Name: substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

G.H. stöddes av en examen stipendium från Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies. L.H. stöddes av ett stipendium från Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL), medan Q.T. stöddes av ett offentligt bidrag som övervakades av den franska nationella forskningsbyrån (ANR) som en del av det andra "Investissements d'Avenir"-programmet FIGHT-HF (referens: ANR-15-RHU4570004). Detta arbete finansierades av CNRS och Université de Lorraine (UMR 7365).

Obs: Användarvänliga tutorials finns på Isos webbplats http://icy.bioimageanalysis.org.
1. Ladda ner Isiga och Substructure Analyzer-protokollet
<ol><li>Ladda ner Isig från Icy webbplats(http://icy.bioimageanalysis.org/download) och ladda ner Substructure Analyzer protokoll: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest. Om du använder ett 64-bit...

<ol>
	<li>M&#246;ckl, L., Lamb, D. C., Br&#228;uchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolved+fluorescence+microscopy:+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig,+Stefan+Hell,+and+William+E.+Moerner.">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li><li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imagining+the+future+of+bioimage+analysis.">Imagining the future of bioimage analysis.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).</li><li>Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., M&#252;nzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+free+software+tools+for+image+analysis+of+fluorescence+cell+micrographs.">Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs.</a> Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+image+analysis+using+NIH+Image/ImageJ.">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).</li><li>Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+on+image+segmentation+techniques.">Survey on image segmentation techniques.</a> Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).</li><li>. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy">https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy</a> (2018)</li><li>. NIS-Elements Imaging Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014)</li><li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+segmentation.">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress.">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>D'Autr&#233;aux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+as+signalling+molecules:+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews.">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+Cell+Senescence,+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases.">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53.">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li><li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2&#946;+(SFRS10)+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells.">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2&#946; (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene.">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+Structure+and+Function.">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation.">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation.">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+3.0:+Next-generation+image+processing+for+biology.">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).</li></ol>

Allt fler verktyg för fri programvara finns tillgängliga för analys av fluorescenscellbilder. Användare måste korrekt välja lämplig programvara beroende på komplexiteten i deras problematiska, till sin kunskap i bildbehandling, och den tid de vill spendera i sin analys. Isig, CellProfiler eller ImageJ/Fiji är kraftfulla verktyg som kombinerar både användbarhet och funktionalitet3. Isig är ett fristående verktyg som presenterar ett tydligt grafiskt användargränssnitt (GUI), och särs...

Ljusmikroskopi och, i synnerhet, fluorescensmikroskopi är robusta och mångsidiga tekniker som vanligen används inom biologiska vetenskaper. De ger tillgång till exakt lokalisering av olika biomolekyler som proteiner eller RNA genom deras specifika fluorescerande märkning. Det senaste årtiondet har präglats av snabba framsteg inom mikroskopi och bildteknik vilket framgår av 2014 års Nobelpris i kemi som tilldelas Eric Betzig, Stefan W. Hell och William E. Moerner för utveckling av super-resolved fluorescensmikroskopi (SRFM)1. SFRM kringgår diffraktionsgränsen för traditionell optisk mikroskopi för att föra in den i nanodimensionen. Förbättring av tekniker som live-imaging eller hög genomströmning screening metoder ökar också mängden och komplexiteten i data att behandla för varje experiment. För det mesta står forskare inför höga heterogena populationer av celler och vill analysera fenotyper på encellig nivå.
Inledningsvis utfördes analyser som foci-räkning av ögat, vilket föredras av vissa forskare eftersom det ger full visuell kontroll över räkningsprocessen. Manuell analys av sådana data är dock för tidskrävande, leder till variationer mellan observatörer och ger inte tillgång till mer komplexa funktioner så att datorstödda metoder blir allmänt använda och nästan oundvikliga2. Bioimageinformatikmetoder ökar avsevärt dataanalysens effektivitet och är fria från den oundvikliga operatörens subjektivitet och potentiella bias hos den manuella räkningsanalysen. Den ökade efterfrågan på detta område och förbättringen av datorkraft ledde till utvecklingen av ett stort antal bildanalysplattformar. Några av dem är fritt tillgängliga och ger tillgång till olika verktyg för att utföra analyser med persondatorer. En klassificering av open access-verktyg har nyligen etablerats3 och presenterar Icy4 som en kraftfull programvara som kombinerar användbarhet och funktionalitet. Dessutom har Isig fördelen av att kommunicera med ImageJ.
För användare utan bildanalys expertis, de största hindren är att välja lämpligt verktyg enligt de problematiska och korrekt ställa parametrar som ofta inte är väl förstådda. Dessutom är installationstiderna ofta långa. Icy föreslår en användarvänlig peka-och-klicka-gränssnitt som heter "Protokoll" för att utveckla arbetsflödet genom att kombinera några plugins som finns i en uttömmande samling4. Den flexibla modulära designen och peka-och-klicka-gränssnittet gör det möjligt för icke-programmerare att göra en analys möjlig för icke-programmerare. Här presenterar vi ett arbetsflöde som kallas Substructure Analyzer, utvecklat i Isigs gränssnitt, vars funktion är att analysera fluorescerande signaler i specifika cellulära fack och mäta olika funktioner som ljusstyrka, foci nummer, foci storlek och rumslig fördelning. Det här arbetsflödet tar upp flera problem, till exempel kvantifiering av signaltranslotering, analys av transfected celler som uttrycker en fluorescerande reporter eller analys av foci från olika cellulära understrukturer i enskilda celler. Det gör det möjligt att samtidigt bearbeta flera bilder, och utdataresultat exporteras till ett flikavgränsat kalkylblad som kan öppnas i vanliga kalkylbladsprogram.
Substructure Analyzer-rörledningen presenteras i figur 1. För det första bearbetas alla bilder i en angiven mapp för att förbättra signal- och brusförhållandet. Det här steget ökar effektiviteten i följande steg och minskar körtiden. Sedan identifieras och segmenteras de intresseområden som motsvarar de bildområden där lysrörssignalen ska upptäckas. Slutligen analyseras lysrörssignalen och resultaten exporteras till ett flikavgränsat kalkylblad.
Objektsegmentering (detektion av gränser) är det mest utmanande steget i bildanalys, och dess effektivitet avgör noggrannheten i de resulterande cellmätningarna. De första objekt som identifieras i en bild (kallas primära objekt) är ofta kärnor från DNA-färgade bilder (DAPI eller Hoechst färgning), även om primära objekt kan också vara hela celler, pärlor, prickar, tumörer, eller vad färgade objekt. I de flesta biologiska bilder, celler eller kärnor röra varandra eller överlappning orsakar enkla och snabba algoritmer att misslyckas. Hittills kan ingen universell algoritm utföra perfekt segmentering av alla objekt, främst på grund av att deras egenskaper (storlek, form eller textur) modulera effektiviteten i segmentering5. De segmenteringsverktyg som vanligen distribueras med mikroskopiprogramvara (till exempel MetaMorph Imaging Software by Molecular Devices6eller NIS-Elements Advances Research software av Nikon7) baseras i allmänhet på standardtekniker som korrelationsmatchning, trösklar eller morfologiska operationer. Även om de är effektiva i grundläggande system presenterar dessa övergeneraliserade metoder snabbt begränsningar när de används i mer utmanande och specifika sammanhang. Segmentering är i själva verket mycket känslig för experimentella parametrar som celltyp, celldensitet eller biomarkörer, och kräver ofta upprepade justeringar för en stor datauppsättning. Arbetsflödet Substructure Analyzer integrerar både enkla och mer sofistikerade algoritmer för att föreslå olika alternativ anpassade till bildkomplexitet och användarnas behov. Det föreslår särskilt markör-baserade vattendelarealgoritm 8 för mycket grupperade objekt. Effektiviteten i den här segmenteringsmetoden är beroende av valet av enskilda markörer för varje objekt. Dessa markörer väljs manuellt för det mesta för att få rätt parametrar för fullständig segmentering, vilket är mycket tidskrävande när användare står inför ett stort antal objekt. Substructure Analyzer föreslår en automatisk detektering av dessa markörer, vilket ger en mycket effektiv segmenteringsprocess. Segmentering är för det mesta det begränsande steget för bildanalys och kan avsevärt ändra bearbetningstiden beroende på bildens upplösning, antalet objekt per bild och nivån för klustring av objekt. Typiska rörledningar kräver några sekunder till 5 minuter per bild på en vanlig stationär dator. Analys av mer komplexa bilder kan kräva en mer kraftfull dator och vissa grundläggande kunskaper i bildanalys.
Flexibiliteten och funktionaliteten i detta arbetsflöde illustreras med olika exempel i de representativa resultaten. Fördelarna med detta arbetsflöde visas särskilt genom studiet av nukleära understrukturer under oxidativ stress (OS) förhållanden. OS motsvarar en obalans av redox homeostas till förmån för oxidanter och är associerad med höga nivåer av reaktiva syrearter (ROS). Eftersom ROS fungerar som signalering molekyler, förändringar i deras koncentration och subcellulärlokalisering påverkar positivt eller negativt en myriad av vägar och nätverk som reglerar fysiologiska funktioner, inklusive signaltransduktion, reparationsmekanismer, genuttryck, celldöd, och spridning9,10. OS är alltså direkt involverat i olika patologier (neurodegenerativa och hjärt-kärlsjukdomar, cancer, diabetes, etc.), men också cellulärt åldrande. Därför är dechiffrera konsekvenserna av OS på den mänskliga cellens organisation och funktion ett avgörande steg i förståelsen av OS roller i uppkomsten och utvecklingen av mänskliga patologier. Det har fastställts att OS reglerar genuttryck genom att modulera transkription genom flera transkriptionsfaktorer (p53, Nrf2, FOXO3A)11, men också genom att påverka regleringen av flera sam- och post-transkriptionsprocesser såsom alternativ splitsning (AS) av pre-RNAs12,13,14. Alternativ splitsning av primära kodning och icke-kodning avskrifter är en viktig mekanism som ökar kodningskapaciteten hos genomen genom genomet genom att producera transkriptisoformer. AS utförs av en enorm ribonucleoprotein komplex som kallas skarvliceosome, som innehåller nästan 300 proteiner och 5 U-rika små nukleära RNAs (UsnRNAs)15. Skarvolicoom montering och AS är tätt kontrollerade i celler och vissa steg av skarvar mognad förekommer inom membran-mindre kärnfack som heter Cajal Bodies. Dessa nukleära understrukturer kännetecknas av den dynamiska karaktären av deras struktur och deras sammansättning, som huvudsakligen utförs av multivalenta interaktioner av deras RNA och proteinkomponenter med coilin protein. Analys av tusentals celler med substructure Analyzer arbetsflödet tillåts karakterisering av aldrig beskrivna effekter av OS på Cajal Organ. Faktum är att erhållna data tyder på att OS ändrar kärnbildning av Cajal organ, inducera en nukleoplasmic omfördelning av coilin proteinet i många mindre nukleära högborgar. En sådan förändring av strukturen hos Cajal Organ kan påverka mognaden av skarvar och delta i AS modulering av OS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1105px;" width="1104">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">28908</td>
			<td style="width:472px;">to fix the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11008</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21425</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A34055</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Bovine serum albumin standard (BSA)</td>
			<td style="width:183px;">euromedex</td>
			<td style="width:137px;">04-100-812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D5796-500ml</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040-5ML</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human: HeLa S3 cells</td>
			<td>IGBMC, Strasbourg, France</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>cell line used to perform the experiments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">H1009-100ml</td>
			<td>used as a stressing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Mouse monoclonal anti-coilin</td>
			<td style="width:183px;">abcam</td>
			<td style="width:137px;">ab11822</td>
			<td>Coilin-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>epifluoresecence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">PBS pH 7.4 (10x)</td>
			<td style="width:183px;">gibco</td>
			<td style="width:137px;">70011-036</td>
			<td>to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Rabbit polyclonal anti-53BP1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-16565</td>
			<td>53BP1-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit polyclonal anti-EDC4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4200114</td>
			<td>EDC4-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683</td>
			<td>to permeabilize the cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images

Det senaste årtiondet har präglats av genombrott inom fluorescensmikroskopitekniker som illustreras av rumslig upplösningsförbättring men också i live-cell imaging och hög genomströmningsmikroskopitekniker. Detta ledde till en konstant ökning av mängden och komplexiteten hos mikroskopidata för ett enda experiment. Eftersom manuell analys av mikroskopidata är mycket tidskrävande, subjektiv och förbjuder kvantitativa analyser, blir automatisering av bioimageanalys nästan oundviklig. Vi byggde ett informatikarbetsflöde kallat Substructure Analyzer för att helt automatisera signalanalys i bioimages från fluorescerande mikroskopi. Detta arbetsflöde är utvecklat på den användarvänliga plattformen med öppen källkod Icy och kompletteras med funktioner från ImageJ. Den omfattar förbehandling av bilder för att förbättra förhållandet mellan signal och bru, individuell segmentering av celler (detektion av cellgränser) och detektion/kvantifiering av cellkroppar som berikats i specifika cellfack. Den största fördelen med detta arbetsflöde är att föreslå komplexa bio-imaging funktioner för användare utan bildanalys expertis genom ett användarvänligt gränssnitt. Dessutom är den mycket modulär och anpassad till flera frågor från karakterisering av nukleär/cytoplasmatisk flyttning till jämförande analys av olika cellkroppar i olika cellulära understrukturer. Funktionaliteten i detta arbetsflöde illustreras genom studiet av Cajal (lindade) Organ under oxidativ stress (OS) villkor. Data från fluorescensmikroskopi visar att deras integritet i mänskliga celler påverkas några timmar efter induktion av OS. Denna effekt kännetecknas av en minskning av coilin kärnbildning i karakteristiska Cajal organ, i samband med en nukleoplasmic omfördelning av coilin till ett ökat antal mindre högborgar. Den centrala roll coilin i utbytet mellan CB komponenter och den omgivande nukleoplasm tyder på att OS inducerad omfördelning av coilin kan påverka sammansättning och funktionalitet Cajal organ.

Alla beskrivna analyser har utförts på en vanlig bärbar dator (64-bitars processor med fyra kärnor på 2,80 GHz med 16 GB RAM-minne (Random-Access Memory)) som arbetar med 64-bitarsversionen av Java. Random-access minne är en viktig parameter att tänka på, beroende på mängden och upplösningen av bilder att analysera. Med hjälp av 32-bitarsversionen av Java begränsar minnet till ca 1300 MB, vilket kan vara olämpligt för stordataanalys, medan 64-bitarsversionen gör det möjligt att öka minnet som allokerats...

Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

Vi presenterar ett fritt tillgängligt arbetsflöde byggt för snabb utforskning och noggrann analys av cellulära organ i specifika cellfack i fluorescensmikroskopibilder. Detta användarvänliga arbetsflöde är utformat på programvaran med öppen källkod Icy och använder även ImageJ-funktioner. Rörledningen är prisvärd utan kunskap i bildanalys.

Substructure Analyzer: Ett användarvänligt arbetsflöde för snabb utforskning och korrekt analys av cellulära organ i fluorescensmikroskopi bilder

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Substructure analyzer är ett användarvänligt arbetsflöde som utför automatisk analys av flera processmikroskopimått. Det betyder inte noll ton öppen källkod Icy och även med hjälp av maskin funktionaliteter. Viktigt är detta arbetsflöde prisvärda utväg producera kunskap och bilder analys.Flera kanalbilder laddas inom arbetsflödet och förbeföras för att förbättra signalen till brusförhållandet och för att ta bort bildtagning eller defekter. Sedan isolerar bildsegmentering områden av intresse, även kallat ROIs från bakgrunden. Flera metoder för segmentering är tillgängliga beroende på nivån för klustring och arten av objekten av intresse.Segmenterade objekt sparas med en viss deskriptor i en viss mapp. Kraft och signaler analyseras sedan inom raderna och flera funktioner som plats, storlek, form i densitet texturer men antal och storlek exporteras till ett automatiskt skapat kalkylblad. Ladda ner Icy från Icy webbplats.Sedan ladda substructure Analyzer Protocol från Icy bibliotek av protokoll. Öppna Icy, och klicka på verktyg i menyn i menyfliksområdet. Klicka på protokoll för att öppna protokoll redaktör gränssnitt.Klicka på last och öppna protokollet substructure analyzer. Protokollinläsning kan ta några sekunder. Arbetsflödet är sammansatt av 13 Allmänna block varje block som arbetar som en pipeline som består av flera lådor som utför specifika underaktiviteter.Varje block eller ruta är numrerad och har en specifik rang inom arbetsflödet. Genom att klicka på detta nummer, tilldela den närmaste möjliga positionen till den första till det valda blocket. Positioner av de andra blocken omorganiseras.Genom att klicka på den övre vänstra hörnikonen kan blocket komprimeras expanderat. Det kan också förstoras, smalnas eller tas bort. Varje pipeline av arbetsflödet är korrekt uppstod genom ett nätverk av lådor som är sammankopplade med andra indata och utdata.För att skapa en anslutning, klicka på en utgång och underhålla tills markören gäller någon ingång. Anslutningar kan tas bort genom att klicka på utdatataggen. Om det behövs byta namn på filerna så att sekvenser som ska sammanfogas, har samma namn prefix följt av distinkta avgränsare.Till exempel namnges sekvenser av enskilda kanaler från en bild A bild Ett understreck rött, bild Ett understreck blått och så vidare. I samma mapp skapar du en ny mapp per kanal som ska kopplas. Om du till exempel vill slå ihop röda, gröna och blå kanaler skapar du tre mappar och lagrar motsvarande sekvenser inom dessa mappar.Använd bara blockkopplingskanalerna, ta bort de andra blocken och spara protokollet som sammanfogningskanaler. Tillgång till rutorna för att kunna ställa in parametrar. I rutan, kanalnummer x, välj vilken kanal som ska extraheras.I klassiska RGB-bilder är noll röd, en är grön och två är blå. I rutan, mappkanalnummer x, Backslash namnet på mappen som innehåller bilder av kanal x. I rutan, separat kanalnummer x.Avgränsaren använder för bildnamn. I rutan, färgkarta kanal nummer x, ange med ett nummer vilken kolumn av modell som ska användas för att visualisera motsvarande kanal i Icy. I rutan, format av sammanslagna bilder, skriva tillägget för att spara sammanslagna bilder.På övre vänstra hörnet av kopplingskanalerna blocket, klicka på länken direkt till höger om mappen. I den öppna dialogrutan som visas, dubbelklicka på mappen som innehåller sekvenser av den första kanalen som har definierats i rutan mapp kanal nummer ett. Klicka sedan på öppna, sprang protokollet.Sammanfogade bilder sparas i en kopplad mapp i samma katalog som mapparna i enskilda kanaler. Objekt segmentering, är den mest utmanande steget i bildanalys. Det är effektivitet avgör noggrannheten i den resulterande uppsättning mätningar.Så integrerar strukturanalysator både enkla och mer komplexa algoritmer för att föreslå olika alternativ anpassade till bildkomplexitet och användarbehov. Om objekt inte rör varandra behöver inte andra användare skilja klustrade objekt individuellt med blocksegmenteringen A.När objekt inte rör varandra, men vissa av dem ligger i närheten, använd blocksegmenteringen B.För objekt med hög klustringsnivå och en konvex form använder du blocksegmenteringen C.If-objekt presenterar en hög klustringsnivå och har oregelbundna former , använd blocksegmenteringen D.Använd blocksegmenteringen i kluster cytoplasman för att segmentera röra cytoplasma individuellt med hjälp av segmenterade kärnor som markörer. Block adaptiv för primära objekt segmentering kan bearbeta oberoende så att flera block, kan användas i samma kör för att jämföra deras effektivitet för en viss understruktur, eller att segmentera olika typer av understrukturer.För att illustrera segmentering, blocket segmentering B, som kommer att passa ett större antal frågor har valts. För att använda denna blogg. Först, länka den för att välja mapp.Sedan åberopar kanalsignal ställa in kanalen för objektet till segment. Till exempel för att motsvara B, i rutan HK betyder, ange intensitetsklasser parameter och ungefärliga minsta och maximala storlekar i pixlar av objekt som ska upptäckas. För intensitetsklasser kommer ett värde på två att klassificera pixlar i två klasser, bakgrund och förgrund.Den anpassas alltså när kontrasten mellan objekten och bakgrunden är hög. Om förgrundsobjekt har sina ursprungsintensiteter, eller kontrasten mot bakgrunden är låg, ökar du antalet klasser. I rutan aktiva konturer optimera detektering av objekt kantlinjer.Under processen kommer en mapp att skapas för att spara bilder av segmenterade objekt. I rutan text, namn denna mapp, till exempel segmentera kärnor. Om du vill ställa in formatet för att spara bilder av segmenterade objekt fyller du lådformatet med bilder av segmenterade objekt, sprang protokollet.Mappen skapas i mappen som innehåller kopplade bilder. Olika block har utvecklats för att anpassa sig till antalet lagar och kanaler och cellfack som ska analyseras i segmenterade objekt. I följande exempel, för analysen, välj block fluorescens analys P.Två kanaler i samma fack och länka den för att välja mapp.Segmenteringsblocket ska ha bearbetats innan denna analys ställa in parametrarna inkorgen mapp bilder ROI, skriva namnet på mappen som innehåller bilder av segmenterade objekt föregås av ett omsnedstreck. Inkorgsformat av bilder av segmenterade objekt, skriv formatets används för att spara bilder av segmenterade objekt. Inkorg döda kantlinjer för att ta bort båda objekten.Annars, just nu, installation av den mer fullständigt J insamling av bildbehandling krävs för att använda denna funktion. I lådor kanal dekorsignal, ställa in den kanal där fläckar måste upptäckas. I klassiska RTP-bilder är noll röd En är grön och två är blå.I lådor namn på lokaliserad molekyl, skriv namnet på molekylen lokalisera in i fläckarna. Antal fält att besvara beror på antalet molekyler. I lådor våglängder per detektor block, ställa fläckar detekteringsparametrar för varje enskild Kanal.För att bearbeta olika block i ett rum, hålla anslutningar av valda block, med blocket välj mapp. Se till att deras rankas under den goda bearbetningen av arbetsflödet. Innan arbetsflödet körs rekommenderas även att ta bort oanvända block och spara det nya protokollet med ett annat namn.Klicka på kör för att starta arbetsflödet. När det öppnar ögat titta böcker visas. Dubbelklicka på mappen som innehåller sjuksköterskebilderna Klicka sedan på Öppna, arbetsflödet kommer automatiskt att köras.Om behandlingen är slutförd meddelandet, arbetsflödet som utförts utan problem kommer att visas i det nedre högra hörnet, kommer alla blocken att flaggas med den gröna tecknet. Om inte blocket och insidan rutan presenterar pilen tecken kommer att indikera elementen korrekt. Viktigt är att flera skärmar gör det möjligt att visualisera mellanliggande resultat under varje körning i syfte att styra bearbetningen.Snabbheten, flexibiliteten och funktionaliteten i detta arbetsflöde kommer att begränsas till olika exempel. I detta första exempel analyserar vi kärn-flyttningen av NF kappa B.Efter simulering med ökande koncentrationer av TNF alfa. Kärnor och cytoplasma var avgränsade med hjälp av segmentering C och E block.NF kappa B blomstra i signal analyserades med hjälp av den globala flyttning analysblocket. Mer än 40, 000 celler i 96 bilder analyserades i 26 minuter. De genererade data användes för att fastställa denna dos responskurva som visar induktion av NF Kappa B kärn-flyttning av TNF alfa.Arbetsflödet kan också användas för att identifiera filstorlek och extrahera specifik information om deras funktioner. Här upptäcktes egenskaper i enskilda celler genom att lokalisera EDC för protein. Kärnor i cytoplasman var avgränsade med hjälp av segmentering A och E block.EDC4 analyserades med hjälp av fluorescens analys block C.In detta exempel, cytoplasmatisk EDC4 tecken har upptäckts i båda analyseras celler. Storleken i pixlar på varje hel sida anges i kalkylarket. I detta exempel tog vi fördel av mångsidigheten i arbetsflödet för att studera kolhydrater en längre kinetik av oxidativ stress.Nuclear force tecken på coilin är de viktigaste strukturella komponenterna i kolhydrater Deras antal och storlek analyserades enligt storlek, stressstatus, bedöms av dubbla strandbrytningar lokaliserade med 53BP1. Kärnor var avgränsade med hjälp av segmentering proxy, Kärnkraft och signaler av coillin och 53BP1, var samtidigt analyseras med hjälp av fluorescens analys Block B.Använda data från 2300 enskilda celler, vi bevisade en betydande ökning av antalet Greenfield plats efter stress induktion i samband med en minskning av deras storlek. Dessa uppgifter tyder starkt på att oxidativ stress förändringar kärnbildning makt en kolhydrater i med hjälp av en nukleär plasmic distribution till antal mindre kärnkraft för plats för att motivera en förändring i coilin uttryck kan ändra dess lokalisering och ändra kärnbildning av kurvan organ.En exogen GFP coilin fusion protein var overexpressed. Funktioner i våra kroppar Analyserades enligt GFP coilin överuttryck nivå. Kärnor var avgränsade med hjälp av segmentering block A.The fluorescerande signaler av coilin och GFP coilin, var samtidigt analyseras med hjälp av fluorescens analys block B.The överuttryck nivå av GFP coilin återspeglades av innebörden densitet av GFP signalen i enskilda kärnor.Data som genereras av substrukturanalysator visar att GFP coilin i överuttryck avsevärt ökar storleken och antalet kolhydrater. Eftersom oxidativ stress ökar antalet kolhydrater men minskar deras storlek. Dessa data kan återspegla att oxidativ stress effekt på strukturen av kolhydrater är troligen induceras av en förändring av deras sammansättning snarare än av en effekt på viss mängd coilin.Så struktur analysator är en mycket modulär arbetsflöde för bio bildanalys. Den kan anpassas till flera sammanhang från den enkla sammanslagningen av kanaler till kvantifiering av flera våningar och signaler i tusentals celler. Den integrerar också enkla och komplexa segmenteringsalgoritmer beroende på bildkomplexitet och automatiserar extraktionen av fluorescerande signalfunktioner.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Låg kostnad Cryo-ljusmikroskopi Stage Fabrication för korrelerade ljus / elektronmikroskopi

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Provberedning, Imaging och analysprotokoll för knivsegg Scanning Mikroskopi

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Riktad Cellular Self-Assembly att tillverka-cellerna Tissue Ringar för Biomekaniska analys och Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Extraction för riktade Stabil isotoputspädning Vätskekromatografi-masspektrometri Analys

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisation och Dynamics i mikroorganismer, med total inre Mikroskopi fluorescens

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Korrelat mikroskopi för 3D Strukturell Analys av dynamisk samverkan

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Högupplöst Spatiotemporal Analys av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifierad Två-foton Mikroskop: En ansökan till spårning av intracellulära vesiklar

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Från Snabb fluorescens avbildning till molekylär diffusion lagen om Live cellmembran i en kommersiell mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-släckning av en Liposomal-inkapslad Nära-infraröd fluoroforen som ett verktyg för<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk avbildning

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...