemeinen Blöcken, die als Pipeline arbeiten und aus mehreren Feldern bestehen, die bestimmte Teilaufgaben ausführen.Jeder Block oder jedes Feld ist nummeriert und hat einen bestimmten Rang innerhalb des Workflows. Wenn Sie auf diese Nummer klicken, weisen Sie dem ausgewählten Block die nächstgelegene Position der ersten zu. Die Positionen der anderen Blöcke werden neu organisiert.Durch Klicken auf das obere linke Ecksymbol kann der Block erweitert werden. Es kann auch vergrößert, verengt oder entfernt werden. Jede Pipeline des Workflows ist korrekt, die durch ein Netzwerk von Boxen entstanden ist, die durch andere Ein- und Ausgaben miteinander verbunden sind.Um eine Verbindung zu erstellen, klicken Sie auf eine Ausgabe und halten Sie, bis der Cursor eine Eingabe bezieht. Verbindungen können entfernt werden, indem Sie auf das Ausgabe-Tag klicken. Benennen Sie die Dateien bei Bedarf so um, dass Sequenzen zusammengeführt werden sollen, und haben das Präfix dieselben Namen, gefolgt von einem deutlichen Trennzeichen.Sequenzen einzelner Kanäle aus einem Bild A werden z. B. bild A unterstrichen rot, Bild A unterstrichblau usw. Erstellen Sie im gleichen Ordner einen neuen Ordner pro Kanal, der zusammengeführt werden soll. Um beispielsweise rote, grüne und blaue Kanäle zusammenzuführen, erstellen Sie drei Ordner und speichern Sie die entsprechenden Sequenzen in diesen Ordnern.Verwenden Sie nur die Block-Merge-Kanäle, entfernen Sie die anderen Blöcke und speichern Sie das Protokoll als Mergekanäle. Zugriff auf die Boxen, um Parameter festzulegen. Wählen Sie im Feld Kanalnummer x aus, welchen Kanal extrahiert werden soll.In klassischen RGB-Bildern ist Null rot, eine grün und zwei blau. In der Box, Ordnerkanalnummer x, Backslash den Namen des Ordners mit Bildern von Kanal x. Im Feld separate Kanalnummer x.Die Trennzeichenverwendung für den Bildnamen. Geben Sie im Feld Farbzuordnungskanalnummer x mit einer Zahl an, welche Modellspalte verwendet werden soll, um den entsprechenden Kanal in Icy zu visualisieren. Schreiben Sie im Feld das Format der zusammengeführten Bilder, um die Erweiterung zu speichern, um zusammengeführte Bilder zu speichern.Klicken Sie in der oberen linken Ecke des Merge-Kanäle-Blocks auf den Link direkt rechts vom Ordner. Doppelklicken Sie im geöffneten Dialogfeld auf den Ordner mit Sequenzen des ersten Kanals, der im Box-Ordner-Kanal Nummer eins definiert wurde. Klicken Sie dann auf öffnen, führte das Protokoll aus.Zusammengeführte Bilder werden in einem zusammengeführten Ordner im selben Verzeichnis wie die Ordner der einzelnen Kanäle gespeichert. Objektsegmentierung ist der anspruchsvollste Schritt in der Bildanalyse. Seine Effizienz bestimmt die Genauigkeit der resultierenden Mengenmessungen.Daher integriert der Strukturanalysator sowohl einfache als auch komplexere Algorithmen, um verschiedene Alternativen vorzuschlagen, die an die Bildkomplexität und die Benutzeranforderungen angepasst sind. Wenn Sich Objekte nicht berühren, müssen andere Benutzer die Blocksegmentierung A nicht individuell unterscheiden. Wenn sich Objekte nicht berühren, sich aber einige befinden sich in unmittelbarer Nähe, verwenden Sie die Blocksegmentierung B. Verwenden Sie für Objekte mit einer hohen Clusterebene und einer konvexen Form die Blocksegmentierung C.Wenn Objekte eine hohe Clusterebene aufweisen und unregelmäßige Formen aufweisen. verwenden Sie die Blocksegmentierung D.Verwenden Sie die Blocksegmentierung in Cluster-Zytoplasma, um berührendes Zytoplasma einzeln zu segmentieren, indem Sie segmentierte Kerne als Marker verwenden. Die Blockanpassung für die primäre Objektsegmentierung kann unabhängig voneinander verarbeitet werden, sodass mehrere Blöcke in derselben Ausführung verwendet werden können, um ihre Effizienz für eine bestimmte Unterstruktur zu vergleichen oder um verschiedene Arten von Unterstrukturen zu segmentieren.Um die Segmentierung zu veranschaulichen, wurde die Blocksegmentierung B ausgewählt, die für eine größere Anzahl von Problemen geeignet ist. So verwenden Sie diesen Blog. Verknüpfen Sie ihn zunächst, um den Ordner auszuwählen.Dann setzt das Kanalsignal den Kanal des Objekts auf Segment. Um z. B. dem B entsprechen zu können, legen Sie in Feld HK den Parameter Intensitätsklassen und die ungefähren minimalen und maximalen Größen in Pixeln der zu erkennenden Objekte fest. Bei Intensitätsklassen klassifiziert ein Wert von zwei Pixeln in zwei Klassen, Hintergrund und Vordergrund.Es wird somit angepasst, wenn der Kontrast zwischen den Objekten und dem Hintergrund hoch ist. Wenn Vordergrundobjekte ihre Ursprungsintensitäten haben oder der Kontrast zum Hintergrund gering ist, erhöhen Sie die Anzahl der Klassen. Im Kasten optimieren aktive Konturen die Erkennung von Objektrahmen.Während des Vorgangs wird ein Ordner erstellt, um Bilder von segmentierten Objekten zu speichern. Benennen Sie diesen Ordner im Feldtext, z. B. Segmentierungskerne. Um das Format zum Speichern von Bildern segmentierter Objekte festzulegen, füllen Sie das Feldformat von Bildern segmentierter Objekte aus, und führte das Protokoll aus.Der Ordner wird in dem Ordner erstellt, der zusammengeführte Bilder enthält. Verschiedene Blöcke wurden entwickelt, um sich an die Anzahl der Gesetze und Kanäle und Zellabteile anzupassen, die in segmentierten Objekten analysiert werden sollen. Wählen Sie im folgenden Beispiel für die Analyse die Blockfluoreszenzanalyse P.Zwei Kanäle im selben Fach aus, und verknüpfen Sie sie, um den Ordner auszuwählen.Der Segmentierungsblock sollte verarbeitet worden sein, bevor diese Analyse die Parameter Posteingangsordner-Images ROI festgelegt hat, schreiben Sie den Namen des Ordners, der Bilder von segmentierten Objekten enthält, denen ein umgekehrter Schrägstrich vorangestellt ist. Posteingangsformat von Bildern segmentierter Objekte, schreiben Sie das Format verwendet, um Bilder von segmentierten Objekten zu speichern. Posteingang tötet Rahmen, um beide Objekte zu entfernen.Andernfalls ist gerade jetzt die Installation der vollständigeren J-Sammlung von Bildgebung erforderlich, um diese Funktion zu verwenden. In Boxen Kanal-Spot-Signal, stellen Sie den Kanal, wo Spots erkannt werden müssen. In klassischen RTP-Bildern ist Null rot Eins ist grün und zwei blau.Schreiben Sie in Felder, die den Namen des lokalisierten Moleküls nennen, den Namen des Moleküls, das sich in die Flecken lokalisiert. Die Anzahl der zu beantwortenden Felder hängt von der Anzahl der Moleküle ab. Legen Sie in Boxen Wellenlängen pro Detektorblock die Spot-Erkennungsparameter für jeden einzelnen Kanal fest.Um verschiedene Blöcke in einem Raum zu verarbeiten, halten Sie Verbindungen der ausgewählten Blöcke, mit dem Block wählen Ordner. Stellen Sie sicher, dass ihre Ränge unter der guten Verarbeitung des Workflows liegen. Bevor Sie den Workflow ausführen, wird auch empfohlen, nicht verwendete Blöcke zu entfernen und das neue Protokoll unter einem anderen Namen zu speichern.Klicken Sie auf Ausführen, um den Workflow zu starten. Wenn es öffnet Blick Blick Bücher erscheint. Doppelklicken Sie auf den Ordner mit den Pflegebildern Dann klicken Sie auf Öffnen, der Workflow wird automatisch ausgeführt.Wenn die Verarbeitung abgeschlossen ist, wird der erfolgreich ausgeführte Workflow in der unteren rechten Ecke angezeigt, alle Blöcke werden mit dem grünen Vorzeichen gekennzeichnet. Wenn nicht, zeigen der Block und das innere Feld, das das Pfeilzeichen darstellt, die Elemente korrekt an. Wichtig ist, dass mehrere Displays es ermöglichen, die Zwischenergebnisse während jeder Ausführung zu visualisieren, um die Verarbeitung zu steuern.Die Schnelligkeit, Flexibilität und Funktionalität dieses Workflows wird auf verschiedene Beispiele beschränkt. In diesem ersten Beispiel analysieren wir die kernnukleare Translokation von NF kappa B.After Simulation mit zunehmenden Konzentrationen von TNF alpha. Kerne und Zytoplasma wurden mit Segmentierungsblöcken C und E abgegrenzt.Das NF kappa B flourish in signal wurde mit dem globalen Translokationsanalyseblock analysiert. Mehr als 40.000 Zellen in 96 Bildern wurden in 26 Minuten analysiert. Die generierten Daten wurden verwendet, um diese Dosis-Ansprech-Kurve zu ermitteln, die die Induktion der NF Kappa B-Atomtranslokation durch TNF alpha zeigt.Der Workflow kann auch verwendet werden, um die Dateigröße zu erkennen und bestimmte Informationen zu ihren Features zu extrahieren. Hier wurden Eigenschaften in einzelnen Zellen durch Lokalisierung der EDC für Protein etektiert. Kerne im Zytoplasma wurden mit Segmentierungsblöcken A und E abgegrenzt.EDC4 wurde mit Fluoreszenzanalyseblöcken analysiert C.In dieses Beispiel wurden in beiden analysierten Zellen zytoplasmatisches EDC4-Zeichen nachgewiesen. Die Größe in Pixeln jeder vollständigen Seite wird in der Kalkulationstabelle angegeben. In diesem Beispiel nutzten wir die Vielseitigkeit des Workflows, um Kohlenhydrate zu untersuchen, eine längere Kinetik von oxidativem Stress.Kernkraftzeichen von Coilin sind die wichtigsten strukturellen Komponenten von Kohlenhydraten Ihre Anzahl und Größe wurden nach Größe, Stressstatus analysiert, bewertet durch Doppelstrangbrüche lokalisiert mit 53BP1. Die Kerne wurden mit Hilfe von Segmentierungsproxy, Kernkraft und Signalen von Coillin und 53BP1 abgegrenzt, gleichzeitig mit Fluoreszenzanalyse Block B analysiert. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass oxidativer Stress die Kernkraft eines Kohlenhydrats verändert, wenn es darum geht, eine kerntechnische Plasmische Verteilung in die Anzahl der kleineren Kernstoffe zu verwenden, um eine Änderung der Pulsinexpression zu rechtfertigen, die seine Lokalisierung verändern und die Keimbildung von Kurvenkörpern verändern könnte.Ein exogenes GFP-Spulen-Fusionsprotein wurde überexprimiert. Merkmale unseres Körpers wurden nach GFP-Spulen-Überexpression analysiert. Die Kerne wurden mit dem Segmentierungsblock A abgegrenzt. Die fluoreszierenden Signale von Coilin und GFP Coilin wurden gleichzeitig mit fluoreszenzanalyseblock B analysiert.Die durch den Substrukturanalysator erzeugten Daten zeigen, dass GFP-Spulen in Überexpression die Größe und Anzahl der Kohlenhydrate signifikant erhöht. Da oxidativer Stress die Anzahl der Kohlenhydrate erhöht, aber ihre Größe reduziert. Diese Daten könnten widerspiegeln, dass oxidative Stresswirkung auf die Struktur von Kohlenhydraten höchstwahrscheinlich durch eine Änderung ihrer Zusammensetzung und nicht durch eine Auswirkung auf eine bestimmte Menge an Coilin induziert wird.Daher ist der Strukturanalysator ein hochmodularer Workflow für die Biobildanalyse. Es kann an mehrere Kontexte angepasst werden, von der einfachen Verschmelzung von Kanälen bis zur Quantifizierung mehrerer Etagen und Signale in Tausenden von Zellen. Es integriert auch einfache und komplexe Segmentierungsalgorithmen in Abhängigkeit von der Bildkomplexität und automatisiert die Extraktion von fluoreszierenden Signalfunktionen.

Research

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Biotechnik

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