Name: standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model
Uploaded: 2020-05-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

نود أن ننوه بمساعدة موظفي قسم الطب المقارن ونواة الجزيئات وعلم الأمراض الهيستوباثفية في مركز ميلتون S. Hershey الطبي في ولاية بنسلفانيا. مصادر التمويل: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF منحة أبحاث التهاب المفاصل (F.K.).

تم شراء الفئران C57BL/6 الذكور البالغ من العمر اثني عشر أسبوعًا من مختبرات جاكس. تم إيواء جميع الفئران في مجموعات من 3-5 فئران لكل قفص معزول صغير في غرفة مع جدول زمني 12 ساعة ضوء / الظلام. تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقًا لدليل المعهد الوطني للصحة (NIH) لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية<...

وقد عززت البحوث الأخيرة هشاشة العظام فهمنا للكلام المتبادل بين الأنسجة المختلفة داخل المفصل والدور الذي يلعبه كل نسيج في بدء المرض أو التقدم8,9,10,35,36. وبناء على ذلك، أصبح من الواضح أن تقييم زراعة الأوا...

واحدة من اضطرابات المفاصل الأكثر انتشارا في الولايات المتحدة, يتميز OA من الانحطاط التدريجي للغضروف المفصلي, في المقام الأول في مفاصل الورك والركبة, مما يؤدي إلى آثار كبيرة على تنقل المريض ونوعية الحياة1,2,3. الغضروف المفصلي هو النسيج الضام المتخصص للمفاصل اليوميات مصممة لتقليل الاحتكاك، وتسهيل الحركة، وتحمل ضغط مشترك4. يتكون الغضروف المفصلي من مكونين أساسيين: chondrocytes ومصفوفة خارج الخلية. Chondrocytes هي المتخصصة، والخلايا النشطة استقلابيا التي تلعب دورا أساسيا في تطوير وصيانة وإصلاح المصفوفة خارج الخلية4. تضخم Chondrocyte (CH) هي واحدة من العلامات المرضية الرئيسية لتطوير OA. ويتميز بزيادة حجم الخلوية، وانخفاض إنتاج بروتيجليكان، وزيادة إنتاج الغضروف مصفوفة الانزيمات المهينة التي تؤدي في نهاية المطاف إلى انحطاط الغضاريف5،6،7. وعلاوة على ذلك، التغيرات المرضية في العظام تحت الشوندري وsynovium من المفصل تلعب دورا هاما في التنمية OA والتقدم8،9،10،11،12. حتى الآن، لا توجد علاجات علاجية موجودة تمنع انحطاط الغضاريف1،,2،,3،,13،,14. وبالتالي ، هناك أبحاث مستمرة واسعة النطاق تهدف إلى فهم علم الأمراض OA واكتشاف النهج العلاجية الجديدة التي هي قادرة على إبطاء أو حتى وقف OA. وبناءعلى ذلك ، هناك حاجة متزايدة إلى نهج كمي واستنساخي يتيح التقييم الدقيق للتغيرات المرضية المرتبطة بـ OA في الغضروف والسينوفيوم والعظام تحت الشبكفية.
حاليا، يتم تقييم شدة OA والتقدم في المقام الأول باستخدام OARSI أو مانكين سجل النظم15. ومع ذلك ، فإن أنظمة التسجيل هذه هي شبه كمية فقط ويمكن أن تتأثر بذاتية المستخدم. والأهم من ذلك، أنها تفشل في تقييم دقيق التغيرات الطفيفة التي تحدث في المفصل أثناء المرض أو استجابة للتلاعب الجيني أو التدخل العلاجي. هناك تقارير متفرقة في الأدب تصف التحليلات الهستومومترية للغضروف، السينوفيديوم، أو العظام تحت التشبوندرية16،17، 18،,1919،20،21. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص في بروتوكول مفصل لإجراء تحليل دقيق واستنساخ يُستنسخ من كل هذه المكونات المشتركة، مما يخلق حاجة غير ملباة في الميدان.
لدراسة التغيرات المرضية في OA باستخدام التحليل الهسي، استخدمنا نموذج الماوس OA الجراحية للحث OA عن طريق زعزعة استقرار الغضروف المفصلي (DMM). من بين النماذج الراسخة من المورين OA ، تم اختيار DMM لدراستنا لأنه ينطوي على آلية أقل صدمة للإصابة22،23،24،25،26. بالمقارنة مع إصابة الأربطة الغضدية (MLI) أو إصابة الرباط الصليبي الأمامي (ACLI) العمليات الجراحية ، تشجع DMM على تقدم أكثر تدريجيًا لـ OA ، على غرار تطور OA في البشر22،24،25،26. تم قتل الفئران بعد اثني عشر أسبوعا من جراحة DMM لتقييم التغيرات في الغضروف المفصلي، والعظام تحت الجلد، والسروفيوم.
والهدف من هذا البروتوكول هو وضع نهج موحد وصارم وكمية لتقييم التغييرات المشتركة المصاحبة لتقييم التقييمات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>For sample fixation following harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq 27QHD Creative Pen Display</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq Ergo stand</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC446080010</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>F7258</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For sample section collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoPrep Xylene</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>HC-700-1GAL</td>
			<td>For sample deparrafinization and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-182-701A</td>
			<td>For sample processing and embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Z440 Workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td>Product number: Y5C77US#ABA</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM 2235</td>
			<td>For sample sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801880</td>
			<td>For sample labeling, cassettes and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX53 Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS DP 73 Microscope Camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORION STAR A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoMeasure Software</td>
			<td>OsteoMetrics</td>
			<td>https://www.osteometrics.com/index.htm</td>
			<td>For histomorphometric measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model # 39471005</td>
			<td>For mouse knee harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM 7 Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Institutional Access Account</td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-O stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>S8884</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage</td>
			<td>Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)</td>
			<td>http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom Pro Pen Stylus</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029713</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029714</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model

واحدة من اضطرابات المفاصل الأكثر انتشارا في الولايات المتحدة, هشاشة العظام (OA) يتميز انحطاط التدريجي من الغضروف المفصلي, في المقام الأول في مفاصل الورك والركبة, مما يؤدي إلى آثار كبيرة على تنقل المريض ونوعية الحياة. حتى الآن، لا توجد علاجات علاجية موجودة لOA قادرة على إبطاء أو منع انحطاط الغضاريف. في الوقت الحاضر ، هناك مجموعة واسعة من الأبحاث الجارية لفهم علم الأمراض OA واكتشاف النهج العلاجية الجديدة أو العوامل التي يمكن أن تبطئ بكفاءة ، ووقف ، أو حتى عكس OA. وبالتالي ، من الأهمية بمكان أن يكون هناك نهج كمي وقابل للتكرار لتقييم التغيرات المرضية المرتبطة بـ OA بدقة في غضروف المفاصل ، وعظم السينونوف ، والعظم تحت الشبون. حاليا، يتم تقييم شدة OA والتقدم في المقام الأول باستخدام جمعية أبحاث هشاشة العظام الدولية (OARSI) أو أنظمة التهديف مانكين. على الرغم من أهمية أنظمة التسجيل هذه ، فهي شبه كمية ويمكن أن تتأثر بذاتية المستخدم. والأهم من ذلك، أنها تفشل في تقييم دقيق، ولكن المهم، التغيرات في الغضاريف خلال حالات المرض في وقت مبكر أو مراحل العلاج المبكر. يستخدم البروتوكول الذي نصفه هنا نظام برمجيات النسيجية المحوسبة وشبه الآلية لإنشاء منهجية كمية موحدة وصارمة وقابلة للاستنساخ لتقييم التغييرات المشتركة في OA. يقدم هذا البروتوكول إضافة قوية إلى الأنظمة الحالية ويسمح بالكشف بشكل أكثر كفاءة عن التغيرات المرضية في المفصل.

ينتج عن OA الناجم عن DMM انحطاط الغضروف المفصلي وفقدان chondrocyte أدى OA الناجم عن DMM إلى زيادة درجة OARSI مقارنة بالفئران الصورية ، التي تتميز بوضوح بتآكل السطح وفقدان الغضاريف(الشكل 1A،D). اكتشف بروتوكول قياس الهيستومورفوتومي المفصل هنا العديد من التغييرات المرت...

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

البروتوكول الحالي يضع طريقة صارمة وقابلة للاستنساخ للقياس الكمي للتغيرات المفصلية المورفولوجية التي تصاحب هشاشة العظام. تطبيق هذا البروتوكول يمكن أن تكون ذات قيمة في رصد تطور المرض وتقييم التدخلات العلاجية في هشاشة العظام.

تقييم قياسي للفزة الهيستومترية لهشاشة العظام في نموذج الماوس الجراحي

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

يعالج بروتوكولنا الحاجة غير الملباة لطريقة قوية وقابلة للتكرار للتحليل الكمي للتغيرات المشتركة في تطور هشاشة العظام والتقدم. تحدد تقنيتنا المعلمات المحددة والقابلة للاستنساخ للتحليل الكمي للتغيرات في الأنسجة المشتركة المتعددة في هشاشة العظام. وبما أن هذه التقنية تسمح للتحليل الكمي لالتهاب المفاصل، يمكن استخدامها لمقارنة آثار علاجات محددة على أنسجة مشتركة متعددة من أجل تقييم فعاليتها العلاجية.يمكن أيضا تطبيق بروتوكول لدينا على نماذج أخرى من هشاشة العظام أو مجالات البحوث العضلية الهيكلية التي هناك حاجة إلى تحديد كمي للغضاريف والعظام. وعلى الرغم من أن النظام بسيط وبديهي، فإن الدورات التدريبية لا تزال ضرورية لممارسة الحصول على القياسات بطريقة متكررة لتحقيق قابلية الاستنساخ. فينغاديسهبرابو كاروباغوندر، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبرنا سوف يظهر الآن إجراءنا.ابدأ من خلال تشغيل المجهر والكاميرا والكمبيوتر وشاشة اللمس. حدد الهدف 4X وانقر على رمز البرنامج لإطلاق البرنامج. ضع الشريحة على مرحلة المجهر ومركز العينة داخل نافذة القياس مع ضمان ضبط شبكة القياس على التكبير المناسب لتتناسب مع الهدف في أن يتم تضمين كل من السطح المفصلي التيبالي والفيدي والعظام الفرعية الطنينية داخل مناطق الصورة ذات الاهتمام.ثم ضمن القائمة ملف، حدد قراءة الإعدادات. في إطار الإعدادات، حدد ملف الإعدادات المناسبة للمعلمات التي سيتم قياسها. لقياس منطقة الغضاريف الكلية، حدد وظيفة TC Tib وتتبع على طول الحافة العليا لسطح الغضاريف التيبالية حيث يلتقي الغضاريف الفضاء المشترك وعلى طول تقاطع chondro-osseous حيث يلتقي الغضروف المتكلس العظام تحت الأرض.لقياس منطقة الغضاريف المتكلسة حدد وظيفة Tib CC وتتبع خط على طول علامة المد والجزر، وهو خط يحدث بشكل طبيعي يفصل المناطق المتكلسة وغير محسوبة من الغضاريف، وعلى طول تقاطع chondro-osseous حيث يلتقي الغضروف المتكلس العظام الفرعية. لتحديد منطقة الغضاريف غير المعابسة، اطرح منطقة الغضاريف المتكلسة من منطقة الغضاريف الكلية. لتحديد عدد chondrocyte، قم بإنشاء دالات عدد منفصلة ضمن الإعدادات في برنامج قياس الهستومورومي للتمييز بين المصفوفة المنتجة والمصفوفة غير المنتجة للزخرون.ثم استخدم القلم لجعل نقطة صغيرة على كل chondrocyte التعبير عن النمط الظاهري المحدد لتحديد عدد المصفوفة المنتجة أو لا تنتج chondrocytes. لقياس إجمالي معلمة السطح المفصلي التيباحي، تتبع خط عبر سطح الغضروف التيبالي لتحديد بعناية الرجفان الفردي. ثم رسم خط ثان على طول علامة المد لتكون بمثابة عنصر تحكم داخلي لطائرة كل قسم وتقسيم معلمة سطح المفصلي التيبى بواسطة المعلمة علامة المد لحساب مؤشر الرجفان السطحي التيبى.لقياس مساحة منطقة نخاع النخاع الفرعي، حدد وظيفة منطقة النخاع. ثم رسم خطوط حول معلمة هذه المناطق لتحديد المساحة الإجمالية لمساحة نخاع العظام داخل عظم النخاع الفرعي. لقياس إجمالي منطقة تحت السونندرال، حدد وظيفة العظام تحت السونندرالية ومخطط المنطقة بين تقاطع chondro-osseous في الحدود العليا لصفائح النمو تمتد بشكلٍ كبير إلى مناطق العظام الأمامية والخلفية.ثم اطرح مساحة نخاع العظم في المنطقة الفرعية من منطقة الكلى الفرعي لحساب منطقة العظام في منطقة النخاع. لقياس منطقة أوستيوفيت، حدد وظيفة أوستيوفيت الأمامية وتتبع العظم الأمامي للقبيا القريب. ثم حدد osteophyte الخلفي وتتبع osteophyte الخلفي من الساق القريبة.لقياس سمك الزليلي الفخذي الأمامي، انقر فوق عظم الفخذ الأمامي Synovium مينيسيسكوسي وارسم سطرًا واحدًا من نقطة الإدراج الداخلية للسينوفينية الأمامية على عظم الفخذ نحو نقطة المرفق على الغضروف المفصلي وخط واحد من الإدراج الخارجي للزلق على عظم الفخذ نحو مرفقه بالغضروف المفصلي. ثم تقسيم المساحة الزليلية الإجمالية على المعلمة الزليلي لحساب سمك الزليلي. DMM الناجمة عن هشاشة العظام النتائج في زيادة Osteoarthritis الجمعية الدولية للبحوث درجة مقارنة الفئران صوري.تتميز بوضوح تآكل السطح والغضاريف المفقودة. يمكن استخدام هذا البروتوكول قياس الهيستومورمور للكشف عن العديد من العظام المرتبطة التغيرات بما في ذلك انخفاض في مجموع الغضاريف والمناطق غير محسوبة الغضروف. انخفاض في العدد الكلي للزخرون، والأهم من ذلك، خسارة في عدد المصفوفة المنتجة للشوكندريات.كما لوحظت تغيرات في السطح المفصلي، تدل على شدة التآكل، بما في ذلك زيادة إجمالية في مؤشر الرجفان. التهاب المفاصل يشمل أيضا زيادة في منطقة العظام تحت البطن وانخفاض في منطقة نخاع العظام في الفئران DMM تشير إلى التصلب العظمي تحت المستوى. كما زادت كل من المناطق الأمامية والخلفية من العظام في فئران DMM ، مما يشير إلى إعادة عرض العظام تحت الركبة الجارية التي تعمل كآلية تعويضية للتعامل مع التغيرات في تحميل المفاصل في موقع الإصابة.تحليل الهيستومورومية من الزلوفيوم يظهر زيادة في سمك الزليلي في الفئران DMM. نتيجة نموذجية من التهاب المفاصل المرتبطة التهاب الزليلي وانتشار السيتوكينات الالتهابية في الفضاء المشترك. بالإضافة إلى ذلك ، لا يوجد تباين كبير بين المستخدمين بين التحليل الهستومورومي لمنطقة الغضروف غير المعاين في النتيجة الدولية لجمعية أبحاث هشاشة العظام.بعد تحليل الهدسم، يمكن استخدام الشرائح المتتالية وتلطيخ الفلور المناعية لفحص التغيرات في التعبير البروتيني بين العينات.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

وسيلة جديدة لإدارة الجراحية داخل الرغامى وكلاء الحيويه في نموذج الفأر الجنينية

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

زرع الوريد الأجوف السفلي مداخلة الكسب غير المشروع في نموذج الفأر

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

زرع صمام الرئوي عن طريق نموذج الفأر من غيري مكاني القلب زرع

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

The Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis Pain in the Mouse

نموذج Monoiodoacetate الألم في التهاب المفاصل في الماوس

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

متساوي القياس كونتراكتيليتي القياس الشريان المساريقي العلوي الماوس باستخدام أسلاك ميوجرافي

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

المطحنة الضغط الإيجابي السفلي للجسم لإعادة التأهيل هشاشة العظام الركبة

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

تقييم إنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج ماوس متلازمة المبيض المتعدد الكيسات

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

التقييم الفسيولوجي المرضي للشبكية في نموذج الفئران

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Treating Knee Osteoarthritis with Tuina in a Rabbit Model

Tuina Intervention in Rabbit Model of Knee Osteoarthritis

Using a Rabbit Model to Explore the Efficacy of Tuina in Treating Knee Osteoarthritis (Video) | JoVE

تدخل Tuina في نموذج أرنب لالتهاب المفاصل في الركبة

Knee osteoarthritis (KOA) is mainly characterized by degenerative changes in the knee joint's cartilage and surrounding soft tissues. The efficacy of ...

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model (Video) | JoVE

تقييم العمارة الدقيقة للعظام التربيقية في نموذج فأر هشاشة العظام

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...