Name: substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00
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G.H. fue apoyado por una beca de posgrado de la Ministére Délégué a la Recherche et aux Technologies. L.H. fue apoyado por una beca de posgrado del Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), mientras que Q.T. fue apoyado por una subvención pública supervisada por la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR) como parte del segundo programa "Investissements d'Avenir" FIGHT-HF (referencia: ANR-15-RHU4570004). Esta obra fue financiada por el CNRS y la Universidad de Lorena (UMR 7365).

NOTA: Tutoriales fáciles de usar están disponibles en el sitio web de Icy http://icy.bioimageanalysis.org.
1. Descargue Icy y el protocolo Substructure Analyzer
<ol><li>Descargue Icy desde el sitio web de Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/download) y descargue el protocolo Substructure Analyzer: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest. NOTA...

<ol>
	<li>M&#246;ckl, L., Lamb, D. C., Br&#228;uchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolved+fluorescence+microscopy:+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig,+Stefan+Hell,+and+William+E.+Moerner.">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li><li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. 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NIS-Elements Imaging Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014)</li><li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+segmentation.">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress.">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>D'Autr&#233;aux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+as+signalling+molecules:+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews.">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. 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L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+Structure+and+Function.">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation.">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation.">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+3.0:+Next-generation+image+processing+for+biology.">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).</li></ol>

Un número cada vez mayor de herramientas de software libre están disponibles para el análisis de imágenes de celdas de fluorescencia. Los usuarios deben elegir correctamente el software adecuado de acuerdo con la complejidad de su problema, a su conocimiento en el procesamiento de imágenes, y al tiempo que quieren pasar en su análisis. Icy, CellProfiler o ImageJ/Fiji son potentes herramientas que combinan facilidad de uso y funcionalidad3. Icy es una herramienta independiente que presenta un...

La microscopía ligera y, más particularmente, la microscopía de fluorescencia son técnicas robustas y versátiles comúnmente utilizadas en las ciencias biológicas. Dan acceso a la localización precisa de varias biomoléculas como proteínas o ARN a través de su etiquetado fluorescente específico. La última década se ha caracterizado por rápidos avances en las tecnologías de microscopía e imagen, como lo demuestra el Premio Nobel de Química 2014 que otorga a Eric Betzig, Stefan W. Hell y William E. Moerner por el desarrollo de la microscopía de fluorescencia superconsuelta (SRFM)1. SFRM evita el límite de difracción de la microscopía óptica tradicional para incorporarlo a la nanodimensión. La mejora de técnicas como la imagen en vivo o los enfoques de detección de alto rendimiento también aumenta la cantidad y la complejidad de los datos que se deben tratar para cada experimento. La mayoría de las veces, los investigadores se enfrentan a altas poblaciones heterogéneas de células y quieren analizar fenotipos a nivel de una sola célula.
Inicialmente, análisis como el conteo de focos fueron realizados a simple vista, lo que es preferido por algunos investigadores ya que proporciona un control visual completo sobre el proceso de conteo. Sin embargo, el análisis manual de estos datos consume demasiado tiempo, conduce a la variabilidad entre los observadores y no da acceso a características más complejas para que los enfoques asistidos por ordenador se estén volviendo ampliamente utilizados y casi inevitables2. Los métodos informáticos bioimagen aumentan sustancialmente la eficiencia del análisis de datos y están libres de la subjetividad inevitable del operador y el sesgo potencial del análisis de recuento manual. El aumento de la demanda en este campo y la mejora de la potencia informática llevaron al desarrollo de un gran número de plataformas de análisis de imágenes. Algunos de ellos están disponibles de forma gratuita y dan acceso a varias herramientas para realizar análisis con ordenadores personales. Recientemente se ha establecido una clasificación de herramientas de acceso abierto3 y presenta Icy4 como un potente software que combina facilidad de uso y funcionalidad. Además, Icy tiene la ventaja de comunicarse con ImageJ.
Para los usuarios sin experiencia en análisis de imágenes, los principales obstáculos son elegir la herramienta adecuada de acuerdo con los parámetros problemáticos y de ajuste correcto que a menudo no se entienden bien. Además, los tiempos de configuración suelen ser largos. Icy propone una interfaz fácil de usar de apuntar y hacer clic llamada "Protocolos" para desarrollar el flujo de trabajo mediante la combinación de algunos plugins que se encuentran dentro de una colección exhaustiva4. El diseño modular flexible y la interfaz de apuntar y hacer clic hacen que la configuración de un análisis sea factible para los no programadores. Aquí presentamos un flujo de trabajo llamado Substructure Analyzer,desarrollado en la interfaz de Icy, cuya función es analizar señales fluorescentes en compartimentos celulares específicos y medir diferentes características como brillo, número de focos, tamaño de los focos y distribución espacial. Este flujo de trabajo aborda varios problemas como la cuantificación de la translocación de la señal, el análisis de células trans infectadas que expresan a un reportero fluorescente o el análisis de focos de diferentes subestructuras celulares en células individuales. Permite el procesamiento simultáneo de varias imágenes, y los resultados de salida se exportan a una hoja de trabajo delimitada por tabulaciones que se puede abrir en programas de hoja de cálculo de uso común.
La canalización Analizador de subestructuras se presenta en la Figura 1. En primer lugar, todas las imágenes contenidas en una carpeta especificada se procesan previamente para mejorar su relación señal/ruido. Este paso aumenta la eficiencia de los pasos siguientes y disminuye el tiempo de ejecución. A continuación, se identifican y segmentan las Regiones de Interés (ROI), correspondientes a las áreas de imagen donde se debe detectar la señal fluorescente. Por último, se analiza la señal fluorescente y los resultados se exportan a una hoja de cálculo delimitada por tabulaciones.
La segmentación de objetos (detección de límites) es el paso más difícil en el análisis de imágenes, y su eficiencia determina la precisión de las mediciones de celda resultantes. Los primeros objetos identificados en una imagen (llamados objetos primarios) son a menudo núcleos de imágenes manchadas de ADN (tinción DAPI o Hoechst), aunque los objetos primarios también pueden ser células enteras, cuentas, motas, tumores o cualquier objeto manchado. En la mayoría de las imágenes biológicas, las células o núcleos se tocan entre sí o se superponen haciendo que los algoritmos simples y rápidos fallen. Hasta la fecha, ningún algoritmo universal puede realizar una segmentación perfecta de todos los objetos, principalmente porque sus características (tamaño, forma o textura) modulan la eficiencia de la segmentación5. Las herramientas de segmentación comúnmente distribuidas con software de microscopía (como MetaMorph Imaging Software de Molecular Devices6o el software NIS-Elements Advances Research de Nikon7)se basan generalmente en técnicas estándar como la coincidencia de correlaciones, umbrales u operaciones morfológicas. Aunque son eficientes en los sistemas básicos, estos métodos sobregeneracionalizados presentan rápidamente limitaciones cuando se utilizan en contextos más desafiantes y específicos. De hecho, la segmentación es muy sensible a parámetros experimentales como el tipo de celda, la densidad de celdas o los biomarcadores, y con frecuencia requiere un ajuste repetido para un conjunto de datos grande. El flujo de trabajo de Substructure Analyzer integra algoritmos simples y más sofisticados para proponer diferentes alternativas adaptadas a la complejidad de la imagen y a las necesidades del usuario. En particular, propone el algoritmo de cuenca hidrográfica basada en marcadores8 para objetos altamente agrupados. La eficiencia de este método de segmentación se basa en la selección de marcadores individuales en cada objeto. Estos marcadores se eligen manualmente la mayor parte del tiempo para obtener los parámetros correctos para la segmentación completa, lo que consume mucho tiempo cuando los usuarios se enfrentan a un gran número de objetos. Substructure Analyzer propone una detección automática de estos marcadores, proporcionando un proceso de segmentación altamente eficiente. La segmentación es, la mayor parte del tiempo, el paso limitante del análisis de imágenes y puede modificar considerablemente el tiempo de procesamiento en función de la resolución de la imagen, el número de objetos por imagen y el nivel de agrupación en clústeres de objetos. Las canalizaciones típicas requieren de unos segundos a 5 minutos por imagen en un equipo de escritorio estándar. El análisis de imágenes más complejas puede requerir un ordenador más potente y algunos conocimientos básicos en el análisis de imágenes.
La flexibilidad y la funcionalidad de este flujo de trabajo se ilustran con varios ejemplos en los resultados representativos. Las ventajas de este flujo de trabajo se muestran notablemente a través del estudio de subestructuras nucleares en condiciones de estrés oxidativo (OS). El sistema operativo corresponde a un desequilibrio de la homeostasis redox en favor de los oxidantes y se asocia con altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS). Dado que ROS actúa como moléculas de señalización, los cambios en su concentración y localización subcelular afectan positiva o negativamente a una miríada de vías y redes que regulan las funciones fisiológicas, incluyendo la transducción de señales, los mecanismos de reparación, la expresión génica, la muerte celular y la proliferación9,,10. Por lo tanto, el sistema operativo participa directamente en diversas patologías (enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares, cánceres, diabetes, etc.), pero también en el envejecimiento celular. Por lo tanto, descifrar las consecuencias del sistema operativo en la organización y función de la célula humana constituye un paso crucial en la comprensión de las funciones del sistema operativo en la aparición y desarrollo de patologías humanas. Se ha establecido que el sistema operativo regula la expresión génica mediante la modulación de la transcripción a través de varios factores de transcripción (p53, Nrf2, FOXO3A)11,pero también afectando a la regulación de varios procesos co- y post-transcripción como el empalme alternativo (AS) de pre-RNAs12,,13,14. El empalme alternativo de transcripciones de codificación primaria y no codificación es un mecanismo esencial que aumenta la capacidad de codificación de los genomas mediante la producción de isoformas de transcripción. As es realizado por un enorme complejo de ribonucleoproteína llamado spliceosoma, que contiene casi 300 proteínas y 5 PEQUEÑOS ARN nucleares (UsnRNAs) ricos en U15. El ensamblaje de empalmes y AS están estrechamente controlados en las células y algunos pasos de la maduración del empalme ocurren dentro de compartimentos nucleares sin membrana llamados Cuerpos Cajales. Estas subestructuras nucleares se caracterizan por la naturaleza dinámica de su estructura y su composición, que se llevan a cabo principalmente por interacciones multivalentes de sus componentes de ARN y proteína con la proteína coilin. El análisis de miles de celdas con el flujo de trabajo de Substructure Analyzer permitió caracterizar los efectos nunca descritos del sistema operativo en Los cuerpos de Cajal. De hecho, los datos obtenidos sugieren que el sistema operativo modifica la nucleación de los cuerpos de Cajal, induciendo una redistribución nucleoplasmica de la proteína de bobina en numerosos focos nucleares más pequeños. Tal cambio de la estructura de los Cuerpos de Cajales podría afectar a la maduración del empalme y participar en la modulación AS por el sistema operativo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1105px;" width="1104">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">28908</td>
			<td style="width:472px;">to fix the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11008</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21425</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A34055</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Bovine serum albumin standard (BSA)</td>
			<td style="width:183px;">euromedex</td>
			<td style="width:137px;">04-100-812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D5796-500ml</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040-5ML</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human: HeLa S3 cells</td>
			<td>IGBMC, Strasbourg, France</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>cell line used to perform the experiments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">H1009-100ml</td>
			<td>used as a stressing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Mouse monoclonal anti-coilin</td>
			<td style="width:183px;">abcam</td>
			<td style="width:137px;">ab11822</td>
			<td>Coilin-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>epifluoresecence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">PBS pH 7.4 (10x)</td>
			<td style="width:183px;">gibco</td>
			<td style="width:137px;">70011-036</td>
			<td>to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Rabbit polyclonal anti-53BP1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-16565</td>
			<td>53BP1-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit polyclonal anti-EDC4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4200114</td>
			<td>EDC4-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683</td>
			<td>to permeabilize the cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images

La última década se ha caracterizado por avances en las técnicas de microscopía de fluorescencia ilustradas por la mejora de la resolución espacial, pero también en las técnicas de imagen de células vivas y microscopía de alto rendimiento. Esto condujo a un aumento constante en la cantidad y complejidad de los datos de la microscopía para un solo experimento. Debido a que el análisis manual de los datos de la microscopía consume mucho tiempo, es subjetivo y prohíbe los análisis cuantitativos, la automatización del análisis de bioimagen se está volviendo casi inevitable. Construimos un flujo de trabajo informático llamado Substructure Analyzer para automatizar completamente el análisis de señales en bioimagens a partir de microscopía fluorescente. Este flujo de trabajo se desarrolla en la plataforma de código abierto fácil de usar Icy y se completa con las funcionalidades de ImageJ. Incluye el preprocesamiento de imágenes para mejorar la relación señal-ruido, la segmentación individual de celdas (detección de límites celulares) y la detección/cuantificación de cuerpos celulares enriquecidos en compartimentos celulares específicos. La principal ventaja de este flujo de trabajo es proponer complejas funcionalidades de bioimagen a los usuarios sin experiencia en análisis de imágenes a través de una interfaz fácil de usar. Además, es altamente modular y se adapta a varias cuestiones desde la caracterización de la translocación nuclear/citoplasmático hasta el análisis comparativo de diferentes cuerpos celulares en diferentes subefilas celulares. La funcionalidad de este flujo de trabajo se ilustra a través del estudio de los cuerpos Deles (bobinados) en condiciones de estrés oxidativo (OS). Los datos de la microscopía de fluorescencia muestran que su integridad en las células humanas se ve afectada unas horas después de la inducción del sistema operativo. Este efecto se caracteriza por una disminución de la nucleación de bobina en cuerpos típicos de Cajal, asociado con una redistribución nucleoplasmica de bobina en un mayor número de focos más pequeños. El papel central de la bobina en el intercambio entre los componentes CB y el nucleoplasmo circundante sugiere que la redistribución inducida por el sistema operativo de bobinado podría afectar la composición y la funcionalidad de Los cuerpos de Cajal.

Todos los análisis descritos se han realizado en un portátil estándar (procesador de cuatro núcleos de 64 bits a 2,80 GHz con memoria de acceso aleatorio (RAM) de 16 GB que trabaja con la versión de 64 bits de Java. La memoria de acceso aleatorio es un parámetro importante a tener en cuenta, dependiendo de la cantidad y la resolución de las imágenes a analizar. El uso de la versión de 32 bits de Java limita la memoria a unos 1300 MB, lo que podría no ser adecuado para el análisis de big data, mientras que la v...

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Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

Presentamos un flujo de trabajo de libre disposición construido para la exploración rápida y el análisis preciso de cuerpos celulares en compartimentos celulares específicos en imágenes de microscopía de fluorescencia. Este flujo de trabajo fácil de usar está diseñado en el software de código abierto Icy y también utiliza funcionalidades ImageJ. La canalización es asequible sin conocimientos en el análisis de imágenes.

Analizador de Subestructuras: Un flujo de trabajo amigable para el usuario para la exploración rápida y el análisis preciso de los cuerpos celulares en imágenes de microscopía de fluorescencia

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

El analizador de subestructuras es un flujo de trabajo fácil de usar que realiza análisis automáticos de múltiples métricas de microscopía de procesos. No significa cero toneladas de software de código abierto Icy y también el uso de funcionalidades de la máquina. Es importante destacar que este flujo de trabajo es asequible y produce conocimientos y análisis de imágenes.Las imágenes multicanal se cargan dentro del flujo de trabajo y se procesan previamente para mejorar la relación señal-ruido y eliminar imágenes o defectos. A continuación, la segmentación de imágenes aísla las regiones de interés, también conocidas como ROI del fondo. Varios métodos de segmentación están disponibles dependiendo del nivel de agrupación en clústeres y la naturaleza de los objetos de interés.Los objetos segmentados se guardan con un descriptor específico en una carpeta específica. La fuerza y las señales se analizan dentro de las filas y varias entidades, como la ubicación, el tamaño, la forma en las texturas de densidad, pero el número y el tamaño se exportan a una hoja de cálculo creada automáticamente. Descarga Icy desde el sitio web de Icy.A continuación, descargue Substructure Analyzer Protocol de la biblioteca de protocolos Icy. Abra Icy y haga clic en las herramientas del menú de la cinta de opciones. Haga clic en los protocolos para abrir la interfaz del editor de protocolos.Haga clic en cargar y abra el analizador de subestructuras de protocolo. La carga del protocolo puede tardar unos segundos. El flujo de trabajo se compone de 13 bloques generales cada bloque que funcionan como una canalización compuesta por varias cajas que realizan subtareas específicas.Cada bloque o cuadro está numerado y tiene un rango específico dentro del flujo de trabajo. Al hacer clic en este número, asigne la posición más cercana posible a la primera al bloque seleccionado. Las posiciones de los otros bloques se reorganizan.Al hacer clic en el icono de la esquina superior izquierda, el bloque se puede contraer expandido. También se puede agrandar, estrechar o eliminar. Cada canalización del flujo de trabajo es correcta surgida por una red de cuadros conectados entre sí por otra entrada y salida.Para crear una conexión, haga clic en una salida y mantenga hasta que el cursor pertenezca a cualquier entrada. Las conexiones se pueden eliminar haciendo clic en la etiqueta de salida. Si es necesario cambiar el nombre de los archivos para que las secuencias que se van a combinar, tienen el mismo prefijo de nombres seguido de separador distinto.Por ejemplo, las secuencias de canales individuales de una imagen A se denominan imagen A de subrayado rojo, imagen A subrayado azul, etc. En la misma carpeta, cree una nueva carpeta por canal para combinar. Por ejemplo, para combinar canales rojos, verdes y azules, cree tres carpetas y almacene las secuencias correspondientes dentro de estas carpetas.Utilice solo los canales de combinación de bloques, elimine los otros bloques y guarde el protocolo como canales de fusión. Acceso a las cajas para fijar los parámetros. En el cuadro, número de canal x, elija qué canal extraer.En las imágenes RGB clásicas, cero es rojo, uno es verde y dos es azul. En el cuadro, número de canal de carpeta x, barra diagonal diagonal posterior el nombre de la carpeta que contiene imágenes del canal x. En el cuadro, separe el número de canal x.El separador se utiliza para el nombre de la imagen. En el cuadro, el número de canal de mapa de color x, indique con un número qué columna del modelo utilizar para visualizar el canal correspondiente en Icy. En el cuadro, formato de imágenes combinadas, escriba la extensión para guardar imágenes combinadas.En la esquina superior izquierda del bloque de canales de fusión, haga clic en el enlace directamente a la derecha de la carpeta. En el cuadro de diálogo abierto que aparece, haga doble clic en la carpeta que contiene secuencias del primer canal que se ha definido en el canal de la carpeta de cuadro número uno. A continuación, haga clic en abrir, ejecutó el protocolo.Las imágenes combinadas se guardan en una carpeta combinada en el mismo directorio que las carpetas de canales individuales. La segmentación de objetos, es el paso más difícil en el análisis de imágenes. Su eficiencia determina la precisión de las mediciones resultantes.Por lo tanto, el analizador de estructura integra algoritmos simples y más complejos para proponer diferentes alternativas adaptadas a la complejidad de la imagen y las necesidades del usuario. Si los objetos no se tocan entre sí, otro usuario no necesita diferenciar los objetos agrupados individualmente utilizar la segmentación de bloques A.Cuando los objetos no se tocan entre sí, pero algunos de ellos están muy cerca, utilice la segmentación de bloques B.Para objetos con un nivel de agrupación en clústeres alto y una forma convexa, utilice la segmentación de bloques C.Si los objetos presentan un nivel de agrupación alto y tienen formas irregulares , utilice la segmentación de bloques D.Utilice la segmentación de bloques en el citoplasma de clústeres para segmentar el citoplasma que toca individualmente utilizando núcleos segmentados como marcadores. La adaptación de bloques para la segmentación de objetos primarios puede procesarse de forma independiente para que varios bloques se puedan utilizar en la misma ejecución para comparar su eficiencia para una subestructura determinada o para segmentar diferentes tipos de subestructuras.Para ilustrar la segmentación, se ha elegido la segmentación de bloques B, que se ajustará a un mayor número de problemas. Para usar este blog. En primer lugar, vincúlalo para seleccionar la carpeta.A continuación, invoca la señal de canal que establece el canal del objeto en segmentar. Por ejemplo, para corresponder a la B, en el cuadro HK significa, establezca el parámetro intensity classes y los tamaños mínimo y máximo aproximados en píxeles de objetos que se van a detectar. Para las clases de intensidad, un valor de dos clasificará los píxeles en dos clases, fondo y primer plano.Por lo tanto, se adapta cuando el contraste entre los objetos y el fondo es alto. Si los objetos de primer plano tienen sus intensidades de origen, o el contraste con el fondo es bajo, aumente el número de clases. En el cuadro, los contornos activos optimizan la detección de bordes de objetos.Durante el proceso, se creará una carpeta para guardar imágenes de objetos segmentados. En el texto del cuadro, asigne un nombre a esta carpeta, por ejemplo, segmentando núcleos. Para establecer el formato para guardar imágenes de objetos segmentados, rellene el formato de cuadro de las imágenes de objetos segmentados, ejecutó el protocolo.La carpeta se crea en la carpeta que contiene imágenes combinadas. Se han desarrollado diferentes bloques para adaptarse al número de leyes y canales y compartimentos celulares a analizar en objetos segmentados. En el ejemplo siguiente, para el análisis, elija el análisis de fluorescencia de bloque P.Two canales en el mismo compartimiento y vincúlalo para seleccionar la carpeta.El bloque de segmentación debería haberse procesado antes de que este análisis estableciera el ROI de las imágenes de la carpeta de bandeja de entrada de parámetros, escriba el nombre de la carpeta que contiene imágenes de objetos segmentados precedidos por una barra diagonal invertida. Formato de bandeja de entrada de imágenes de objetos segmentados, escriba el formato utilizado para guardar imágenes de objetos segmentados. Los bordes de eliminación de la bandeja de entrada para eliminar ambos objetos.De lo contrario, ahora mismo, se requiere la instalación de la colección más completa J de imágenes para utilizar esta función. En las casillas de la señal de punto del canal, ajuste el canal donde se deben detectar los puntos. En las imágenes RTP clásicas, cero es rojo Uno es verde y dos es azul.En cajas nombre de molécula localizada, escriba el nombre de la molécula que se localiza en las manchas. El número de campos a responder depende del número de moléculas. En las longitudes de onda de las cajas por bloque detector, establezca los parámetros de detección de puntos para cada canal individual.Para procesar diferentes bloques en una habitación, mantenga las conexiones de los bloques elegidos, con la carpeta de selección de bloques. Asegúrese de que sus filas están por debajo del buen procesamiento del flujo de trabajo. Antes de ejecutar el flujo de trabajo, también se recomienda quitar los bloques no utilizados y guardar el nuevo protocolo con otro nombre.Haga clic en Ejecutar para iniciar el flujo de trabajo. Cuando se abre mirada mira, aparecen libros. Haga doble clic en la carpeta que contiene las imágenes de enfermeraS Luego haga clic en Abrir, el flujo de trabajo se ejecutará automáticamente.Si el procesamiento se completa el mensaje, el flujo de trabajo ejecutado correctamente aparecerá en la esquina inferior derecha, todos los bloques se marcarán con el signo verde. Si no es el bloque y el cuadro interior que presenta el signo de flecha indicará los elementos correctos. Es importante destacar que varias pantallas permiten visualizar los resultados intermedios durante cada ejecución para controlar el procesamiento.La rapidez, flexibilidad y funcionalidad de este flujo de trabajo se limitarán a varios ejemplos. En este primer ejemplo, analizamos la translocación nuclear de NF kappa B.Después de la simulación con concentraciones crecientes de TNF alfa. Los núcleos y el citoplasma se delinearon utilizando bloques de segmentación C y E.El florecimiento de la kappa B de NF en la señal se analizó utilizando el bloque de análisis de translocación global. Más de 40.000 células en 96 imágenes fueron analizadas en 26 minutos. Los datos generados se utilizaron para establecer esta curva de respuesta a la dosis que muestra la inducción de la translocación nuclear NF Kappa B por TNF alfa.El flujo de trabajo también se puede utilizar para detectar el tamaño del archivo y extraer información específica sobre sus características. Aquí, las propiedades en las células individuales se detectaron mediante la localización de la EDC para la proteína. Los núcleos en el citoplasma se delinearon utilizando bloques de segmentación A y E.EDC4 se analizó utilizando bloques de análisis de fluorescencia C.In este ejemplo, se ha detectado un signo EDC4 citoplasmático en ambas células analizadas. El tamaño en píxeles de cada lado completo se indica en la hoja de cálculo. En este ejemplo, aprovechamos la versatilidad del flujo de trabajo para estudiar los carbohidratos una cinética más larga del estrés oxidativo.El signo de fuerza nuclear de la bobina son los principales componentes estructurales de los carbohidratos Su número y tamaño fueron analizados de acuerdo con el tamaño, estado de tensión, evaluado por roturas de doble hebra localizadas con 53BP1. Los núcleos fueron delineados usando proxy de segmentación, fuerza nuclear y señales de bobina y 53BP1, fueron analizados simultáneamente usando el análisis de fluorescencia Bloque B.Utilizando datos de 2300 células individuales, evidenciamos un aumento significativo del número de sitio de Greenfield después de la inducción de estrés asociado con una disminución de su tamaño. Estos datos sugieren firmemente que el estrés oxidativo cambia el poder de nucleación de un carbohidrato en el uso de una distribución plasmica nuclear en número de nucleares más pequeñas para el sitio para justificar un cambio en la expresión de bobina podría alterar su localización y cambiar la nucleación de cuerpos de curva.Se sobreexpresó una proteína exógena de fusión de bobina de GFP. Las características de nuestros cuerpos fueron analizadas de acuerdo con el nivel de sobreexpresión de bobina GFP. Los núcleos se delinearon utilizando el bloque de segmentación A.Las señales fluorescentes de bobina y bobina GFP, se analizaron simultáneamente utilizando el bloque de análisis de fluorescencia B.El nivel de sobreexpresión de la bobina GFP se refletió por el significado de densidad de la señal GFP en núcleos individuales.Los datos generados por el analizador de subestructura muestran que la bobina GFP en la sobreexpresión aumenta significativamente el tamaño y el número de carbohidratos. Dado que el estrés oxidativo aumenta el número de carbohidratos pero reduce su tamaño. Estos datos podrían reflejar que el efecto de estrés oxidativo en la estructura de los carbohidratos es probablemente inducido por un cambio de su composición en lugar de por un efecto sobre cierta cantidad de bobina.Así que el analizador de estructura es un flujo de trabajo altamente modular para el análisis de imágenes biológicas. Se puede adaptar a varios contextos desde la simple fusión de canales hasta la cuantificación de múltiples pisos y señales en miles de células. También integra algoritmos de segmentación simples y complejos dependiendo de la complejidad de la imagen y automatiza la extracción de entidades de señal fluorescente.

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