Name: substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

G.H. היתה נתמכת על-ידי מלגת מוסמכים מבית המיניצ ' א-לה-שרצ'ה וטכנולוגיות עזר. L.H. היה נתמך על ידי מלגת בוגר מכון דה Cancérologie דה לוריין (כיל), בעוד שקט היה נתמך על ידי מענק ציבורי תנוהלנה על ידי סוכנות המחקר הלאומי הצרפתית (ANR) כחלק השני "הבדיקה של התוכנית" להילחם-HF (התייחסות: ANR-15-RHU4570004). עבודה זו ממומנת על ידי CNRS ואוניברסיטת דה לוריין (UMR 7365).

הערה: הדרכות ידידותיות למשתמש זמינות באתר האינטרנט של אייסי http://icy.bioimageanalysis.org.
1. הורד אייסי ואת פרוטוקול מנתח מבנה משנה
<ol><li>הורד אייסי מהאתר קרח (http://icy.bioimageanalysis.org/download) ולהוריד את מבנה המשנה פרוטוקול מנתח : http://icy.bioimagea...

<ol>
	<li>M&#246;ckl, L., Lamb, D. C., Br&#228;uchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolved+fluorescence+microscopy:+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig,+Stefan+Hell,+and+William+E.+Moerner.">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li><li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imagining+the+future+of+bioimage+analysis.">Imagining the future of bioimage analysis.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).</li><li>Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., M&#252;nzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+free+software+tools+for+image+analysis+of+fluorescence+cell+micrographs.">Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs.</a> Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+image+analysis+using+NIH+Image/ImageJ.">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).</li><li>Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+on+image+segmentation+techniques.">Survey on image segmentation techniques.</a> Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).</li><li>. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy">https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy</a> (2018)</li><li>. NIS-Elements Imaging Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014)</li><li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+segmentation.">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress.">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>D'Autr&#233;aux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+as+signalling+molecules:+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews.">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+Cell+Senescence,+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases.">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53.">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li><li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2&#946;+(SFRS10)+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells.">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2&#946; (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene.">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+Structure+and+Function.">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation.">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation.">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+3.0:+Next-generation+image+processing+for+biology.">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).</li></ol>

מספר גדל והולך של כלי תוכנה חופשית זמינים לניתוח של תמונות תאים פלואורסצנטית. משתמשים חייבים לבחור בצורה נכונה את התוכנה הנאותה בהתאם למורכבות הבעייתי שלהם, לידע שלהם בעיבוד התמונה, ולזמן שהם רוצים להשקיע בניתוח שלהם. אייסי, CellProfiler, או ImageJ/פיג'י הם כלים רבי-עוצמה המשלבים הן שימושיות והן פו?...

מיקרוסקופ אור, במיוחד יותר, מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית חזקים ומגוונים בשימוש נפוץ במדעי הביולוגיה. הם נותנים גישה ללוקליזציה מדויקת של biomolecules שונים כמו חלבונים או RNA באמצעות תיוג פלורסנט ספציפי שלהם. העשור האחרון התאפיין בהתקדמות מהירה בטכנולוגיות המיקרוסקופיה והדמיה כפי שמעידים על ידי פרס נובל לכימיה ב-2014 בשנת, הענקת אריק באזיג, סטפן ויליאם א. מוינר לפיתוח מיקרוסקופ הקרינה הסופר-מפוענח (SRFM)1. SFRM עוקף את המגבלה העקיפה של מיקרוסקופ אופטי מסורתי כדי להביא אותו לתוך הננו-ממד. שיפור בטכניקות כגון הדמיה חיה או גישות לסינון תפוקה גבוהה גם מגביר את הכמות ואת מורכבות הנתונים לטיפול בכל ניסוי. רוב הזמן, החוקרים מתמודדים עם אוכלוסיות הטרוגנית גבוהה של תאים ורוצה לנתח פנוטיפים ברמה תא יחיד.
בתחילה, ניתוחים כגון ספירת וקדי בוצעו על ידי עין, אשר מועדף על ידי כמה חוקרים שכן הוא מספק שליטה ויזואלית מלאה על תהליך הספירה. עם זאת, ניתוח ידני של נתונים כאלה ארוך מדי, מוביל לשונות בין משקיפים, ואינו מספק גישה לתכונות מורכבות יותר כך שגישות באמצעות מחשב הופכות לשימוש נרחב וכמעט בלתי נמנע2. שיטות האינפורמטיקה של bioimage מגדילות באופן משמעותי את היעילות של ניתוח נתונים וחופשיות מהמסובייקטיביות הבלתי נמנעים ומהתטיות הפוטנציאליות של ניתוח הספירה הידנית. הביקוש המוגבר בתחום זה ושיפור כוח המחשב הובילו לפיתוח מספר רב של פלטפורמות ניתוח תמונה. חלקם זמינים באופן חופשי ומעניקים גישה לכלים שונים לביצוע ניתוח עם מחשבים אישיים. סיווג של כלי גישה פתוחה הוקמה לאחרונה3 ו מציג אייסי4 כמו תוכנה רבת עוצמה המשלבת שימושיות ופונקציונליות. יתר על כן, הקרח יש את היתרון של תקשורת עם ImageJ.
עבור משתמשים ללא מומחיות ניתוח תמונה, המכשולים העיקריים הם לבחור את הכלי המתאים בהתאם לפרמטרים בעייתיים כראוי המנגינה כי הם לעתים קרובות לא מובנים היטב. יתר על כן, זמני ההתקנה הם לעתים קרובות ארוך. אייסי מציע ממשק ידידותי למשתמש נקודה-and-לחץ בשם "פרוטוקולים" כדי לפתח זרימת עבודה על ידי שילוב כמה התוספים שנמצאו בתוך אוסף ממצה4. עיצוב מודולרי גמיש וממשק נקודת-ולחיצה להפוך את הגדרת ניתוח ריאלי עבור שאינם מתכנתים. כאן אנו מציגים זרימת עבודה בשם מנתח מבנה משנה, שפותחה בממשק של קרח, שתפקידו לנתח אותות פלורסנט בתאים סלולריים ספציפיים למדוד תכונות שונות כמו בהירות, מספר וקדי, גודל וקדי, והפצה מרחבית. זרימת עבודה זו מטפלת במספר בעיות כגון כימות הטרנסלוקציה של האות, ניתוח של תאים מזוהמים המבטא כתב פלורסנט, או ניתוח של וקדי ממבני משנה סלולריים שונים בתאים בודדים. הוא מאפשר את העיבוד הסימולטני של תמונות מרובות, ותוצאות הפלט מיוצאות לגליון עבודה המופרד בטאבים שניתן לפתוח בתוכניות גיליון אלקטרוני נפוצות.
צינור מנתח מבנה משנה מוצג באיור 1. ראשית, כל התמונות הכלולות בתיקיה שצוינה מעובדות מראש כדי לשפר את האות שלהם ליחס הרעש. שלב זה מגדיל את היעילות של השלבים הבאים ומקטין את זמן הריצה. לאחר מכן, אזורי הריבית (ROIs), המתאימים לאזורי התמונה שבהם יש לזהות את אות הפלורסנט, מזוהים ומחולקים. לבסוף, אות הפלורסנט מנותח והתוצאות מיוצאות לגליון עבודה מופרד באמצעות טאבים.
פילוח של אובייקט (זיהוי גבולות) הוא הצעד המאתגר ביותר בניתוח תמונה, והיעילות שלה קובעת את הדיוק של מדידות התא המתקבלות. האובייקטים הראשונים המזוהים בתמונה (המכונים אובייקטים ראשוניים) הם לעתים קרובות גרעינים מדימויים מוכתמים DNA (DAPI או כתמים), אם כי אובייקטים ראשוניים יכולים להיות גם תאים שלמים, חרוזים, ספאקלס, גידולים, או כל חפץ מוכתם. ברוב התמונות, התאים או הגרעינים הביולוגיים נוגעים זה בזה או חופפים הגורמים לאלגוריתמים פשוטים ומהירים להיכשל. עד היום, אין אלגוריתם אוניברסלי יכול לבצע פילוח מושלם של כל האובייקטים, בעיקר בגלל המאפיינים שלהם (גודל, צורה, או מרקם) לווסת את היעילות של פילוח5. כלי הפילוח המופצים בדרך כלל עם תוכנות מיקרוסקופית (כגון תוכנת הדמיה של המכונות המולקולריות על-ידי מכשירים מולקולריים6, או התוכנה המתקדמת בתחום המחקר של ניקון7) מבוססות בדרך כלל על טכניקות סטנדרטיות כגון התאמת מתאם, סף או פעולות מורפולוגיות. למרות היעילות במערכות בסיסיות, שיטות מוגדרות מאוד אלה מציגות במהירות מגבלות כאשר נעשה בהן שימוש בהקשרים מאתגרים ומדויקים יותר. ואכן, פילוח הוא רגיש מאוד לפרמטרים ניסיוניים כגון סוג תא, צפיפות תאים או סמנים, ולעתים קרובות דורש התאמה חוזרת עבור ערכת נתונים גדולה. זרימת העבודה של מנתח מבנה המשנה משלבת אלגוריתמים פשוטים ומתוחכמים יותר כדי להציע חלופות שונות המותאמות למורכבות התמונה ולצורכי המשתמש. זה בעיקר מציע את האלגוריתם מבוסס סימן הפרשת הצבע8 עבור אובייקטים באשכולות מאוד. היעילות של שיטת פילוח זו מסתמכת על הבחירה של סמנים בודדים בכל אובייקט. סמנים אלה נבחרים באופן ידני ברוב הזמן כדי לקבל פרמטרים נכונים עבור פילוח מלא, המהווה זמן רב מאוד כאשר משתמשים מתמודדים עם מספר גבוה של אובייקטים. מנתח מבנה משנה מציע זיהוי אוטומטי של סמנים אלה, מתן תהליך רב מאוד יעיל פילוח. פילוח הוא, ברוב הזמן, את השלב המגביל של ניתוח תמונה והוא יכול לשנות במידה ניכרת את זמן העיבוד בהתאם לרזולוציה של התמונה, מספר האובייקטים לכל תמונה, והרמה של קיבוץ של אובייקטים. קווי צינורות טיפוסיים דורשים מספר שניות עד 5 דקות לכל תמונה במחשב שולחני רגיל. ניתוח של תמונות מורכבות יותר יכול לדרוש מחשב חזק יותר וכמה ידע בסיסי בניתוח תמונה.
הגמישות והפונקציונליות של זרימת עבודה זו מומחשות עם דוגמאות שונות בתוצאות הנציגים. היתרונות של זרימת עבודה זו מוצגים בעיקר באמצעות המחקר של מבני משנה גרעינית תחת לחץ חמצוני (OS) תנאים. מערכת ההפעלה מקבילה חוסר איזון של הומאוסטזיס החמצון לטובת חמצון והוא קשור עם רמות גבוהות של מינים חמצן תגובתי (ROS). מאז רוס לפעול כמו מולקולות איתות, שינויים בריכוז שלהם לוקליזציה subcellular להשפיע באופן חיובי או שלילי מספר עצום של מסלולים ורשתות המסדירים פונקציות פיזיולוגיות, כולל התמרה אותות, מנגנוני תיקון, ביטוי גנים, מוות תאים, והתפשטות9,10. מערכת ההפעלה היא אפוא מעורב ישירות בפתווגיות שונות (נוירוניווניות ומחלות לב וכלי דם, סרטן, סוכרת, וכו '), אלא גם הזדקנות תאית. לכן, פענוח ההשלכות של מערכת ההפעלה על הארגון של התא האנושי ותפקוד מהווה צעד מכריע בהבנת התפקידים של מערכת ההפעלה בתחילת ופיתוח של הפתווגיות האדם. הוא הוקם כי מערכת ההפעלה מווסת ביטוי גנים על ידי שעתוק מודולים דרך מספר גורמים שעתוק (p53, Nrf2, FOXO3A)11, אבל גם על ידי השפעה על הרגולציה של מספר תהליכים שיתוף ושלאחר ההמרה כגון שחבור חלופיים (as) של טרום rnas12,13,14. שחבור אלטרנטיבי של קידוד ראשוני התעתיקים שאינם קידוד הוא מנגנון חיוני המגביר את קיבולת הקידוד של הגנום על ידי הפקת תעתיק. כפי שהוא מבוצע על ידי מורכב מסובך גדול הנקרא מתחת לפני הזמן, המכיל כמעט 300 חלבונים ו 5 U-עשיר גרעיני קטן RNAs (UsnRNAs)15. הרכבה ספצאומין וכמו הם נשלט באופן הדוק בתאים וכמה צעדים של התבגרות מלבין מתרחשים בתוך תאים גרעיניים פחות ממברנה בשם Cajal גופים. מבני המשנה הגרעיניים הללו מאופיינים באופי הדינמי של המבנה שלהם ובקומפוזיציה שלהם, אשר מתנהלים בעיקר על ידי אינטראקציות רב-הדדיות של רכיבי ה-RNA והחלבון שלהם עם האוסף החלבונים. ניתוח של אלפי תאים עם זרימת העבודה של מנתח מבנה משנה מותר לאפיון של השפעות מעולם לא תיאר של מערכת ההפעלה על Cajal גופים. אכן, השיג נתונים מראים כי מערכת ההפעלה משנה את התגרלות של Cajal הגופים, גרימת הפצה משנה של היווצרות החלבון לתוך foci גרעיני קטן. שינוי כזה של מבנה של הגופים Cajal עלול להשפיע על ההבשלה של הספצאוחלק ולהשתתף אפנון כמו מערכת ההפעלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1105px;" width="1104">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">28908</td>
			<td style="width:472px;">to fix the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11008</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21425</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A34055</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Bovine serum albumin standard (BSA)</td>
			<td style="width:183px;">euromedex</td>
			<td style="width:137px;">04-100-812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D5796-500ml</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040-5ML</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human: HeLa S3 cells</td>
			<td>IGBMC, Strasbourg, France</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>cell line used to perform the experiments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">H1009-100ml</td>
			<td>used as a stressing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Mouse monoclonal anti-coilin</td>
			<td style="width:183px;">abcam</td>
			<td style="width:137px;">ab11822</td>
			<td>Coilin-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>epifluoresecence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">PBS pH 7.4 (10x)</td>
			<td style="width:183px;">gibco</td>
			<td style="width:137px;">70011-036</td>
			<td>to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Rabbit polyclonal anti-53BP1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-16565</td>
			<td>53BP1-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit polyclonal anti-EDC4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4200114</td>
			<td>EDC4-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683</td>
			<td>to permeabilize the cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images

העשור האחרון התאפיין בפריצות דרך בטכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מומחשות באמצעות שיפור ברזולוציה מרחבית, אלא גם בהדמיית תא חי וטכניקות מיקרוסקופ בתפוקה גבוהה. זה הוביל לעלייה מתמדת בכמות ובמורכבות של נתוני המיקרוסקופיה לניסוי בודד. מכיוון ניתוח ידני של נתונים מיקרוסקופ הוא זמן רב מאוד, סובייקטיבי, ואוסר ניתוחים כמותיים, אוטומציה של ניתוח bioimage הופך כמעט בלתי נמנע. בנינו זרימת עבודה של אינפורמטיקה שנקראת מנתח מבנה משנה כדי להפוך באופן מלא ניתוח אותות לאוטומטי בתמונות bioimages מיקרוסקופ פלורסנט. זרימת עבודה זו מפותחת בפלטפורמת הקוד הפתוח של המשתמש ומסתיימת בפונקציונליות של ImageJ. היא כוללת את העיבוד מראש של תמונות כדי לשפר את האות ליחס הרעש, פילוח בודדים של תאים (זיהוי של גבולות התא) ואת זיהוי/קוונפיקציה של גופי תא מועשר בתאי תאים ספציפיים. היתרון העיקרי של זרימת עבודה זו הוא להציע פונקציונליות ביו-הדמיה מורכבת למשתמשים ללא התמחות בניתוח תמונה באמצעות ממשק ידידותי למשתמש. יתר על כן, הוא מודולרי מאוד ומותאם למספר סוגיות מתוך אפיון טרנסלוקציה גרעינית/cytoplasmic לניתוח השוואתי של גופי תאים שונים במבנים סלולריים שונים. הפונקציונליות של זרימת עבודה זו מומחש דרך המחקר של הגופים Cajal (מפותל) תחת לחץ חמצוני (OS) תנאים. נתונים ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית מראים כי היושרה שלהם בתאים אנושיים מושפע כמה שעות לאחר אינדוקציה של מערכת ההפעלה. אפקט זה מאופיין על ידי ירידה של לאסוף את הנוקלאוציה לתוך הגופים Cajal אופייני, הקשורים עם הפצה מחודש של הצמדה של האוסף לתוך מספר גדל של foci קטן. התפקיד המרכזי של הרכב בבורסה בין רכיבי CB לבין הנואופלזמה מרמז כי מערכת ההפעלה הנגרמת מהפצה מראש של האוסף עלולה להשפיע על הקומפוזיציה ועל הפונקציונליות של Cajal הגופים.

כל הניתוחים שתוארו בוצעו על מחשב נייד רגיל (64 סיביות, ארבע ליבות מעבד ב 2.80 GHz עם 16 GB זיכרון גישה אקראית (RAM)) עבודה עם גירסת 64-bit של Java. זיכרון גישה אקראית הוא פרמטר חשוב שיש לשקול, בהתאם לכמות ולרזולוציה של תמונות לצורך ניתוח. באמצעות גירסת 32-bit של Java מגבילה את הזיכרון כ 1300 MB, אשר יכול להיות בלתי מ...

Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

אנו מציגים זרימת עבודה זמינה בחופשיות שנבנתה לחיפוש מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתאי תא ספציפיים בתמונות מיקרוסקופית הקרינה. זרימת עבודה ידידותית למשתמש זו מיועדת לתוכנה הפתוחה בקוד הפתוח אייסי ומשתמשת גם בפונקציות ImageJ. הצינור הוא במחיר סביר ללא ידע בניתוח תמונה.

מנתח מבנה משנה: זרימת עבודה ידידותית למשתמש לחקר מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

מנתח מבנה משנה הוא זרימת עבודה ידידותית למשתמש המבצעת ניתוח אוטומטי של מדדי מיקרוסקופיה של תהליכים מרובים. זה לא אומר אפס טונות של קרח תוכנת קוד פתוח וגם באמצעות פונקציות מכונה. חשוב לציין, זרימת עבודה זו היא אתר נופש במחיר סביר לייצר ידע וניתוח תמונות.תמונות מרובות ערוצים נטענות בתוך זרימת העבודה ומעובדות מראש כדי לשפר את יחס האות לרעש ולהסיר הדמיה או פגמים. לאחר מכן, פילוח תמונה מבודד אזורים מעניינים, הידועים גם בשם ROIs מהרקע. מספר שיטות פילוח זמינות בהתאם לרמת הקיבוץ באשכולות ולאופי האובייקטים המעניינים.אובייקטים מקופלים נשמרים עם מתאר ספציפי בתיקיה ספציפית. כוח ואותות מנותחים לאחר מכן בתוך השורות ותכונות מרובות כגון מיקום, גודל, צורה במרקמי צפיפות אך מספר וגודל מיוצאים לגיליון אלקטרוני שנוצר באופן אוטומטי. הורד קרח מאתר האינטרנט של הקרח.לאחר מכן הורד פרוטוקול מנתח מבנה משנה מספריית הפרוטוקולים הקפואה. פתח את קרח ולחץ על כלים בתפריט רצועת הכלים. לחץ על פרוטוקולים כדי לפתוח את ממשק עורך הפרוטוקולים.לחץ על עומס ולפתוח את מנתח מבנה המשנה של הפרוטוקול. טעינת פרוטוקול יכולה להימשך מספר שניות. זרימת העבודה מורכבת מ- 13 בלוקים כלליים שכל בלוק עובד כצינור המורכב ממספר תיבות המבצעות תת פעילויות ספציפיות.כל בלוק או תיבה ממוספרים ויש להם דירוג ספציפי בתוך זרימת העבודה. על ידי לחיצה על מספר זה, להקצות את המיקום הקרוב ביותר האפשרי הראשון לבלוק שנבחר. מיקומם של הבלוקים האחרים מאורגן מחדש.על ידי לחיצה על סמל הפינה השמאלית העליונה, ניתן לכווץ את הבלוק. ניתן גם להגדיל, לצמצם או להסיר אותו. כל צינור של זרימת העבודה הוא נכון התעורר על ידי רשת של תיבות המחוברות יחד על ידי קלט ופלט אחרים.כדי ליצור חיבור, לחץ על פלט ושמור עד שהסמן יתייחס לקלט כלשהו. ניתן להסיר חיבורים על-ידי לחיצה על תג הפלט. במידת הצורך שנה את שמות הקבצים כך שימוזגו רצפים, יש את אותה קידומת שמות ואחריה מפריד נפרד.לדוגמה, רצפים של ערוצים בודדים מתמונה A נקראים תמונה מקף תחתון אדום, תמונה A מקף תחתון כחול וכן הלאה. באותה תיקיה, צור תיקיה חדשה לכל ערוץ למיזוג. לדוגמה, כדי למזג ערוצים אדומים, ירוקים וכחולים, צור שלוש תיקיות ואחסן את הרצפים המתאימים בתוך תיקיות אלה.השתמש רק בערוצי מיזוג הבלוקים, הסר את הבלוקים האחרים ושמור את הפרוטוקול כערוצי מיזוג. גישה לתיבות כדי להגדיר פרמטרים. בתיבה , ערוץ מספר x, בחר איזה ערוץ לחלץ.בתמונות RGB קלאסיות, אפס הוא אדום, אחד ירוק ושניים כחולים. בתיבה , תיקייה ערוץ x, קו חזור על שם התיקיה המכילה תמונות של ערוץ x. בתיבה , הפרד בין ערוץ מספר x.השימוש במפריד עבור שם תמונה. בתיבה , מפת צבע ערוץ מספר x, ציין עם מספר באיזו עמודת מודל להשתמש כדי להמחיש את הערוץ המתאים ב- Icy. בתיבה , עיצוב של תמונות ממוזגות, כתוב את ההרחבה לשמירת תמונות ממוזגות.בפינה השמאלית העליונה של בלוק ערוצי המיזוג, לחץ על הקישור ישירות מימין לתיקיה. בתיבת הדו-שיח הפתוחה שמופיעה, לחץ פעמיים על התיקיה המכילה רצפים של הערוץ הראשון שהוגדרו בערוץ מספר אחת של תיקיית התיבה. לאחר מכן לחץ על פתוח, רץ הפרוטוקול.תמונות ממוזגות נשמרות בתיקיה ממוזגת באותה ספריה כמו התיקיות של ערוצים בודדים. פילוח אובייקטים הוא השלב המאתגר ביותר בניתוח תמונה. יעילותו קובעת את הדיוק של המדידות שנקבעו כתוצאה מכך.לכן, מנתח המבנה משלב אלגוריתמים פשוטים ומורכבים יותר כדי להציע חלופות שונות המותאמות למורכבות התמונה וצווים של המשתמש. אם אובייקטים אינם נוגעים זה בזה, משתמש אחר אינו צריך להבדיל בין אובייקטים מקובצים באשכולות בנפרד להשתמש פילוח בלוק A.כאשר אובייקטים אינם נוגעים זה בזה, אבל חלק מהם נמצאים בסמיכות, להשתמש פילוח בלוק B.For אובייקטים עם רמת קיבוץ באשכולות גבוהה צורה קמצוץ, להשתמש פילוח בלוק C.If אובייקטים מציגים רמת קיבוץ באשכולות גבוהה יש צורות לא סדירות השתמש בפילוח הבלוק D.השתמש בפילוח הבלוקים בציטופלסמה של אשכולות כדי לגעת בציטופלסמה בנפרד באמצעות גרעינים מקופלים כסמנים. בלוק מסתגל עבור פילוח אובייקט ראשי יכול לעבד באופן עצמאי, כך שניתן יהיה להשתמש במספר בלוקים באותה ריצה כדי להשוות את היעילות שלהם עבור מבנה משנה מסוים, או כדי למקטע סוגים שונים של מבני משנה.כדי להמחיש פילוח, פילוח הבלוקים B, שיתאים למספר גדול יותר של בעיות נבחר. כדי להשתמש בבלוג הזה. תחילה, קשר אותו לתיקיה שנבחרה.לאחר מכן, מפעיל אות ערוץ להגדיר את הערוץ של האובייקט למקטע. לדוגמה, כדי להתאים ל- B, בתיבה HK פירושו, הגדר את הפרמטר מחלקות אינטנסיביות ואת הגדלים המינימליים והמקסימום המשוערים בפיקסלים של אובייקטים שיש לזהות. עבור מחלקות אינטנסיביות, ערך של שניים יסווג פיקסלים בשתי מחלקות, רקע וקדמה.לכן הוא מותאם כאשר הניגוד בין האובייקטים והרקע גבוה. אם לאובייקטים בקידמה יש את התעצמות מקורותיהם, או אם רמת הניגודיות ברקע נמוכה, הגדל את מספר הכיתות. בקווי מתאר פעילים בתיבה ממטבים את הזיהוי של גבולות אובייקטים.במהלך התהליך, תיקייה תיווצר כדי לשמור תמונות של אובייקטים מקולחים. בטקסט תיבה, תן שם לתיקיה זו, לדוגמה, לגרעין פילוח. כדי להגדיר את התבנית לשמירת תמונות של אובייקטים מקולחים, מלא את תבנית התיבה של תמונות של אובייקטים מקולחים, הריץ את הפרוטוקול.התיקיה נוצרת בתיקיה המכילה תמונות ממוזגות. בלוקים שונים פותחו כדי להתאים את מספר החוקים והערוצים ותאי התאים שיש לנתח באובייקטים מקולחים. בדוגמה הבאה, עבור הניתוח, בחר את ניתוח פלואורסצנטיות בלוק P.Two ערוצים באותו תא ולקשר אותו לתיקיה לבחור.בלוק הפילוח היה צריך להיות מעובד לפני ניתוח זה להגדיר את הפרמטרים בתיבת הדואר הנכנס תמונות תיקיית ROI, לכתוב את שם התיקיה המכילה תמונות של אובייקטים מקופלים לפני קו ישר. תבנית תיבת דואר נכנס של תמונות של אובייקטים מקולחים, כתוב את התבנית המשמשת לשמירת תמונות של אובייקטים מקולחים. תיבת הדואר הנכנס הורגת גבולות כדי להסיר את שני האובייקטים.אחרת, כרגע, ההתקנה של אוסף J מלא יותר של הדמיה נדרש להשתמש בפונקציה זו. בתיבות ערוץ אות ספוט, להגדיר את הערוץ שבו כתמים יש לזהות. בתמונות RTP קלאסיות, אפס הוא אדום אחד ירוק ושניים כחולים.בתיבות שם של מולקולה מקומית, לכתוב את שם המולקולה לוקליזציה לתוך כתמים. מספר השדות שיש לענות תלוי במספר המולקולות. בתיבות אורכי גל לכל בלוק גלאי, הגדר פרמטרי זיהוי כתמים עבור כל ערוץ בודד.על מנת לעבד בלוקים שונים בחדר, שמור חיבורים של בלוקים שנבחרו, עם תיקיית בחירת הבלוקים. ודא שהדרגות שלהם נמוכות מהעיבוד הטוב של זרימת העבודה. לפני הפעלת זרימת העבודה, מומלץ גם להסיר בלוקים שאינם נמצאים בה שימוש ולשמור את הפרוטוקול החדש בשם אחר.לחץ על ריצה כדי להפעיל את זרימת העבודה. כאשר הוא פותח את העין נראה ספרים מופיעים. לחץ פעמיים על התיקייה המכילה את תמונות האחות ולאחר מכן לחץ על פתח, זרימת העבודה תרוץ באופן אוטומטי.אם העיבוד הושלם ההודעה, זרימת העבודה שבוצעה בהצלחה תופיע בפינה הימנית התחתונה, כל הבלוקים יעוצו בדגל עם הסימן הירוק. אם לא הבלוק והתיבה הפנימית המציגה את סימן החץ יציינו שהרכיבים נכונים. חשוב לציין, מספר צגים מאפשרים להמחיש את תוצאות הביניים במהלך כל ריצה כדי לשלוט בעיבוד.המהירות, הגמישות והפונקציונליות של זרימת עבודה זו יוגבלו לדוגמאות שונות. בדוגמה ראשונה זו, אנו מנתחים את טרנסלוקציה גרעינית של NF קאפה B.After סימולציה עם ריכוזים הולכים וגדלים של אלפא TNF. גרעינים וציטופלסמה היו קווי שימוש בלוקים C ו- E.NF קאפה B לפרוח אות נותחו באמצעות בלוק ניתוח טרנסלוקציה גלובלי. יותר מ-40,000 תאים ב-96 תמונות נותחו ב-26 דקות. הנתונים שנוצרו שימשו כדי להקים עקומת תגובה זו מינון מראה את האינדוקציה של טרנסלוקציה גרעינית NF קאפה B על ידי אלפא TNF.ניתן להשתמש בזרימת העבודה גם כדי לזהות גודל קובץ ולחלץ מידע ספציפי אודות התכונות שלהם. כאן, תכונות בתאים בודדים זוהו על ידי לוקליזציה של EDC לחלבון. גרעינים בציטופלסמה היו קווי שימוש בלוקים A ו- E.EDC4 נותח באמצעות בלוקים ניתוח פלואורסצנטי C.In זו, סימן EDC4 ציטופלסמי זוהו בשני התאים שנותחו. הגודל בפיקסלים של כל צד שלם ניתן בגיליון האלקטרוני. בדוגמה זו, ניצלנו את הרבגוניות של זרימת העבודה כדי לחקור פחמימות קינטיקה ארוכה יותר של מתח חמצוני.סימן כוח גרעיני של coilin הם המרכיבים המבניים העיקריים של פחמימות מספרם וגודלם נותחו על פי גודל, מצב מתח, מוערך על ידי שבירות גדיל כפול מקומי עם 53BP1. גרעינים היו delineated באמצעות פרוקסי פילוח, כוח גרעיני אותות של קולילין ו 53BP1, נותחו בו זמנית באמצעות ניתוח פלואורסצנטי בלוק B.באמצעות נתונים מ 2300 תאים בודדים, העדנו עלייה משמעותית של מספר האתר גרינפילד לאחר אינדוקציה מתח הקשורים לירידה בגודלם. נתונים אלה מצביעים על כך שלחץ חמצוני משנה את כוח הגרעין של פחמימות בשימוש בהתפלגות פלסמית גרעינית למספר גרעיני קטן יותר עבור האתר כדי להצדיק שינוי בביטוי הקוילין יכול לשנות את לוקליזציה שלו ולשנות את הגרעין של גופי עקומה.חלבון היתוך קוילין GFP אקסוגני היה מדוכא יתר על כן. תכונות של הגוף שלנו נותחו על פי רמת דיכוי יתר של קולין GFP. גרעינים היו delineated באמצעות בלוק פילוח A.The אותות פלואורסצנט של קולין ו GFP coilin, נותחו בו זמנית באמצעות בלוק ניתוח פלואורסצנטי B.The רמת overexpression של קולין GFP באה לידי ביטוי על ידי צפיפות המשמעות של אות GFP בגרעין בודד.נתונים שנוצרו על ידי מנתח מבנה משנה מראים כי קוילין GFP בלחץ יתר מגדיל באופן משמעותי את הגודל ואת מספר הפחמימות. מאז מתח חמצוני מגדיל את מספר הפחמימות אבל מקטין את גודלם. נתונים אלה עשויים לשקף כי השפעת מתח חמצוני על המבנה של פחמימות נגרמת ככל הנראה על ידי שינוי הרכב שלהם ולא על ידי השפעה על כמות מסוימת של coilin.אז מנתח מבנה הוא זרימת עבודה מודולרית מאוד לניתוח תמונה ביולוגית. זה יכול להיות מותאם למספר הקשרים ממיזוג פשוט של ערוצים לכמות של קומות מרובות ואותות באלפי תאים. הוא גם משלב אלגוריתמי פילוח פשוטים ומורכבים בהתאם למורכבות התמונה ואוטומציה של מיצוי תכונות אות פלואורסצנטיות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

בעלות נמוכה cryo-Light Stage מיקרוסקופית ייצור עבור אור בקורלציה / מיקרוסקופית אלקטרונים

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

הכנת הדגימה, הדמיה, ניתוח הפרוטוקולים מיקרוסקופית סכין קצה סריקה

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק Cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...