Name: substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images
Uploaded: 2020-07-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

G.H., Ministère Délégué à la Recherche et aux Technologies'den lisansüstü burs ile desteklenmiştir. L.H. Institut de Cancérologie de Lorraine (ICL) tarafından lisansüstü burs ile desteklenirken, Q.T. ikinci "Investissements d'Avenir" programı FIGHT-HF(referans: ANR-15-RHU4570004) kapsamında Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) tarafından denetlenen bir kamu hibesi tarafından desteklendi. Bu çalışma CNRS ve Université de Lorraine (UMR 7365) tarafından finanse edilmiştir.

NOT: Kullanıcı dostu öğreticiler icyweb sitesinde http://icy.bioimageanalysis.org mevcuttur.
1. Icy ve Alt Yapı Analizörü protokolünü indirin
<ol><li>Buzlu web sitesinden(http://icy.bioimageanalysis.org/download) indirin ve Alt Yapı Analizörü protokolünü indirin: http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest. NOT: 64 bit işletim sistemi...

<ol>
	<li>M&#246;ckl, L., Lamb, D. C., Br&#228;uchle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolved+fluorescence+microscopy:+Nobel+Prize+in+Chemistry+2014+for+Eric+Betzig,+Stefan+Hell,+and+William+E.+Moerner.">Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner.</a> Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).</li><li>Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imagining+the+future+of+bioimage+analysis.">Imagining the future of bioimage analysis.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).</li><li>Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., M&#252;nzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+free+software+tools+for+image+analysis+of+fluorescence+cell+micrographs.">Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs.</a> Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affordable+image+analysis+using+NIH+Image/ImageJ.">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).</li><li>Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+on+image+segmentation+techniques.">Survey on image segmentation techniques.</a> Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).</li><li>. MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy">https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy</a> (2018)</li><li>. NIS-Elements Imaging Software Available from: <a target="_blank" href="https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element">https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element</a> (2014)</li><li>Meyer, F., Beucher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+segmentation.">Morphological segmentation.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+Function+in+Redox+Signaling+and+Oxidative+Stress.">ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>D'Autr&#233;aux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+as+signalling+molecules:+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis.+Nature+Reviews.">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).</li><li>Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS,+Cell+Senescence,+and+Novel+Molecular+Mechanisms+in+Aging+and+Age-Related+Diseases.">ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).</li><li>Disher, K., Skandalis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+the+modulation+of+mRNA+splicing+fidelity+in+humans+by+oxidative+stress+and+p53.">Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53.</a> Genome. 50 (10), 946-953 (2007).</li><li>Takeo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-induced+alternative+splicing+of+transformer+2&#946;+(SFRS10)+and+CD44+pre-mRNAs+in+gastric+epithelial+cells.">Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2&#946; (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).</li><li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+Stress+Triggers+Body-Wide+Skipping+of+Multiple+Exons+of+the+Spinal+Muscular+Atrophy+Gene.">Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene.</a> PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).</li><li>Will, C. L., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spliceosome+Structure+and+Function.">Spliceosome Structure and Function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).</li><li>Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotated+high-throughput+microscopy+image+sets+for+validation.">Annotated high-throughput microscopy image sets for validation.</a> Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+bodies+are+linked+to+genome+conformation.">Cajal bodies are linked to genome conformation.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7, 100 (2006).</li><li>McQuin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+3.0:+Next-generation+image+processing+for+biology.">CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).</li></ol>

Floresan hücre görüntülerinin analizi için giderek artan sayıda özgür yazılım aracı mevcuttur. Kullanıcılar, sorunlu larının karmaşıklığına, görüntü işlemedeki bilgilerine ve analizlerinde harcamak istedikleri zamana göre yeterli yazılımı doğru bir şekilde seçmelidir. Buzlu, CellProfiler veya ImageJ /Fiji hem kullanılabilirlik hem de işlevselliği birleştiren güçlü araçlardır3. Icy net bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) sunan tek başına bir araçtır, v...

Işık mikroskobu ve özellikle floresan mikroskobu biyolojik bilimlerde yaygın olarak kullanılan sağlam ve çok yönlü tekniklerdir. Proteinler veya RNA gibi çeşitli biyomoleküllerin spesifik floresan etiketlemeyoluyla kesin lokalizasyonuna erişim verirler. Son on yılda mikroskobik ve görüntüleme teknolojilerinde hızlı gelişmeler ile karakterize edilmiştir 2014 Nobel Kimya Ödülü Eric Betzig, Stefan W. Hell ve William E. Moerner süper çözülmüş1floresan mikroskopi mikroskobu (SRFM) gelişimi için verilen . SFRM, geleneksel optik mikroskopinin kırınım sınırını atlayarak nanoboyuta getirir. Canlı görüntüleme veya yüksek iş elde tarama yaklaşımları gibi tekniklerde iyileşme, her deney için tedavi edilmesi gereken verilerin miktarını ve karmaşıklığını da artırır. Çoğu zaman, araştırmacılar hücrelerin yüksek heterojen popülasyonları ile karşı karşıya ve tek hücre düzeyinde fenotipleri analiz etmek istiyorum.
Başlangıçta, foci sayma gibi analizler göz tarafından yapılmıştır ve bu durum bazı araştırmacılar tarafından tercih edilir, çünkü sayım süreci üzerinde tam görsel kontrol sağlar. Ancak, bu tür verilerin manuel analizi çok zaman alıcı, gözlemciler arasında değişkenlik yol açar ve bilgisayar destekli yaklaşımlar yaygın olarak kullanılan ve neredeyse kaçınılmaz hale geliyor böylece daha karmaşık özelliklere erişim vermez2. Biyogörüntü bilişim yöntemleri veri analizinin verimliliğini önemli ölçüde artırır ve manuel sayma analizinin kaçınılmaz operatör öznelliği ve potansiyel önyargısı içermez. Bu alandaki artan talep ve bilgisayar gücünün iyileştirilmesi çok sayıda görüntü analiz platformunun geliştirilmesine yol açmıştır. Bazıları serbestçe kullanılabilir ve kişisel bilgisayarlarla analiz yapmak için çeşitli araçlara erişim sağlar. Açık erişim araçları bir sınıflandırma son zamanlarda3 kurulmuştur ve kullanılabilirlik ve işlevselliği birleştiren güçlü bir yazılım olarak Icy4 sunar. Ayrıca, Icy ImageJ ile iletişim avantajı vardır.
Görüntü analizi uzmanlığı olmayan kullanıcılar için, ana engeller genellikle iyi anlaşılamayan sorunlu ve doğru ayar parametrelerine göre uygun aracı seçmektir. Ayrıca, kurulum süreleri genellikle uzun. Buzlu kapsamlı bir koleksiyon içinde bulunan bazı eklentileri birleştirerek iş akışı geliştirmek için "Protokoller" adlı kullanıcı dostu nokta ve tıklama arayüzü önerir4. Esnek modüler tasarım ve nokta-ve-tık arabirimi, programcı olmayanlar için bir analiz ayarlamayı mümkün kılabilir. Burada, işlevi belirli hücresel bölmelerde floresan sinyalleri analiz etmek ve parlaklık, foci sayısı, foci boyutu ve uzamsal dağılım gibi farklı özellikleri ölçmek olan Icy'nin arayüzünde geliştirilen Alt Yapı Analizörüadlı bir iş akışı salıyoruz. Bu iş akışı, sinyal translokasyonunun niceliği, floresan muhabiri ifade eden transfected hücrelerin analizi veya tek tek hücrelerdeki farklı hücresel alt yapılardan gelen fokların analizi gibi çeşitli konuları ele almaktadır. Birden çok görüntünün eşzamanlı olarak işlenmesine olanak tanır ve çıktı sonuçları, sık kullanılan elektronik tablo programlarında açIlebilen sekme sınırlandırılmış bir çalışma sayfasına dışa aktarılır.
Alt Yapı Çözümleyici boru hattı Şekil 1'desunulmuştur. İlk olarak, belirli bir klasörde bulunan tüm görüntüler, sinyallerini gürültü oranına göre geliştirmek için önceden işlenir. Bu adım, aşağıdaki adımların verimliliğini artırır ve çalışma süresini azaltır. Daha sonra, floresan sinyalinin algılandığı görüntü alanlarına karşılık gelen İlgi Bölgeleri (ROI' ler) tanımlanır ve bölümlere alınır. Son olarak, floresan sinyali analiz edilir ve sonuçlar sekme-delimited çalışma sayfasına dışa aktarılır.
Nesne bölümlemesi (sınırların saptanması) görüntü analizinde en zorlu adımdır ve verimliliği elde edilen hücre ölçümlerinin doğruluğunu belirler. Bir görüntüde tanımlanan ilk nesneler (birincil nesneler olarak adlandırılır) genellikle DNA lekeli görüntülerden (DAPI veya Hoechst boyama) çekirdeklerdir, ancak birincil nesneler de bütün hücreler, boncuklar, benekler, tümörler veya lekeli nesneler olabilir. Biyolojik görüntülerin çoğunda hücreler veya çekirdekler birbirine dokunur veya örtüşarak basit ve hızlı algoritmaların başarısız olmasıyla oluşur. Bugüne kadar, hiçbir evrensel algoritma tüm nesnelerin mükemmel segmentasyon gerçekleştirebilirsiniz, çoğunlukla çünkü özellikleri (boyut, şekil veya doku) segmentasyon etkinliğini modüle5. Genellikle mikroskop yazılımı ile dağıtılan segmentasyon araçları (Moleküler Cihazlar tarafından MetaMorf Görüntüleme Yazılımıgibi 6, veya Nikon7tarafından NIS-Elements Advances Araştırma yazılımı) genellikle korelasyon eşleştirme, eşik veya morfolojik işlemler gibi standart tekniklere dayanmaktadır. Temel sistemlerde verimli olmasına rağmen, bu aşırı genelleştirilmiş yöntemler daha zorlu ve belirli bağlamlarda kullanıldığında hızla sınırlamalar sunar. Gerçekten de, segmentasyon hücre tipi, hücre yoğunluğu veya biyobelirteçler gibi deneysel parametrelere karşı son derece hassastır ve sık sık büyük bir veri kümesi için tekrarlanan ayarlama gerektirir. Alt Yapı Çözümleyici iş akışı, görüntü karmaşıklığına ve kullanıcı gereksinimlerine uyarlanmış farklı alternatifler önermek için hem basit hem de daha gelişmiş algoritmaları bütünleştirir. Yüksek kümelenmiş nesneler için işaretçi tabanlı havzaalgoritması 8'i özellikle önerir. Bu segmentasyon yönteminin verimliliği, her nesneüzerinde tek tek işaretçilerin seçimine dayanır. Bu işaretçiler, tam segmentasyon için doğru parametreleri elde etmek için çoğu zaman el ile seçilir, bu da kullanıcıların çok sayıda nesneyle karşılaştığında çok zaman alır. Alt Yapı Çözümleyicisi, yüksek verimli bir segmentasyon işlemi sağlayarak bu işaretçilerin otomatik olarak algılanmasını önerir. Segmentasyon, çoğu zaman, görüntü çözümlemesi sınırlayıcı adım ve önemli ölçüde görüntünün çözünürlüğü, görüntü başına nesne sayısı ve nesnelerin kümeleme düzeyine bağlı olarak işlem süresini değiştirebilirsiniz. Tipik ardışık hatlar, standart bir masaüstü bilgisayarda görüntü başına birkaç saniye ile 5 dakika arasında bir süre gerektirir. Daha karmaşık görüntülerin analizi daha güçlü bir bilgisayar ve görüntü analizi nde bazı temel bilgiler gerektirebilir.
Bu iş akışının esnekliği ve işlevselliği temsili sonuçlarda çeşitli örneklerle gösterilmiştir. Bu iş akışının avantajları özellikle oksidatif stres (OS) koşulları altında nükleer alt yapıların incelenmesi ile görüntülenir. Os oksidanlar lehine redoks homeostazı bir dengesizlik karşılık gelir ve reaktif oksijen türlerinin yüksek düzeyde ile ilişkilidir (ROS). ROS sinyal molekülleri olarak hareket ettiği için, konsantrasyonlarındaki ve hücre altı lokalizasyonlarındaki değişiklikler, sinyal iletimi, onarım mekanizmaları, gen ekspresyonu, hücre ölümü ve çoğalma9,10gibi fizyolojik fonksiyonları düzenleyen sayısız yolu ve ağı olumlu veya olumsuz yönde etkiler. İşletim sistemi böylece doğrudan çeşitli patolojiler (nörodejeneratif ve kardiyovasküler hastalıklar, kanserler, diyabet, vb) değil, aynı zamanda hücresel yaşlanma yer almaktadır. Bu nedenle, işletim sistemi'nin insan hücresinin organizasyonu ve işlevi üzerindeki sonuçlarının deşifre edilmesi, insan patolojilerinin başlangıcında ve gelişiminde os'un rollerinin anlaşılmasında önemli bir adım teşkil etmektedir. İşletim sistemi çeşitli transkripsiyon faktörleri (p53, Nrf2, FOXO3A)11ile transkripsiyon modüle ederek gen ekspresyonunu düzenler, ancak aynı zamanda alternatif rnas12,13,14alternatif birleştirme (AS) gibi çeşitli co- ve post-transkripsiyonel süreçlerin düzenlenmesini etkileyerek kurulmuştur .14 Birincil kodlama ve kodlamayan transkriptlerin alternatif olarak birleştirilmesi, transkript izoformları üreterek genomların kodlama kapasitesini artıran temel bir mekanizmadır. AS, yaklaşık 300 protein ve 5 U-zengin küçük nükleer RNA (UsnRNA) içeren spliceosome adı verilen büyük bir ribonükleoprotein kompleksi tarafından gerçekleştirilir15. Spliceosome montaj ve AS sıkıca hücrelerde kontrol edilir ve spliceosome olgunlaşma bazı adımlar Cajal Bodies adlı membran-az nükleer bölmeleri içinde meydana gelir. Bu nükleer alt yapılar, yapılarının dinamik yapısı ve bileşimi ile karakterizedir ve bunlar esas olarak RNA ve protein bileşenlerinin bobin proteini ile çok yönlü etkileşimleri ile gerçekleştirilir. Alt Yapı Çözümleyici iş akışı ile binlerce hücrenin analizi, os'un Cajal Cisimler üzerindeki hiçbir zaman tanımlanmamış etkilerinin karakterizasyonuna olanak sağladı. Gerçekten de elde edilen veriler, OS'lerin Cajal Cisimlerinin çekirdekleşmesini modicikçe modiciye dönüştürerek bobin proteininin nükleoplazmik olarak çok sayıda daha küçük nükleer fosiye ye dönüşmesini indüklediğini göstermektedir. Cajal Bodies yapısının böyle bir değişiklik spliceosome olgunlaşmasını etkileyebilir ve OS tarafından AS modülasyonu katılmak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1105px;" width="1104">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:313px;">16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">28908</td>
			<td style="width:472px;">to fix the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11008</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21425</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Alexa Fluor 555 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A34055</td>
			<td>fluorescent secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Bovine serum albumin standard (BSA)</td>
			<td style="width:183px;">euromedex</td>
			<td style="width:137px;">04-100-812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D5796-500ml</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040-5ML</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human: HeLa S3 cells</td>
			<td>IGBMC, Strasbourg, France</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>cell line used to perform the experiments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:313px;">Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">H1009-100ml</td>
			<td>used as a stressing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Mouse monoclonal anti-coilin</td>
			<td style="width:183px;">abcam</td>
			<td style="width:137px;">ab11822</td>
			<td>Coilin-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>epifluoresecence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>transfection medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">PBS pH 7.4 (10x)</td>
			<td style="width:183px;">gibco</td>
			<td style="width:137px;">70011-036</td>
			<td>to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Rabbit polyclonal anti-53BP1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PA1-16565</td>
			<td>53BP1-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit polyclonal anti-EDC4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4200114</td>
			<td>EDC4-specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:313px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:183px;">Roth</td>
			<td style="width:137px;">6683</td>
			<td>to permeabilize the cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

substructure analyzer: a user-friendly workflow for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in fluorescence microscopy images

Son on yılda floresan mikroskopi tekniklerinde uzamsal çözünürlük iyileştirmesi ile gösterildiği gibi canlı hücre görüntüleme ve yüksek işlem mikroskobu tekniklerinde de atılımlar ile karakterize edilmiştir. Bu, tek bir deney için mikroskopi verilerinin miktarında ve karmaşıklığında sürekli bir artışa yol açmıştır. Mikroskopi verilerinin manuel analizi çok zaman alıcı, öznel ve nicel analizleri yasakladığı için, biyogörüntü analizinin otomasyonu neredeyse kaçınılmaz hale gelmektedir. Floresan mikroskopiden biyogörüntülerde sinyal analizini tam olarak otomatikleştirmek için Alt Yapı Analizörü adı verilen bir bilişim iş akışı kurduk. Bu iş akışı kullanıcı dostu açık kaynak platformu Icy üzerinde geliştirilmiştir ve ImageJ işlevleri tarafından tamamlanır. Sinyalin gürültü oranına doğru geliştirilmesi için görüntülerin ön işlenmesini, hücrelerin bireysel bölümlemesi (hücre sınırlarının saptanması) ve belirli hücre bölmelerinde zenginleştirilmiş hücre gövdelerinin algılanmasını/nicelleştirilmesini içerir. Bu iş akışının en büyük avantajı, kullanıcı dostu bir arayüz aracılığıyla görüntü analizi uzmanlığı olmayan kullanıcılara karmaşık biyo-görüntüleme işlevleri önermektir. Ayrıca, son derece modüler ve farklı hücresel alt yapılarda farklı hücre organlarının karşılaştırmalı analizi nükleer / sitoplazmik translokasyon karakterizasyonu çeşitli konulara adapte. Bu iş akışının işlevselliği oksidatif stres (OS) koşulları altında Cajal (kıvrılmış) Organların çalışması ile gösterilmiştir. Floresan mikroskopiden elde edilen veriler, insan hücrelerindeki bütünlüklerinin işletim sistemi indüksiyonundan birkaç saat sonra etkilendiğini göstermektedir. Bu etki karakteristik Cajal Cisimler içine bobin nükleasyonu bir azalma ile karakterizedir, küçük foci artan sayıda bobin bir nükleoplazmik yeniden dağılımı ile ilişkili. CB bileşenleri ile çevresindeki nükleoplazm arasındaki değişimde bobinin merkezi rolü, OS'nin indüklenen bobinin yeniden dağılımının Cajal Cisimlerinin bileşimini ve işlevselliğini etkileyebileceğini düşündürmektedir.

Açıklanan tüm analizler standart bir dizüstü bilgisayarda (Java'nın 64 bit sürümüyle çalışan 16 GB rastgele erişimli bellek (RAM)) ile 2,80 GHz'de 64 bit, dört çekirdekli işlemci de gerçekleştirilmiştir. Rasgele erişim bellek miktarı ve analiz etmek görüntülerin çözünürlüğüne bağlı olarak, dikkate alınması gereken önemli bir parametredir. Java'nın 32 bit sürümünün kullanılması, belleği büyük veri analizi için uygun olmayan yaklaşık 1300 MB ile sınırlar, 64 bit versiyonu ...

Watch this Scientific Journal Video about Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images at JoVE.com

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

Floresan mikroskopi görüntülerinde belirli hücre bölmelerinde hücresel cisimlerin hızlı araştırılması ve doğru analizi için oluşturulmuş serbestçe kullanılabilir bir iş akışı salıyoruz. Bu kullanıcı dostu iş akışı açık kaynak yazılım Icy üzerinde tasarlanmıştır ve aynı zamanda ImageJ işlevleri kullanır. Boru hattı görüntü analizi nde bilgi olmadan uygun fiyatlı.

Alt Yapı Analizörü: Floresan Mikroskopi Görüntülerinde HücreCisimlerinin Hızlı Araştırılması ve Doğru Analizi için Kullanıcı Dostu İş Akışı

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Alt yapı çözümleyicisi, birden fazla işlem mikroskobu ölçümünün otomatik analizini gerçekleştiren kullanıcı dostu bir iş akışıdır. Bu açık kaynak yazılım Icy sıfır ton anlamına gelmez ve aynı zamanda makine işlevleri kullanarak. Daha da önemlisi, bu iş akışı uygun fiyatlı tatil bilgi ve görüntü analizi üretmek.Sinyalin gürültü oranını artırmak ve görüntüleme veya kusurları gidermek için çok kanallı görüntüler iş akışı içinde yüklenir ve önceden işlenir. Daha sonra, görüntü bölümleme, arka plandan ROI olarak da bilinen ilgi bölgelerini yalıtır. Kümeleme düzeyine ve ilgi çekici nesnelerin yapısına bağlı olarak çeşitli segmentasyon yöntemleri mevcuttur.Parçalı nesneler belirli bir klasörde belirli bir tanımlayıcı ile kaydedilir. Kuvvet ve sinyaller daha sonra satırlar içinde analiz edilir ve konum, boyut, yoğunluk dokularında şekil gibi birden çok özellik ancak sayı ve boyut otomatik olarak oluşturulan bir elektronik tabloya aktarılır. Icy web sitesinden Icy'yi indirin.Ardından Protokollerin Buzlu kitaplığından Alt Yapı Çözümleyici Protokolü'nü indirin. Icy'yi açın ve şerit menüsündeki araçlara tıklayın. Protokoldüzenleyici arabirimini açmak için protokolleri tıklatın.Yükle'ye tıklayın ve protokol alt yapı analizörü açın. Protokol yüklemesi birkaç saniye sürebilir. İş akışı, belirli alt görevleri gerçekleştiren birkaç kutudan oluşan bir ardışık hatlar olarak çalışan her blokta çalışan 13 Genel bloktan oluşur.Her blok veya kutu numaralanır ve iş akışı içinde belirli bir rütbeye sahiptir. Bu sayıyı tıklatarak, seçili blota ilk olası konumu atayın. Diğer blokların konumları yeniden düzenlenir.Sol üst köşe simgesine tıklayarak, blok genişletilebilir. Ayrıca büyütülebilir, daraltılabilir veya kaldırılabilir. İş akışının her ardışık hattı, diğer giriş ve çıktıyla birbirine bağlı kutular ağı tarafından doğru bir şekilde ortaya çıkar.Bağlantı oluşturmak için, bir çıktıyı tıklatın ve imleç herhangi bir girişle ilgili olana kadar devam edin. Çıktılar etiketine tıklayarak bağlantılar kaldırılabilir. Gerekirse, dizilerin birleştirilecek şekilde dosyaları yeniden adlandırın, aynı adlar önekive ardından farklı ayırıcıvardır.Örneğin, a görüntüsündeki tek tek kanalların dizileri a notası kırmızı, görüntü A mavialtalta, ve benzeri adlandırılmış. Aynı klasörde, birleştirmek için kanal başına yeni bir klasör oluşturun. Örneğin, kırmızı, yeşil ve mavi kanalları birleştirmek için üç klasör oluşturun ve karşılık gelen sıraları bu klasörler içinde depolayın.Yalnızca blok birleştirme kanallarını kullanın, diğer blokları kaldırın ve protokolü birleştirme kanalları olarak kaydedin. Parametreleri ayarlamak için kutulara erişim. Kutuda, kanal numarası x, hangi kanalı ayıklamak için seçin.Klasik RGB görüntülerde sıfır kırmızı, biri yeşil ve ikincisi mavidir. Kutusunda, klasör kanal numarası x, Kanal x görüntüleri içeren klasörün adını ters çevirin. Kutuda, ayrı kanal numarası x.Görüntü adı için ayırıcı kullanımı. Kutuda, renk eşleme kanal numarası x, buzlu ilgili kanalı görselleştirmek için kullanmak için model sütunu bir sayı ile gösterir. Birleştirilmiş görüntülerin biçimi olan kutuya, birleştirilmiş görüntüleri kaydetmek için uzantıyı yazın.Birleştirme kanalları bloğunun sol üst köşesinde, doğrudan klasörün sağındaki bağlantıyı tıklatın. Görünen açık iletişim kutusunda, bir numaralı kutu klasör kanalında tanımlanan ilk kanalın dizilerini içeren klasöre çift tıklayın. Sonra aç'a tıklayın, protokolü çalıştırın.Birleştirilmiş görüntüler, tek tek kanalların klasörleri ile aynı dizinde birleştirilmiş bir klasöre kaydedilir. Nesne segmentasyonu, görüntü analizinde en zorlu adımdır. Verimlilik, elde edilen set ölçümlerinin doğruluğunu belirler.Bu nedenle, yapı çözümleyicisi görüntü karmaşıklığı ve kullanıcı ihtiyaçlarına uyarlanmış farklı alternatifler önermek için hem basit hem de daha karmaşık algoritmaları entegre eder. Nesneler birbirine dokunmuyorsa, diğer kullanıcı kümelenmiş nesneleri ayrı ayrı ayırt etmek zorunda değildir Blok bölümleme A.Nesnelerin birbirine dokunmadığı, ancak bazıları yakın olduğunda, blok segmentasyon B.Yüksek kümeleme düzeyi ve konveks şekli olan nesneler için kullanın, blok segmentasyon C.Nesneleri yüksek kümeleme düzeyi mevcut ve düzensiz şekiller varsa kullanın , blok segmentasyon D.Kümelerde blok segmentasyonunu kullanarak sitoplazmaya dokunmayı tek tek segmente göre segmentasyon olarak segmentasyon olarak segmente eder. Birincil nesne bölümleçasyonu için blok uyarlayıcı, belirli bir alt yapı için verimliliklerini karşılaştırmak veya farklı alt yapı türlerini segmentlemek için birkaç bloğun aynı çalıştırmada kullanılabileceğini bağımsız olarak işleyebilir.Segmentasyonu göstermek için, daha fazla sayıda soruna uyacak blok bölümlendirme B seçilmiştir. Bu blogu kullanmak için. İlk olarak, klasörü seçin.Daha sonra, kanal sinyalini çağırır nesnenin kanalını segmente ayarlar. Örneğin, B'ye karşılık gelmek üzere, HK kutusunda, algılanacak nesnelerin piksellerinde yoğunluk sınıfları parametresini ve yaklaşık minimum ve maksimum boyutlarını ayarlayın. Yoğunluk sınıfları için, iki değer pikselleri arka plan ve ön plan olmak üzere iki sınıfhalinde sınıfa göre sınıflar.Böylece nesneler ve arka plan arasındaki kontrast yüksek olduğunda uyarlanır. Ön plandaki nesnelerin kökenleri yoğunlukları varsa veya arka planla kontrast düşükse, sınıf sayısını artırın. Kutuda etkin konturlar nesnelerin kenarlıklarının algılanmasını en iyi duruma getirin.İşlem sırasında, bölümlenmiş nesnelerin görüntülerini kaydetmek için bir klasör oluşturulur. Kutu metinde, çekirdekleri segmente etmek gibi bu klasörü adlandırın. Parçalı nesnelerin görüntülerini kaydetmek için biçimi ayarlamak için, parçalı nesnelerin görüntülerinin kutu biçimini doldurun, protokolü çalıştırdı.Klasör, birleştirilmiş görüntüler içeren klasörde oluşturulur. Parçalı nesnelerde analiz edilecek yasa ve kanal ve hücre bölmelerinin sayısına uyum sağlamak için farklı bloklar geliştirilmiştir. Aşağıdaki örnekte, çözümleme için, aynı bölmedeki blok floresan çözümlemesi P.Two kanalını seçin ve klasörü seçin.Bu çözümleme parametreleri gelen klasörü görüntüleri YG ayarlamak önce segmentasyon bloğu işlenmiş olmalıdır, bir ters eğik çizgi öncesinde parçalı nesnelerin görüntülerini içeren klasörün adını yazın. Parçalı nesnelerin görüntülerinin gelen kutusu biçimi, segmente nesnelerin görüntülerini kaydetmek için kullanılan biçimi yazın. Gelen kutusu her iki nesneyi kaldırmak için kenarlıkları öldürür.Aksi takdirde, şu anda, görüntüleme daha tam J toplama kurulumu bu işlevi kullanmak için gereklidir. Kutularda kanal spot sinyali, noktalar tespit edilmesi gereken kanal ayarlayın. Klasik RTP görüntülerde sıfır kırmızıdır Bir yeşil, iki mavidir.Lokalize molekülün kutularına, lekelere lokalize olan molekülün adını yazın. Cevaplanacak alan sayısı molekül sayısına bağlıdır. Dedektör bloğu başına düşen dalga boylarındaki kutularda, her bir Kanal için noktalar algılama parametrelerini ayarlayın.Bir odada farklı blokları işlemek için, blok seç klasörü ile seçilen blokların bağlantılarını tutun. İş akışının iyi işlenmesinin altında yer aldığından emin olun. İş akışını çalıştırmadan önce, kullanılmayan blokları kaldırmak ve yeni protokolü başka bir adla kaydetmek de önerilir.İş akışını başlatmak için çalıştır'ı tıklatın. Açıldığında göz görünümü kitapları belirir. Hemşire resimlerini içeren klasöre çift tıklayın Sonra Aç'a tıklayın, iş akışı otomatik olarak çalışacaktır.İşlem tamamlandığında, başarıyla yürütülen iş akışı sağ alt köşede görünür, tüm bloklar yeşil işaretle işaretlenir. Değilse blok ve ok işareti sunan iç kutu öğeleri doğru gösterir. Daha da önemlisi, birkaç ekran, işlemeyi denetlemek için her çalışma sırasında ara sonuçları görselleştirmeye olanak sağlar.Bu iş akışının hızı, esnekliği ve işlevselliği çeşitli örneklerle sınırlandırılacaktır. Bu ilk örnekte, NF kappa B.After simülasyonunun nükleer translokasyonlarını artan TNF alfa konsantrasyonları ile analiz ediyoruz. Nükleus ve sitoplazma segmentasyon C ve E blokları kullanılarak delineated edildi.NF kappa B sinyal gelişmeye küresel translokasyon analizi bloğu kullanılarak analiz edildi. 96 görüntüde 40.000'den fazla hücre 26 dakikada analiz edildi. Oluşturulan veriler, NF Kappa B nükleer translokasyonun TNF alfa tarafından indüksiyonunu gösteren bu doz yanıt eğrisini oluşturmak için kullanıldı.İş akışı, dosya boyutunu algılamak ve özellikleri hakkında belirli bilgileri ayıklamak için de kullanılabilir. Burada, proteinler için EDC lokalizasyonu ile tek tek hücrelerdeki özellikler tespit edildi. Sitoplazmadaki çekirdekler segmentasyon A ve E blokları kullanılarak delilendirilmiştir.EDC4 bu örnek C.In floresan analiz blokları kullanılarak analiz edilmiş, analiz edilen her iki hücrede de sitoplazmik EDC4 işareti saptırılmıştır. Her bir tam tarafın piksel boyutu elektronik tabloda verilir. Bu örnekte, karbonhidratları oksidatif stresin daha uzun bir kinetik lerini incelemek için iş akışının çok yönlülüklerinden yararlandık.Bobinin nükleer kuvvet işareti karbonhidratların ana yapısal bileşenleridir Sayı ve büyüklükleri boyut, stres durumuna göre analiz edilmiştir, çift iplikçik kırıkları ile 53BP1 ile lokalize olarak değerlendirilir. Çekirdekleri segmentasyon proxy kullanılarak tespit edildi, Nükleer kuvvet ve koilin ve 53BP1 sinyalleri, aynı anda floresan analizi Blok B.2300 bireysel hücrelerden veri kullanılarak analiz edildi, biz onların boyutunda bir azalma ile ilişkili stres indüksiyon sonra Greenfield sitenin sayısında önemli bir artış kanıtlanmıştır. Bu veriler, oksidatif stresin, bobin ekspresyonundaki bir değişikliği haklı göstermek için nükleer plazmik bir dağılım kullanarak karbonhidratların çekirdekleşme gücünü daha küçük nükleer sayıya dönüştürerek yerelleştirmeyi değiştirebileceğini ve eğri cisimlerin çekirdekleşmesini değiştirebileceğini kuvvetle göstermektedir.Bir eksojen GFP bobin füzyon proteini aşırı ifade edildi. Vücudumuzun özellikleri GFP bobin aşırı ekspresyon seviyesine göre analiz edildi. Çekirdekler segmentasyon bloğu A.Coilin ve GFP bobinin floresan sinyalleri kullanılarak, aynı anda floresan analiz bloğu B.GFP bobinaşırı ifade düzeyi kullanılarak analiz edildi bireysel çekirdeklerde GFP sinyalinin anlam yoğunluğu ile yansıtıldı.Alt yapı analizörü tarafından elde edilen veriler, aşırı ifadedeki GFP bobininin karbonhidratların boyutunu ve sayısını önemli ölçüde artırdığını göstermektedir. Oksidatif stres karbonhidrat sayısını artırır ama boyutlarını azaltır beri. Bu veriler karbonhidratların yapısı üzerindeki oksidatif stres etkisinin büyük olasılıkla belirli miktarda bobin üzerinde bir etki den ziyade bileşimlerinin değişmesiyle ortaya çıkarılabilen bir etki olduğunu yansıtabilir.Yani yapı analizörü biyo görüntü analizi için son derece modüler bir iş akışıdır. Kanalların basit birleştirilmesinden binlerce hücredeki birden fazla kat ve sinyalin nicelleştirilmesine kadar çeşitli bağlamlara uyarlanabilir. Ayrıca görüntü karmaşıklığına bağlı olarak basit ve karmaşık segmentasyon algoritmalarını entegre eder ve floresan sinyal özelliklerinin çıkarılmasını otomatikleştirir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Düşük Maliyetli Cryo-Işık Mikroskopi Sahne İmalatı İlişkili Işık / Elektron Mikroskopi

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Bıçak kenar Tarama Mikroskopi için Numune Hazırlama, Görüntüleme ve Analiz Protokolleri

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Hücresel Self-Meclis Biyomekanik Analizi ve Doku Mühendisliği, Hücre-Türetilmiş Doku Yüzüklerin Üretiyor yönelik

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Mikroorganizmalarda Cortex Organizasyon ve Dinamiği Görselleştirme, Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanılarak

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...