Name: substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

G.H. ble støttet av en utdannet stipendiat fra Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. ble støttet av en utdannet stipendiat fra Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), mens Q.T. ble støttet av et offentlig stipend overvåket av det franske nasjonale forskningsbyrået (ANR) som en del av det andre "Investissements d'Avenir" -programmet FIGHT-HF (referanse: ANR-15-RHU4570004). Dette arbeidet ble finansiert av CNRS og Université de Lorraine (UMR 7365).

MERK: Brukervennlige opplæringsprogrammer er tilgjengelige på Icys nettsted http://icy.bioimageanalysis.org.
1. Last ned isete og substructure analyzer protokollen
<ol><li>Last ned isete fra Icy-nettstedet (http://icy.bioimageanalysis.org/download) og last ned Substructure Analyzer-protokollen: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest. MERK: Hv...

<ol>
	<li>M&#246;ckl, L., Lamb, D. C., Br&#228;uchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolved+fluorescence+microscopy:+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig,+Stefan+Hell,+and+William+E.+Moerner.">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li><li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imagining+the+future+of+bioimage+analysis.">Imagining the future of bioimage analysis.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).</li><li>Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., M&#252;nzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+free+software+tools+for+image+analysis+of+fluorescence+cell+micrographs.">Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs.</a> Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+image+analysis+using+NIH+Image/ImageJ.">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).</li><li>Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+on+image+segmentation+techniques.">Survey on image segmentation techniques.</a> Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).</li><li>. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy">https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy</a> (2018)</li><li>. NIS-Elements Imaging Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014)</li><li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+segmentation.">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress.">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>D'Autr&#233;aux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+as+signalling+molecules:+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews.">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+Cell+Senescence,+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases.">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53.">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li><li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2&#946;+(SFRS10)+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells.">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2&#946; (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene.">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+Structure+and+Function.">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation.">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation.">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+3.0:+Next-generation+image+processing+for+biology.">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).</li></ol>

Et økende antall gratis programvareverktøy er tilgjengelige for analyse av fluorescenscellebilder. Brukere må riktig velge tilstrekkelig programvare i henhold til kompleksiteten av deres problematiske, til deres kunnskap i bildebehandling, og til den tiden de ønsker å bruke i sin analyse. Isete, CellProfiler eller ImageJ/Fiji er kraftige verktøy som kombinerer både brukervennlighet og funksjonalitet3. Isete er et frittstående verktøy som presenterer et klart grafisk brukergrensesnitt (GUI...

Lett mikroskopi og, mer spesielt, fluorescensmikroskopi er robuste og allsidige teknikker som vanligvis brukes i biologiske vitenskaper. De gir tilgang til nøyaktig lokalisering av ulike biomolekyler som proteiner eller RNA gjennom deres spesifikke fluorescerende merking. Det siste tiåret har vært preget av raske fremskritt innen mikroskopi og bildeteknologi som det fremgår av Nobelprisen i kjemi i 2014 som tildeler Eric Betzig, Stefan W. Hell og William E. Moerner for utviklingen av super-løst fluorescensmikroskopi (SRFM)1. SFRM omgår diffraksjonsgrensen for tradisjonell optisk mikroskopi for å bringe den inn i nanodimensionen. Forbedring i teknikker som live-imaging eller høy gjennomstrømning screening tilnærminger øker også mengden og kompleksiteten av dataene til å behandle for hvert eksperiment. Mesteparten av tiden står forskerne overfor høye heterogene populasjoner av celler og ønsker å analysere fenotyper på encellet nivå.
I utgangspunktet ble analyser som foci telling utført av øyet, som foretrekkes av noen forskere siden det gir full visuell kontroll over telleprosessen. Manuell analyse av slike data er imidlertid for tidkrevende, fører til variasjon mellom observatører, og gir ikke tilgang til mer komplekse funksjoner slik at dataassisterte tilnærminger blir mye brukt og nesten uunngåelig2. Bioimage informatikk metoder øker effektiviteten av dataanalyse betydelig og er fri for uunngåelig operatør subjektivitet og potensielle skjevhet av manuell telling analyse. Den økte etterspørselen på dette feltet og forbedring av datakraft førte til utvikling av et stort antall bildeanalyseplattformer. Noen av dem er fritt tilgjengelig og gir tilgang til ulike verktøy for å utføre analyse med personlige datamaskiner. En klassifisering av åpne tilgangsverktøy har nylig blitt etablert3 og presenterer Icy4 som en kraftig programvare som kombinerer brukervennlighet og funksjonalitet. Videre har Icy fordelen av å kommunisere med ImageJ.
For brukere uten bildeanalyseekspertise er de viktigste hindringene å velge riktig verktøy i henhold til de problematiske og riktig innstilte parametrene som ofte ikke er godt forstått. Videre er oppsettstidene ofte lange. Isete foreslår et brukervennlig pek-og-klikk-grensesnitt kalt "Protokoller" for å utvikle arbeidsflyt ved å kombinere noen plugins som finnes i en uttømmende samling4. Den fleksible modulære utformingen og pek-og-klikk-grensesnittet gjør det mulig å sette opp en analyse for ikke-programmerere. Her presenterer vi en arbeidsflyt kalt Substructure Analyzer, utviklet i Isens grensesnitt, hvis funksjon er å analysere fluorescerende signaler i bestemte cellulære rom og måle forskjellige funksjoner som lysstyrke, foci nummer, foci størrelse og romlig distribusjon. Denne arbeidsflyten løser flere problemer, for eksempel kvantifisering av signaloverføring, analyse av transfiserte celler som uttrykker en fluorescerende reporter, eller analyse av foci fra forskjellige cellulære understrukturer i individuelle celler. Det tillater samtidig behandling av flere bilder, og utdataresultater eksporteres til et tabulatord som kan åpnes i vanlige regnearkprogrammer.
Rørledningen Understrukturanalysator presenteres i figur 1. Først er alle bildene i en spesifisert mappe forhåndsbehandlet for å forbedre signalet til støyforholdet. Dette trinnet øker effektiviteten av følgende trinn og reduserer driftstiden. Deretter identifiseres og segmenteres interesseområdene( ROIer), som tilsvarer bildeområdene der det fluorescerende signalet skal oppdages, og segmenteres. Til slutt analyseres det fluorescerende signalet, og resultatene eksporteres til et tabulatord.
Objektsegmentering (påvisning av grenser) er det mest utfordrende trinnet i bildeanalyse, og effektiviteten bestemmer nøyaktigheten av de resulterende cellemålingene. De første objektene som er identifisert i et bilde (kalt primære objekter) er ofte kjerner fra DNA-farget bilder (DAPI eller Hoechst flekker), selv om primære objekter også kan være hele celler, perler, flekker, svulster, eller hva farget objekter. I de fleste biologiske bilder berører celler eller kjerner hverandre eller overlapper hverandre, noe som fører til at de enkle og raske algoritmene mislykkes. Til dags dato kan ingen universell algoritme utføre perfekt segmentering av alle objekter, hovedsakelig fordi deres egenskaper (størrelse, form eller tekstur) modulerer effektiviteten av segmentering5. Segmenteringsverktøyene som vanligvis distribueres med mikroskopiprogramvare (for eksempel MetaMorph Imaging Software av Molecular Devices6, eller NIS-Elements Advances Research-programvaren av Nikon7) er vanligvis basert på standardteknikker som korrelasjonsmatching, terskel eller morfologiske operasjoner. Selv om de er effektive i grunnleggende systemer, presenterer disse overgeneraliserte metodene raskt begrensninger når de brukes i mer utfordrende og spesifikke sammenhenger. Faktisk er segmentering svært følsom for eksperimentelle parametere som celletype, celletetthet eller biomarkører, og krever ofte gjentatt justering for et stort datasett. Arbeidsflyten for substructureanalysator integrerer både enkle og mer sofistikerte algoritmer for å foreslå ulike alternativer tilpasset bildekompleksitet og brukerbehov. Det foreslår spesielt den markørbaserte vannskillealgoritmen8 for svært grupperte objekter. Effektiviteten til denne segmenteringsmetoden er avhengig av valg av individuelle markører på hvert objekt. Disse markørene velges manuelt mesteparten av tiden for å få riktige parametere for full segmentering, noe som er svært tidkrevende når brukerne står overfor et høyt antall objekter. Substructure Analyzer foreslår en automatisk påvisning av disse markørene, noe som gir en svært effektiv segmenteringsprosess. Segmentering er, mesteparten av tiden, det begrensende trinnet for bildeanalyse og kan betydelig endre behandlingstiden avhengig av oppløsningen av bildet, antall objekter per bilde og nivået av klynger av objekter. Vanlige datasamlebånd krever noen sekunder til 5 minutter per bilde på en standard stasjonær datamaskin. Analyse av mer komplekse bilder kan kreve en kraftigere datamaskin og litt grunnleggende kunnskap i bildeanalyse.
Fleksibiliteten og funksjonaliteten til denne arbeidsflyten illustreres med ulike eksempler i de representative resultatene. Fordelene med denne arbeidsflyten vises spesielt gjennom studiet av kjernefysiske understrukturer under oksidative stressforhold (OS). OS tilsvarer en ubalanse i redoks homeostase i favør av oksidanter og er forbundet med høye nivåer av reaktive oksygenarter (ROS). Siden ROS fungerer som signalmolekyler, påvirker endringer i konsentrasjon og subcellulær lokalisering positivt eller negativt et mylder av veier og nettverk som regulerer fysiologiske funksjoner, inkludert signaltransduksjon, reparasjonsmekanismer, genuttrykk, celledød og spredning9,10. OS er dermed direkte involvert i ulike patologier (nevrodegenerative og kardiovaskulære sykdommer, kreft, diabetes, etc.), men også cellulær aldring. Derfor, dechiffrere konsekvensene av OS på den menneskelige cellens organisasjon og funksjon utgjør et avgjørende skritt i forståelsen av rollene til OS i utbruddet og utviklingen av menneskelige patologier. Det er fastslått at OS regulerer genuttrykk ved å modulere transkripsjon gjennom flere transkripsjonsfaktorer (p53, Nrf2, FOXO3A)11, men også ved å påvirke reguleringen av flere sam- og post-transkripsjonelle prosesser som alternativ spleising (AS) av pre-RNAs12,13,14. Alternativ spleising av primære koding og ikke-koding transkripsjoner er en viktig mekanisme som øker koding kapasiteten av genomene ved å produsere transkripsjon isoformer. AS utføres av et stort ribonucleoprotein kompleks kalt skjøteosom, som inneholder nesten 300 proteiner og 5 U-rike små kjernefysiske RNAs (UsnRNAs)15. Spleikaenhet og AS er tett kontrollert i celler, og noen trinn i den skjøteosommodningen forekommer i membranfrie kjernefysiske rom kalt Cajal Bodies. Disse kjernefysiske understrukturene er preget av den dynamiske naturen til deres struktur og deres sammensetning, som hovedsakelig utføres av multivalente interaksjoner mellom deres RNA og proteinkomponenter med coilinproteinet. Analyse av tusenvis av celler med arbeidsflyten for substructure analyzer tillot karakterisering av aldri beskrevne effekter av OS på Cajal Bodies. Faktisk, innhentet data tyder på at OS endrer kjernen av Cajal Bodies, indusere en nukleoplasmisk omfordeling av coilin protein i mange mindre kjernefysiske foci. En slik endring av strukturen i Cajal Bodies kan påvirke modningen av skjøteosomet og delta i AS-modulasjon av OS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1105px;" width="1104">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">28908</td>
			<td style="width:472px;">to fix the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11008</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21425</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A34055</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Bovine serum albumin standard (BSA)</td>
			<td style="width:183px;">euromedex</td>
			<td style="width:137px;">04-100-812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D5796-500ml</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040-5ML</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human: HeLa S3 cells</td>
			<td>IGBMC, Strasbourg, France</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>cell line used to perform the experiments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">H1009-100ml</td>
			<td>used as a stressing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Mouse monoclonal anti-coilin</td>
			<td style="width:183px;">abcam</td>
			<td style="width:137px;">ab11822</td>
			<td>Coilin-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>epifluoresecence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">PBS pH 7.4 (10x)</td>
			<td style="width:183px;">gibco</td>
			<td style="width:137px;">70011-036</td>
			<td>to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Rabbit polyclonal anti-53BP1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-16565</td>
			<td>53BP1-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit polyclonal anti-EDC4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4200114</td>
			<td>EDC4-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683</td>
			<td>to permeabilize the cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images

Det siste tiåret har vært preget av gjennombrudd i fluorescensmikroskopiteknikker illustrert av forbedring av romlig oppløsning, men også i live-celleavbildning og høygjennomstrømningsmikroskopiteknikker. Dette førte til en konstant økning i mengden og kompleksiteten til mikroskopidataene for et enkelt eksperiment. Fordi manuell analyse av mikroskopidata er svært tidkrevende, subjektiv og forbyr kvantitative analyser, blir automatisering av bioimageanalyse nesten uunngåelig. Vi bygget en informatikkarbeidsflyt kalt Substructure Analyzer for å automatisere signalanalysen i bioimages fra fluorescerende mikroskopi. Denne arbeidsflyten er utviklet på den brukervennlige åpen kildekode-plattformen Icy og fullføres av funksjoner fra ImageJ. Det inkluderer forhåndsbehandling av bilder for å forbedre signalet til støyforhold, den individuelle segmenteringen av celler (deteksjon av cellegrenser) og deteksjon / kvantifisering av cellelegemer beriket i bestemte cellerom. Den største fordelen med denne arbeidsflyten er å foreslå komplekse bio-imaging funksjonalitet til brukere uten bildeanalyse kompetanse gjennom et brukervennlig grensesnitt. Videre er det svært modulært og tilpasset flere problemer fra karakterisering av kjernefysisk / cytoplasmatisk translokasjon til komparativ analyse av forskjellige cellelegemer i forskjellige cellulære understrukturer. Funksjonaliteten til denne arbeidsflyten illustreres gjennom studiet av Cajal (kveilet) Organer under oksidative stressforhold (OS). Data fra fluorescensmikroskopi viser at deres integritet i menneskelige celler påvirkes noen timer etter induksjon av OS. Denne effekten er preget av en reduksjon av coilinkjerning i karakteristiske Cajal Bodies, forbundet med en nukleoplasmisk omfordeling av coilin til et økt antall mindre foci. Coilins sentrale rolle i utvekslingen mellom CB-komponenter og den omkringliggende nukleoplasma tyder på at OS indusert omfordeling av coilin kan påvirke sammensetningen og funksjonaliteten til Cajal Bodies.

Alle de beskrevne analysene er utført på en standard bærbar PC (64-biters firekjerners prosessor ved 2,80 GHz med 16 GB ram (random access Memory) som arbeider med 64-bitersversjonen av Java. Random-access-minne er en viktig parameter å vurdere, avhengig av mengden og oppløsningen på bilder som skal analyseres. Bruk av 32-bitersversjonen av Java begrenser minnet til omtrent 1300 MB, noe som kan være uegnet for big data-analyse, mens 64-bitersversjonen gjør det mulig å øke minnet som er tildelt isete. <strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

Vi presenterer en fritt tilgjengelig arbeidsflyt bygget for rask utforskning og nøyaktig analyse av cellulære organer i bestemte cellerom i fluorescensmikroskopibilder. Denne brukervennlige arbeidsflyten er utformet på åpen kildekode-programvare isete og bruker også ImageJ-funksjonalitet. Rørledningen er rimelig uten kunnskap i bildeanalyse.

Substructure Analyzer: En brukervennlig arbeidsflyt for rask utforskning og nøyaktig analyse av cellulære organer i fluorescensmikroskopibilder

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Understrukturanalysator er en brukervennlig arbeidsflyt som utfører automatisk analyse av flere prosessmikroskopiberegninger. Det betyr ikke null tonn åpen kildekode programvare Isete og også ved hjelp av maskinfunksjonaliteter. Viktigere, denne arbeidsflyten er rimelig resort produsere kunnskap og bilder analyse.Flerkanalsbilder lastes inn i arbeidsflyten og forhåndsbearbeides for å forbedre signal-til-støy-forholdet og fjerne bildebehandling eller defekter. Deretter isolerer bildesegmentering områder av interesse, også kjent som ROIer fra bakgrunnen. Flere metoder for segmentering er tilgjengelige avhengig av nivået av klynger og arten av objekter av interesse.Segmenterte objekter lagres med en bestemt beskrivelse i en bestemt mappe. Kraft og signaler analyseres deretter i radene og flere funksjoner, for eksempel plassering, størrelse, form i tetthetsteksturer, men tall og størrelse eksporteres til et automatisk opprettet regneark. Last ned Isete fra det iskalde nettstedet.Last deretter ned Substructure Analyzer Protocol fra Icy bibliotek av protokoller. Åpne Isete, og klikk på verktøy på båndmenyen. Klikk på protokoller for å åpne protokollredigeringsgrensesnittet.Klikk på last og åpne protokollen substructure analyzer. Protokolllasting kan ta noen sekunder. Arbeidsflyten består av 13 generelle blokker hver blokk som fungerer som et datasamlebånd som består av flere bokser som utfører bestemte delaktiviteter.Hver blokk eller boks er nummerert og har en bestemt rangering i arbeidsflyten. Ved å klikke på dette nummeret tilordner du nærmeste mulige posisjon til den første til den valgte blokken. Posisjonene til de andre blokkene omorganiseres.Ved å klikke på ikonet øverst til venstre kan blokken bli skjult utvidet. Det kan også forstørres, begrenses eller fjernes. Hvert datasamlebånd for arbeidsflyten er riktig oppstod av et nettverk av bokser som er koblet sammen av andre inndata og utdata.For å opprette en tilkobling, klikk på en utdata og vedlikehold til markøren gjelder noen inndata. Tilkoblinger kan fjernes ved å klikke på utdatakoden. Om nødvendig gi nytt navn til filene slik at sekvenser skal slås sammen, har du samme navn prefiks etterfulgt av distinkt skilletegn.Sekvenser av enkeltkanaler fra et bilde A kalles for eksempel bilde Et understrekingstegn rødt, bilde Et understrekingstegn blått og så videre. Opprett en ny mappe per kanal i samme mappe for å slå sammen. Hvis du for eksempel vil slå sammen røde, grønne og blå kanaler, oppretter du tre mapper og lagrer de tilsvarende sekvensene i disse mappene.Bruk bare blokkflettingskanalene, fjern de andre blokkene og lagre protokollen som flettekanaler. Tilgang til boksene for å angi parametere. Velg hvilken kanal som skal pakkes ut, i boksen, kanalnummer x.I klassiske RGB-bilder er null rød, en er grønn og to er blå. I boksen, mappe kanalnummer x, Omvendt skrånende navnet på mappen som inneholder bilder av kanal x. I -boksen skiller du kanalnummer x.Skilletegnet brukes for bildenavn. I -boksen angir fargekartkanalnummer x, med et tall hvilken kolonne av modellen som skal brukes til å visualisere den tilsvarende kanalen i Isete. Skriv utvidelsen for å lagre sammenslåtte bilder i boksen, formatere sammenslåtte bilder.Øverst til venstre i sammenslåingskanalblokken klikker du på koblingen direkte til høyre for mappen. I den åpne dialogboksen som vises, dobbeltklikker du på mappen som inneholder sekvenser av den første kanalen som er definert i boksmappekanal nummer én. Klikk deretter på åpne, kjørte protokollen.Sammenslåtte bilder lagres i en sammenslått mappe i samme mappe som mappene til individuelle kanaler. Objektsegmentering er det mest utfordrende trinnet i bildeanalyse. Effektiviteten bestemmer nøyaktigheten av de resulterende innstilte målingene.Så, struktur analysator integrerer både enkle og mer komplekse algoritmer for å foreslå ulike alternativer tilpasset bilde kompleksitet og brukerbehov. Hvis objekter ikke berører hverandre, trenger ikke andre brukere å skille mellom grupperte objekter individuelt bruke blokksegmenteringen A.Når objekter ikke berører hverandre, men noen av dem er i nærheten, bruker du blokksegmenteringen B.For objekter med høyt klyngenivå og en konveks figur bruker du blokksegmenterings-C.Hvis objekter presenterer et høyt klyngenivå og har uregelmessige figurer , bruk blokksegmenteringen D.Bruk blokksegmenteringen i klynger cytoplasma til å segmentere berøring cytoplasma individuelt ved hjelp av segmenterte kjerner som markører. Blokktilpasset for primærobjektsegmentering kan behandles uavhengig slik at flere blokker kan brukes i samme løp for å sammenligne effektiviteten for en bestemt understruktur, eller for å segmentere ulike typer understrukturer.For å illustrere segmentering er blokksegmentering B, som passer til et større antall problemer valgt. For å bruke denne bloggen. Først kobler du den til å velge mappe.Deretter aktiverer kanalsignalet kanalen for objektet til segment. Hvis du for eksempel vil tilsvare B, angir HK intensitetsklasseparameteren i boksen og de omtrentlige minimums- og maksimumsstørrelsene i piksler av objekter som skal oppdages. For intensitetsklasser klassifiserer verdien på to piksler i to klasser, bakgrunn og forgrunn.Det er dermed tilpasset når kontrasten mellom objektene og bakgrunnen er høy. Hvis forgrunnsobjekter har sin opprinnelse intensiteter, eller kontrast med bakgrunnen er lav, øke antall klasser. I boksen aktive konturer optimalisere deteksjon av objekter grenser.Under prosessen opprettes det en mappe for å lagre bilder av segmenterte objekter. Gi denne mappen et navn i bokstekst, for eksempel segmenteringskjerner. Hvis du vil angi formatet for lagring av bilder av segmenterte objekter, fyller du boksformatet for bilder av segmenterte objekter, kjørte protokollen.Mappen opprettes i mappen som inneholder sammenslåtte bilder. Ulike blokker er utviklet for å tilpasse seg antall lover og kanaler og cellerom som skal analyseres i segmenterte objekter. I eksemplet nedenfor, for analysen, velger du blokken fluorescensanalyse P.Two-kanaler i samme rom og kobler den til å velge mappe.Segmenteringsblokken skal ha blitt behandlet før denne analysen angir parameterne for innboksmappebilder ROI, skrive navnet på mappen som inneholder bilder av segmenterte objekter foran en omvendt skråstrek. Innboksformat for bilder av segmenterte objekter, skriver du formatet som brukes til å lagre bilder av segmenterte objekter. Innboks drepe grenser for å fjerne begge objektene.Ellers, akkurat nå, er installasjonen av den mer fullstendig J-samlingen av bildebehandling nødvendig for å bruke denne funksjonen. I boksene kanal spot signal, angi kanalen der flekker må oppdages. I klassiske RTP-bilder er null rød En er grønn og to er blå.I bokser navn på lokalisert molekyl, skriv navnet på molekylet lokalisere inn i flekkene. Antall felt å svare på avhenger av antall molekyler. I bokser bølgelengder per detektor blokk, angi flekker deteksjon parametere for hver enkelt kanal.For å behandle forskjellige blokker i et rom, hold tilkoblinger av valgte blokker, med blokken velg mappe. Kontroller at deres rekker under god behandling av arbeidsflyten. Før du kjører arbeidsflyten, anbefales det også å fjerne ubrukte blokker og lagre den nye protokollen med et annet navn.Klikk på kjør for å starte arbeidsflyten. Når det åpner øye utseende bøker vises. Dobbeltklikk på mappen som inneholder sykepleierbildene Klikk deretter på Åpne, arbeidsflyten vil automatisk kjøre.Hvis behandlingen er fullført meldingen, vises arbeidsflyten som utføres nederst til høyre, alle blokkene flagges med det grønne tegnet. Hvis ikke blokken og innsiden boksen presentere piltegnet vil indikere elementene riktig. Viktigere, flere skjermer tillate å visualisere de mellomliggende resultatene under hver kjøring for å kontrollere behandlingen.Hurtigheten, fleksibiliteten og funksjonaliteten til denne arbeidsflyten vil være begrenset til ulike eksempler. I dette første eksemplet analyserer vi atomtranslokasjonen av NF kappa B.Etter simulering med økende konsentrasjoner av TNF alfa. Kjerner og cytoplasma ble avgrenset ved hjelp av segmentering C og E blokker.NF kappa B blomstre i signal ble analysert ved hjelp av den globale translokasjonsanalyseblokken. Mer enn 40 000 celler i 96 bilder ble analysert på 26 minutter. De genererte dataene ble brukt til å etablere denne doseresponskurven som viser induksjon av NF Kappa B kjernefysisk translokasjon av TNF alfa.Arbeidsflyten kan også brukes til å oppdage filstørrelse og trekke ut spesifikk informasjon om funksjonene deres. Her ble egenskaper i individuelle celler oppdaget ved å lokalisere EDC for protein. Kjerner i cytoplasma ble avgrenset ved hjelp av segmentering A og E blokker.EDC4 ble analysert ved hjelp av fluorescensanalyseblokker C.In dette eksemplet har cytoplasmatisk EDC4-tegn blitt oppdaget i begge analyserte celler. Størrelsen i piksler på hver helside er angitt i regnearket. I dette eksemplet benyttet vi oss av arbeidsflytens allsidighet for å studere karbohydrater en lengre kinetikk av oksidativt stress.Kjernekraft tegn på coilin er de viktigste strukturelle komponentene i karbohydrater Deres antall og størrelse ble analysert i henhold til størrelse, stress status, vurdert av dobbel strand pauser lokalisert med 53BP1. Nuclei ble avgrenset ved hjelp av segmentering proxy, Kjernekraft og signaler av coillin og 53BP1, ble samtidig analysert ved hjelp av fluorescens analyse Block B.Using data fra 2300 individuelle celler, vi dokumentert en betydelig økning av antall Greenfield området etter stress induksjon forbundet med en reduksjon av deres størrelse. Disse dataene antyder sterkt at oksidativt stress endrer kjernekraften til et karbohydrater ved bruk av en kjernefysisk plasmisk fordeling i antall mindre kjernefysiske for å rettferdiggjøre en endring i coilinuttrykk kan endre lokaliseringen og endre kjernen i kurvelegemer.Et eksogent GFP coilinfusjonsprotein ble overuttrykt. Funksjoner av kroppene våre ble analysert i henhold til GFP coilin overexpression nivå. Kjerner ble avgrenset ved hjelp av segmenteringsblokk A.De fluorescerende signalene fra coilin og GFP-coilin, ble samtidig analysert ved hjelp av fluorescensanalyseblokk B.Overuttrykksnivået til GFP-coilin ble reflektert av betydningen av GFP-signalet i individuelle kjerner.Data generert av understrukturanalysator viser at GFP-coilin i overuttrykk øker størrelsen og antall karbohydrater betydelig. Siden oksidativt stress øker antall karbohydrater, men reduserer størrelsen. Disse dataene kan gjenspeile at oksidativ stresseffekt på strukturen av karbohydrater er mest sannsynlig indusert av en endring av deres sammensetning i stedet for ved en effekt på visse mengder coilin.Så strukturanalysator er en svært modulær arbeidsflyt for biobildeanalyse. Den kan tilpasses flere sammenhenger fra enkel sammenslåing av kanaler til kvantifisering av flere etasjer og signaler i tusenvis av celler. Den integrerer også enkle og komplekse segmenteringsalgoritmer avhengig av bildekompleksitet og automatiserer utvinning av fluorescerende signalfunksjoner.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Prøven Forberedelse, Imaging, og analyse protokoller for Knife-edge Scanning Mikroskopi

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Regissert Cellular Self-Assembly å dikte Cell-Avledet Tissue Rings for Biomekaniske Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Uttak for Målrettet Stabil isotopfortynning Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisasjon og Dynamics i Mikroorganismer, bruke Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Samsvarende Mikroskopi for 3D Structural Analysis of Dynamic Interaksjoner

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høyoppløselig Spatiotemporal Analyse av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescens mikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifisert to-foton Microscope: en søknad til sporing av intracellulær Blemmer

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fra Fast Fluorescens Imaging til Molecular Diffusion Lov om Aktive cellemembraner i et kommersielt mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-slukking av en Liposomalinnkapslet Nær-infrarød fluoroforen som et verktøy for<em&gt; I Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...