Name: substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00
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G.H. foi apoiado por uma bolsa de pós-graduação da Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. foi apoiado por uma bolsa de pós-graduação do Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), enquanto Q.T. foi apoiado por uma bolsa pública supervisionada pela Agência Nacional de Pesquisa Francesa (ANR) como parte do segundo programa "Investissements d'Avenir" FIGHT-HF (referência: ANR-15-RHU4570004). Este trabalho foi financiado pelo CNRS e pela Université de Lorraine (UMR 7365).

NOTA: Tutoriais fáceis de usar estão disponíveis no site da Icy http://icy.bioimageanalysis.org.
1. Baixe O Gelo e o protocolo Analisador de Subestrutura
<ol><li>Baixe Icy no site da Icy(http://icy.bioimageanalysis.org/download) e baixe o protocolo Substructure Analyzer: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest. NOTA: Se usar um SO de 64 bits,...

<ol>
	<li>M&#246;ckl, L., Lamb, D. C., Br&#228;uchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolved+fluorescence+microscopy:+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig,+Stefan+Hell,+and+William+E.+Moerner.">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li><li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+as+signalling+molecules:+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews.">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+Cell+Senescence,+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases.">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53.">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li><li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2&#946;+(SFRS10)+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells.">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2&#946; (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene.">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+Structure+and+Function.">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation.">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation.">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+3.0:+Next-generation+image+processing+for+biology.">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).</li></ol>

Um número crescente de ferramentas de software livre estão disponíveis para a análise de imagens celulares de fluorescência. Os usuários devem escolher corretamente o software adequado de acordo com a complexidade de sua problemática, com seus conhecimentos em processamento de imagem e com o tempo que desejam passar em suas análises. Icy, CellProfiler ou ImageJ/Fiji são ferramentas poderosas que combinam usabilidade e funcionalidade3. O Icy é uma ferramenta autônoma que apresenta uma in...

Microscopia leve e, mais particularmente, microscopia de fluorescência são técnicas robustas e versáteis comumente utilizadas em ciências biológicas. Eles dão acesso à localização precisa de várias biomoléculas como proteínas ou RNA através de sua rotulagem fluorescente específica. A última década foi caracterizada por rápidos avanços em tecnologias de microscopia e imagem, evidenciados pelo Prêmio Nobel de Química de 2014, premiando Eric Betzig, Stefan W. Hell e William E. Moerner pelo desenvolvimento de microscopia de fluorescência super resolvida (SRFM)1. O SFRM contorna o limite de difração da microscopia óptica tradicional para trazê-lo para a nanodimensional. A melhoria de técnicas como imagens ao vivo ou abordagens de triagem de alto rendimento também aumenta a quantidade e a complexidade dos dados para tratar para cada experimento. Na maioria das vezes, os pesquisadores se deparam com altas populações heterogêneas de células e querem analisar fenótipos no nível unicelular.
Inicialmente, análises como a contagem de focos foram realizadas por olho, o que é preferido por alguns pesquisadores, uma vez que fornece controle visual total sobre o processo de contagem. No entanto, a análise manual desses dados é muito demorada, leva à variabilidade entre observadores e não dá acesso a recursos mais complexos para que abordagens assistidas por computador estejam se tornando amplamente utilizadas e quase inevitáveis2. Os métodos de informática da bioimagem aumentam substancialmente a eficiência da análise de dados e estão livres da subjetividade inevitável do operador e do viés potencial da análise de contagem manual. O aumento da demanda neste campo e a melhoria do poder computacional levaram ao desenvolvimento de um grande número de plataformas de análise de imagens. Alguns deles estão disponíveis gratuitamente e dão acesso a várias ferramentas para realizar análises com computadores pessoais. Uma classificação de ferramentas de acesso aberto foi recentemente estabelecida3 e apresenta o Icy4 como um software poderoso que combina usabilidade e funcionalidade. Além disso, Icy tem a vantagem de se comunicar com ImageJ.
Para usuários sem experiência em análise de imagem, os principais obstáculos são escolher a ferramenta apropriada de acordo com os parâmetros problemáticos e de sintonia correta que muitas vezes não são bem compreendidos. Além disso, os tempos de configuração são muitas vezes longos. A Icy propõe uma interface de ponto e clique amigável chamada "Protocolos" para desenvolver fluxo de trabalho, combinando alguns plugins encontrados dentro de uma coleção exaustiva4. O design modular flexível e a interface point-and-click tornam a configuração uma análise viável para não-programadores. Aqui apresentamos um fluxo de trabalho chamado Substructure Analyzer,desenvolvido na interface de Icy, cuja função é analisar sinais fluorescentes em compartimentos celulares específicos e medir diferentes características como brilho, número de focos, tamanho de focos e distribuição espacial. Este fluxo de trabalho aborda várias questões como quantificação da translocação de sinal, análise de células transfeminadas expressando um repórter fluorescente ou análise de focos de diferentes subestruturas celulares em células individuais. Ele permite o processamento simultâneo de várias imagens e os resultados de saída são exportados para uma planilha delimitada por guias que podem ser abertas em programas de planilha comumente usados.
O gasoduto Analisador de Subestrutura é apresentado na Figura 1. Primeiro, todas as imagens contidas em uma pasta especificada são pré-processadas para melhorar sua relação sinal/ruído. Esta etapa aumenta a eficiência das etapas seguintes e diminui o tempo de execução. Em seguida, são identificadas e segmentadas as Regiões de Interesse (ROIs), correspondentes às áreas de imagem onde o sinal fluorescente deve ser detectado, são identificadas e segmentadas. Finalmente, o sinal fluorescente é analisado e os resultados são exportados para uma planilha delimitada por guias.
A segmentação de objetos (detecção de limites) é o passo mais desafiador na análise de imagens, e sua eficiência determina a precisão das medições celulares resultantes. Os primeiros objetos identificados em uma imagem (chamados objetos primários) são frequentemente núcleos de imagens manchadas de DNA (coloração DAPI ou Hoechst), embora objetos primários também possam ser células inteiras, contas, manchas, tumores ou quaisquer objetos manchados. Na maioria das imagens biológicas, células ou núcleos se tocam ou se sobrepõem fazendo com que os algoritmos simples e rápidos falhem. Até o momento, nenhum algoritmo universal pode realizar a segmentação perfeita de todos os objetos, principalmente porque suas características (tamanho, forma ou textura) modulam a eficiência da segmentação5. As ferramentas de segmentação comumente distribuídas com software de microscopia (como o MetaMorph Imaging Software by Molecular Devices6, ou o NIS-Elements Advances Research software by Nikon7) são geralmente baseadas em técnicas padrão, como correspondência de correlação, limiar ou operações morfológicas. Embora eficientes em sistemas básicos, esses métodos supergeralizados rapidamente apresentam limitações quando utilizados em contextos mais desafiadores e específicos. De fato, a segmentação é altamente sensível a parâmetros experimentais, como tipo de célula, densidade celular ou biomarcadores, e frequentemente requer ajuste repetido para um grande conjunto de dados. O fluxo de trabalho do Analisador de Subestrutura integra algoritmos simples e mais sofisticados para propor diferentes alternativas adaptadas à complexidade da imagem e às necessidades do usuário. Ele propõe notavelmente o algoritmo de bacia hidrográfica baseado em marcador8 para objetos altamente agrupados. A eficiência deste método de segmentação depende da seleção de marcadores individuais em cada objeto. Esses marcadores são escolhidos manualmente na maior parte do tempo para obter parâmetros corretos para a segmentação completa, o que é altamente demorado quando os usuários enfrentam um alto número de objetos. O Analisador de Subestrutura propõe uma detecção automática desses marcadores, proporcionando um processo de segmentação altamente eficiente. A segmentação é, na maioria das vezes, a etapa limitante da análise de imagens e pode modificar consideravelmente o tempo de processamento dependendo da resolução da imagem, do número de objetos por imagem e do nível de agrupamento de objetos. Os dutos típicos requerem alguns segundos a 5 minutos por imagem em um computador de mesa padrão. A análise de imagens mais complexas pode exigir um computador mais poderoso e alguns conhecimentos básicos em análise de imagens.
A flexibilidade e funcionalidade deste fluxo de trabalho são ilustradas com vários exemplos nos resultados representativos. As vantagens deste fluxo de trabalho são notavelmente demonstradas através do estudo de subestruturas nucleares sob condições de estresse oxidativo (OS). O OS corresponde a um desequilíbrio da homeostase redox em favor dos oxidantes e está associado a altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS). Uma vez que a ROS atua como moléculas de sinalização, as mudanças em sua concentração e localização subcelular afetam positiva ou negativamente uma miríade de vias e redes que regulam funções fisiológicas, incluindo transdução de sinais, mecanismos de reparação, expressão genética, morte celular e proliferação9,,10. Assim, a OS está diretamente envolvida em diversas patologias (doenças neurodegenerativas e cardiovasculares, cânceres, diabetes, etc.), mas também no envelhecimento celular. Portanto, decifrar as consequências da OS na organização e função da célula humana constitui um passo crucial na compreensão dos papéis da OS no início e desenvolvimento das patologias humanas. Foi estabelecido que o OS regula a expressão genética através da modulação da transcrição através de vários fatores de transcrição (p53, Nrf2, FOXO3A)11, mas também afetando a regulação de vários processos co e pós-transcrição, como o emenda alternativa (AS) das pré-RNAs12,,13,,14. O splicing alternativo de codificação primária e transcrições não codificadas é um mecanismo essencial que aumenta a capacidade de codificação dos genomas produzindo isoformas de transcrição. O AS é realizado por um enorme complexo de ribonucleoproteína chamado emenda ao esfarmato, contendo quase 300 proteínas e 5 pequenas RNAs nucleares (UsnRNAs)15. A montagem de spliceosome e as são fortemente controladas em células e alguns passos da maturação de emendas ocorrem dentro de compartimentos nucleares sem membrana chamados Corpos de Cajal. Essas subestruturas nucleares são caracterizadas pela natureza dinâmica de sua estrutura e sua composição, que são conduzidas principalmente por interações multivalentes de seus componentes de RNA e proteína com a proteína coilina. A análise de milhares de células com o fluxo de trabalho do Analisador de Subestrutura permitiu a caracterização de efeitos nunca descritos do SO em Corpos de Cajal. De fato, dados obtidos sugerem que o OS modifica a nucleação dos Corpos de Cajal, induzindo uma redistribuição nucleoplasmática da proteína coilin em numerosos focos nucleares menores. Tal mudança na estrutura dos Corpos de Cajal pode afetar o amadurecimento do emenda e participar da modulação de AS pela OS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1105px;" width="1104">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">28908</td>
			<td style="width:472px;">to fix the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11008</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21425</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A34055</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Bovine serum albumin standard (BSA)</td>
			<td style="width:183px;">euromedex</td>
			<td style="width:137px;">04-100-812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D5796-500ml</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040-5ML</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human: HeLa S3 cells</td>
			<td>IGBMC, Strasbourg, France</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>cell line used to perform the experiments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">H1009-100ml</td>
			<td>used as a stressing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Mouse monoclonal anti-coilin</td>
			<td style="width:183px;">abcam</td>
			<td style="width:137px;">ab11822</td>
			<td>Coilin-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>epifluoresecence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">PBS pH 7.4 (10x)</td>
			<td style="width:183px;">gibco</td>
			<td style="width:137px;">70011-036</td>
			<td>to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Rabbit polyclonal anti-53BP1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-16565</td>
			<td>53BP1-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit polyclonal anti-EDC4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4200114</td>
			<td>EDC4-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683</td>
			<td>to permeabilize the cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images

A última década tem sido caracterizada por avanços em técnicas de microscopia de fluorescência ilustradas pela melhoria da resolução espacial, mas também em imagens de células vivas e técnicas de microscopia de alto rendimento. Isso levou a um aumento constante na quantidade e complexidade dos dados de microscopia para um único experimento. Como a análise manual dos dados de microscopia é muito demorada, subjetiva e proíbe análises quantitativas, a automação da análise de bioimagem está se tornando quase inevitável. Construímos um fluxo de trabalho de informática chamado Substructure Analyzer para automatizar totalmente a análise de sinais em bioimagems de microscopia fluorescente. Este fluxo de trabalho é desenvolvido na plataforma de código aberto Icy e é concluído por funcionalidades do ImageJ. Inclui o pré-processamento de imagens para melhorar a relação sinal/ruído, a segmentação individual das células (detecção de limites celulares) e a detecção/quantificação de corpos celulares enriquecidos em compartimentos celulares específicos. A principal vantagem deste fluxo de trabalho é propor funcionalidades complexas de bioimagem aos usuários sem experiência em análise de imagem por meio de uma interface fácil de usar. Além disso, é altamente modular e adaptado a várias questões desde a caracterização da translocação nuclear/citoplasmática até a análise comparativa de diferentes corpos celulares em diferentes subescobrições celulares. A funcionalidade deste fluxo de trabalho é ilustrada através do estudo dos Corpos de Cajal (enrolados) sob condições de estresse oxidativo (OS). Dados da microscopia de fluorescência mostram que sua integridade em células humanas é impactada poucas horas após a indução do SO. Este efeito é caracterizado pela diminuição da nucleação de coilina em corpos característicos de Cajal, associados a uma redistribuição nucleoplasmática de coilina em um número aumentado de focos menores. O papel central da coilina na troca entre os componentes do CB e o nucleoplasma circundante sugere que a redistribuição induzida pelo SO do coilin poderia afetar a composição e a funcionalidade dos Corpos de Cajal.

Todas as análises descritas foram realizadas em um laptop padrão (processador quad-core de 64 bits a 2,80 GHz com memória de acesso aleatório (RAM) de 16 GB, trabalhando com a versão de 64 bits do Java. A memória de acesso aleatório é um parâmetro importante a ser considerado, dependendo da quantidade e da resolução das imagens para analisar. O uso da versão de 32 bits do Java limita a memória a cerca de 1300 MB, o que pode ser inadequado para análise de big data, enquanto a versão de 64 bits permite aumen...

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Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

Apresentamos um fluxo de trabalho livremente disponível construído para rápida exploração e análise precisa de corpos celulares em compartimentos celulares específicos em imagens de microscopia de fluorescência. Este fluxo de trabalho fácil de usar é projetado no software de código aberto Icy e também usa funcionalidades ImageJ. O gasoduto é acessível sem conhecimento em análise de imagens.

Analisador de subestrutura: Um fluxo de trabalho fácil de usar para exploração rápida e análise precisa de corpos celulares em imagens de microscopia de fluorescência

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

O analisador de subestrutura é um fluxo de trabalho amigável que realiza a análise automática de múltiplas métricas de microscopia de processos. Isso não significa zero toneladas de software de código aberto Icy e também usando funcionalidades de máquinas. É importante ressaltar que esse fluxo de trabalho é acessível, produzindo conhecimento e análise de imagens.As imagens multicanais são carregadas dentro do fluxo de trabalho e pré-processadas, a fim de melhorar a relação sinal/ruído e remover imagens ou defeitos. Em seguida, a segmentação de imagens isola regiões de interesse, também conhecidas como ROIs a partir do fundo. Vários métodos de segmentação estão disponíveis dependendo do nível de agrupamento e da natureza dos objetos de interesse.Objetos segmentados são salvos com um descritor específico em uma pasta específica. Força e sinais são então analisados dentro das linhas e vários recursos, como localização, tamanho, forma em texturas de densidade, mas número e tamanho são exportados para uma planilha criada automaticamente. Baixe Icy no site da Icy.Em seguida, baixe Substructure Analyzer Protocol da biblioteca de protocolos Icy. Abra o Gelo e clique em ferramentas no menu da fita. Clique em protocolos para abrir a interface do editor de protocolos.Clique na carga e abra o analisador de subestrutura de protocolo. O carregamento do protocolo pode levar alguns segundos. O fluxo de trabalho é composto por 13 blocos gerais cada bloco funcionando como um pipeline composto por várias caixas executando subtarefas específicas.Cada bloco ou caixa é numerado e tem uma classificação específica dentro do fluxo de trabalho. Ao clicar neste número, atribua a posição mais próxima possível à primeira do bloco selecionado. As posições dos outros blocos são reorganizadas.Clicando no ícone do canto superior esquerdo, o bloco pode ser expandido. Também pode ser ampliado, estreitado ou removido. Cada pipeline do fluxo de trabalho está correto surgido por uma rede de caixas conectadas por outras entradas e saídas.Para criar uma conexão, clique em uma saída e mantenha até que o cursor pertenha qualquer entrada. As conexões podem ser removidas clicando na tag de saída. Se necessário renomear os arquivos para que as sequências sejam mescladas, tenha os mesmos nomes prefixo seguido por separador distinto.Por exemplo, sequências de canais individuais de uma imagem A são chamadas imagem A sublinhar vermelho, imagem A sublinhar azul, e assim por diante. Na mesma pasta, crie uma nova pasta por canal para mesclar. Por exemplo, para mesclar canais vermelhos, verdes e azuis, crie três pastas e armazene as sequências correspondentes dentro dessas pastas.Use apenas os canais de fusão do bloco, remova os outros blocos e salve o protocolo como canais de fusão. Acesso às caixas para definir parâmetros. Na caixa, o canal número x, escolha qual canal extrair.Em imagens RGB clássicas, zero é vermelho, um é verde e dois é azul. Na caixa, pasta do canal número x, Backslash o nome da pasta contendo imagens do canal x. Na caixa, o canal separado número x.O separador usa para nome de imagem. Na caixa, mapa de cores número x, indicar com um número qual coluna de modelo usar para visualizar o canal correspondente em Gelo. Na caixa, formato de imagens mescladas, escreva a extensão para salvar imagens mescladas.No canto superior esquerdo do bloco de canais de fusão, clique no link diretamente à direita da pasta. Na caixa de diálogo aberta que aparece, clique duas vezes na pasta contendo sequências do primeiro canal que foi definido no canal da pasta caixa número um. Em seguida, clique em aberto, executou o protocolo.As imagens mescladas são salvas em uma pasta mesclada no mesmo diretório que as pastas de canais individuais. Segmentação de objetos, é o passo mais desafiador na análise de imagens. Sua eficiência determina a precisão das medições do conjunto resultante.Assim, o analisador de estruturas integra algoritmos simples e mais complexos para propor diferentes alternativas adaptadas à complexidade da imagem e às necessidades do usuário. Se os objetos não se tocam, outro usuário não precisa diferenciar objetos agrupados individualmente use a segmentação de bloco A.Quando os objetos não se tocam, mas alguns deles estão próximos, use a segmentação do bloco B.Para objetos com alto nível de agrupamento e uma forma convexa, use a segmentação do bloco C.Se os objetos apresentarem um alto nível de agrupamento e tiverem formas irregulares , use a segmentação do bloco D.Use a segmentação do bloco em clusters citoplasma para segmentar o citoplasma de toque individualmente usando núcleos segmentados como marcadores. O bloco adaptativo para segmentação de objetos primários pode processar de forma independente para que vários blocos possam ser usados na mesma execução para comparar sua eficiência com uma subestrutura específica, ou para segmentar diferentes tipos de subestruturas.Para ilustrar a segmentação, foi escolhida a segmentação do bloco B, que se encaixará em um número maior de questões. Para usar este blog. Primeiro, vincule-o à pasta selecionada.Em seguida, invoca o sinal do canal definir o canal do objeto para o segmento. Por exemplo, para corresponder ao B, em caixa HK significa, definir o parâmetro de classes de intensidade e os tamanhos mínimos e máximos aproximados em pixels de objetos a serem detectados. Para classes de intensidade, um valor de dois classificará pixels em duas classes, fundo e primeiro plano.Assim, é adaptado quando o contraste entre os objetos e o fundo é alto. Se objetos em primeiro plano tiverem suas intensidades de origem, ou o contraste com o fundo for baixo, aumente o número de classes. Na caixa, contornos ativos otimizam a detecção de bordas de objetos.Durante o processo, uma pasta será criada para salvar imagens de objetos segmentados. No texto da caixa, nomeie esta pasta, por exemplo, segmentando núcleos. Para definir o formato para salvar imagens de objetos segmentados, preencha o formato de caixa de imagens de objetos segmentados, executou o protocolo.A pasta é criada na pasta contendo imagens mescladas. Diferentes blocos foram desenvolvidos para se adaptar ao número de leis e canais e compartimentos celulares a serem analisados em objetos segmentados. No exemplo a seguir, para a análise, escolha a análise de fluorescência de bloco P.Dois canais no mesmo compartimento e vincule-o à pasta selecionada.O bloco de segmentação deveria ter sido processado antes desta análise definir os parâmetros de imagens da pasta de entrada ROI, escrever o nome da pasta contendo imagens de objetos segmentados precedidos por uma barra traseira. Formato de caixa de imagens de objetos segmentados, escreva o formato usado para salvar imagens de objetos segmentados. A caixa de entrada mata as bordas para remover ambos os objetos.Caso contrário, neste momento, a instalação da coleção de imagens J mais completa é necessária para usar esta função. Nas caixas canal de sinal spot, defina o canal onde as manchas devem ser detectadas. Nas imagens clássicas do RTP, zero é vermelho Um é verde e dois é azul.Em caixas nome de molécula localizada, escreva o nome da molécula localizado nos pontos. O número de campos a serem respondidos depende do número de moléculas. Em caixas comprimentos de onda por bloco detector, defina parâmetros de detecção de pontos para cada canal individual.Para processar diferentes blocos em uma sala, mantenha conexões de blocos escolhidos, com a pasta de seleção de blocos. Certifique-se de que suas fileiras abaixo do bom processamento do fluxo de trabalho. Antes de executar o fluxo de trabalho, também é recomendado remover blocos não uso e salvar o novo protocolo com outro nome.Clique em execução para iniciar o fluxo de trabalho. Quando abre os olhos, os livros aparecem. Clique duas vezes na pasta que contém as imagens da enfermeira Em seguida, clique em Abrir, o fluxo de trabalho será executado automaticamente.Se o processamento for concluído, o fluxo de trabalho executado com sucesso aparecerá no canto inferior direito, todos os blocos serão sinalizados com o sinal verde. Se não o bloco e a caixa interna apresentando o sinal de seta indicarão os elementos corretos. É importante ressaltar que vários displays permitem visualizar os resultados intermediários durante cada execução, a fim de controlar o processamento.A rapidez, flexibilidade e funcionalidade deste fluxo de trabalho serão restritas a vários exemplos. Neste primeiro exemplo, analisamos a translocação nuclear de NF kappa B.Após simulação com concentrações crescentes de TNF alfa. Núcleos e citoplasma foram delineados utilizando blocos de segmentação C e E.O NF kappa B floresce no sinal foi analisado utilizando-se o bloco global de análise de translocação. Mais de 40 mil células em 96 imagens foram analisadas em 26 minutos. Os dados gerados foram utilizados para estabelecer esta curva de resposta à dose mostrando a indução da translocação nuclear NF Kappa B pela TNF alfa.O fluxo de trabalho também pode ser usado para detectar o tamanho do arquivo e extrair informações específicas sobre seus recursos. Aqui, propriedades em células individuais foram detectadas localizando o EDC para proteína. Os núcleos em citoplasma foram delineados utilizando blocos de segmentação A e E.O EDC4 foi analisado utilizando-se blocos de análise de fluorescência C.In este exemplo, o sinal citoplasmado EDC4 foi detectado em ambas as células analisadas. O tamanho em pixels de cada lado completo é dado na planilha. Neste exemplo, aproveitamos a versatilidade do fluxo de trabalho para estudar carboidratos uma cinética mais longa do estresse oxidativo.Sinal de força nuclear de coilina são os principais componentes estruturais dos carboidratos Seu número e tamanho foram analisados de acordo com o tamanho, estado de estresse, avaliado por quebras duplas de fios localizadas com 53BP1. Os núcleos foram delineados usando proxy de segmentação, força nuclear e sinais de coillina e 53BP1, foram simultaneamente analisados por meio da análise de fluorescência Bloco B.Usando dados de 2300 células individuais, evidenciamos um aumento significativo do número de greenfield após indução de estresse associada a uma diminuição de seu tamanho. Esses dados sugerem fortemente que o estresse oxidativo altera o poder de nucleação de um carboidrato no uso de uma distribuição plasmática nuclear em número de nucleares menores para o local para justificar uma mudança na expressão da coilina poderia alterar sua localização e alterar a nucleação de corpos curvas.Uma proteína de fusão de coilin GFP exógena foi superexpressa. Características de nossos corpos foram analisadas de acordo com o nível de superexpressão da coilina GFP. Os núcleos foram delineados utilizando o bloco de segmentação A.Os sinais fluorescentes da coilina e da coilina GFP foram simultaneamente analisados utilizando-se o bloco de análise de fluorescência B.O nível de superexpressão da coilina GFP foi refletido pela densidade de significado do sinal GFP em núcleos individuais.Dados gerados pelo analisador de subestrutura mostram que o coilin GFP em superexpressão aumenta significativamente o tamanho e o número de carboidratos. Uma vez que o estresse oxidativo aumenta o número de carboidratos, mas reduz seu tamanho. Esses dados podem refletir que o efeito de estresse oxidativo na estrutura dos carboidratos é provavelmente induzido por uma mudança de sua composição, em vez de por um efeito sobre determinada quantidade de coilina.Assim, o analisador de estrutura é um fluxo de trabalho altamente modular para análise de bioimagem. Pode ser adaptado a vários contextos, desde a simples fusão de canais até a quantificação de múltiplos andares e sinais em milhares de células. Também integra algoritmos de segmentação simples e complexos, dependendo da complexidade da imagem e automatiza a extração de recursos de sinal fluorescente.

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