Name: standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model
Uploaded: 2020-05-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende bistand fra Department of Comparative Medicine personale og molekylær og histopatologi kerne på Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Finansieringskilder: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).

Tolv uger gamle mandlige C57BL/6 mus blev købt fra Jax Labs. Alle mus var anbragt i grupper på 3-5 mus pr. mikroisolatorbur i et rum med en 12 timers lys/mørk tidsplan. Alle dyreforsøg blev udført i henhold til National Institute of Health (NIH) Guide for pleje og brug af laboratoriedyr og godkendt af Animal Care and Use Committee of Pennsylvania State University.
1. Post-traumatisk slidgigt (PTOA) kirurgisk model
<ol><li>Bedøve mus ved hjælp af et ketamin (100 mg/kg)/xylazin...

Nylige osteoarthritis forskning har forbedret vores forståelse af krydstale mellem de forskellige væv i den fælles og den rolle hvert væv spiller i sygdomsstart eller progression8,9,10,35,36. Det er derfor blevet klart, at vurderingen af OA ikke bør begrænses til analyse af brusen, men også bør omfatte en analyse af subchondralknoglen og synovium. På ...

En af de mest udbredte ledsygdomme i USA, OA er karakteriseret ved progressiv degeneration af ledbrusk, primært i hofte-og knæled, hvilket resulterer i betydelige konsekvenser for patientens mobilitet og livskvalitet1,2,3. Ledbrusk er den specialiserede bindevæv af diarthrodialsamlinger designet til at minimere friktion, lette bevægelse, og udholde fælles kompression4. Ledbrusk består af to primære komponenter: chondrocytter og ekstracellulær matrix. Chondrocytter er specialiserede, metabolisk aktive celler, der spiller en primær rolle i udviklingen, vedligeholdelsen og reparationen af den ekstracellulære matrix4. Chondrocyt hypertrofi (CH) er en af de vigtigste patologiske tegn på OA udvikling. Det er kendetegnet ved øget cellulær størrelse, nedsat proteoglycan produktion, og øget produktion af brusk matrix-nedbrydende enzymer, der i sidste ende fører til brusk degeneration5,6,7. Yderligere, patologiske ændringer i subchondral knogle og synovium af den fælles spiller en vigtig rolle i OA udvikling og progression8,9,10,11,12. Til dato er der ingen eksisterende helbredende behandlinger, der hæmmer bruskdedegeneration1,2,3,13,14. Således er der omfattende igangværende forskning, der har til formål at forstå OA patologi og opdage nye terapeutiske tilgange, der er i stand til at bremse eller endda stoppe OA. Derfor er der et stigende behov for en kvantitativ og reproducerbar tilgang, der muliggør nøjagtig evaluering af OA-relaterede patologiske ændringer i brusk, synovium og subchondral knogle i leddet.
I øjeblikket vurderes OA-sværhedsgrad og progression primært ved hjælp af OARSI- eller Mankin-scoringssystemerne15. Men disse scoringssystemer er kun semikvantitative og kan påvirkes af brugerens subjektivitet. Endnu vigtigere, de undlader præcist at vurdere subtile ændringer, der opstår i leddet under sygdom eller som reaktion på genetisk manipulation eller en terapeutisk intervention. Der er sporadiske rapporter i litteraturen, der beskriver histomorforometriske analyser af brusk, synovium eller subchondral knogle16,17,18,19,20,21. Der mangler imidlertid stadig en detaljeret protokol for streng og reproducerbar histomorfometrisk analyse af alle disse fælles komponenter, hvilket skaber et udækket behov på området.
For at studere patologiske ændringer i OA ved hjælp af histomorfometrisk analyse, brugte vi en kirurgisk OA mus model til at fremkalde OA via destabilisering af den mediale menisk (DMM). Blandt de etablerede modeller af murine OA, DMM blev udvalgt til vores undersøgelse, fordi det indebærer en mindre traumatisk mekanisme af skade22,23,24,25,26. I forhold til menisk-ligamentous skade (MLI) eller forreste korsbånd skade (ACLI) operationer, DMM fremmer en mere gradvis progression af OA, svarende til OA udvikling hos mennesker22,24,25,26. Mus blev aflivet tolv uger efter DMM kirurgi til at evaluere ændringer i ledbrusk, subchondral knogle, og synovium.
Målet med denne protokol er at etablere en standardiseret, stringent og kvantitativ tilgang til evaluering af fælles ændringer, der ledsager OA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>For sample fixation following harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq 27QHD Creative Pen Display</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq Ergo stand</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC446080010</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>F7258</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For sample section collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoPrep Xylene</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>HC-700-1GAL</td>
			<td>For sample deparrafinization and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-182-701A</td>
			<td>For sample processing and embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Z440 Workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td>Product number: Y5C77US#ABA</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM 2235</td>
			<td>For sample sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801880</td>
			<td>For sample labeling, cassettes and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX53 Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS DP 73 Microscope Camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORION STAR A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoMeasure Software</td>
			<td>OsteoMetrics</td>
			<td>https://www.osteometrics.com/index.htm</td>
			<td>For histomorphometric measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model # 39471005</td>
			<td>For mouse knee harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM 7 Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Institutional Access Account</td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-O stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>S8884</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage</td>
			<td>Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)</td>
			<td>http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom Pro Pen Stylus</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029713</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029714</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model

En af de mest udbredte ledsygdomme i USA, slidgigt (OA) er karakteriseret ved progressiv degeneration af ledbrusk, primært i hofte-og knæled, hvilket resulterer i betydelige konsekvenser for patientens mobilitet og livskvalitet. Til dato er der ingen eksisterende helbredende behandlinger for OA i stand til at bremse eller hæmme brusk degeneration. I øjeblikket er der en omfattende mængde af igangværende forskning for at forstå OA patologi og opdage nye terapeutiske tilgange eller agenter, der effektivt kan bremse, stoppe, eller endda vende OA. Det er således afgørende at have en kvantitativ og reproducerbar tilgang til præcist at evaluere OA-relaterede patologiske ændringer i den fælles brusk, synovium og subchondral knogle. I øjeblikket, OA sværhedsgrad og progression er primært vurderes ved hjælp af Slidgigt Research Society International (OARSI) eller Mankin scoring systemer. På trods af betydningen af disse scoringssystemer er de semikvantitative og kan påvirkes af brugerens subjektivitet. Endnu vigtigere, de undlader at præcist at vurdere subtile, men vigtigt, ændringer i brusk i de tidlige sygdomstilstande eller tidlige behandlingsfaser. Den protokol, vi beskriver her, bruger et edb-og semiautomatiseret histomorfometrisk softwaresystem til at etablere en standardiseret, stringent og reproducerbar kvantitativ metode til evaluering af fælles ændringer i OA. Denne protokol udgør et stærkt supplement til de eksisterende systemer og giver mulighed for mere effektiv påvisning af patologiske ændringer i leddet.

DMM-induceret OA resulterer i artikulær bruskdegeneration og chondrocyt tab DMM-induceret OA resulterede i en øget OARSI score sammenlignet med fingerede mus, tydeligt karakteriseret ved overfladeerosion og brusk tab (Figur 1A,D). Histomorftriprotokollen, der er beskrevet her, afslørede flere OA-relaterede ændringer, herunder et fald i det samlede bruskområde og i det ukalkede bruskområde (figur 1A,B,<s...

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Den nuværende protokol indfører en streng og reproducerbar metode til kvantificering af morfologiske fælles ændringer, der ledsager slidgigt. Anvendelse af denne protokol kan være værdifuld i overvågning af sygdomsprogression og evaluering terapeutiske indgreb i slidgigt.

Standardiseret histomorforisk evaluering af slidgigt i en kirurgisk musemodel

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Vores protokol omhandler et udækket behov for en robust og reproducerbar metode til kvantitativ analyse af fælles ændringer i slidgigt udvikling og progression. Vores teknik skitserer specifikke og reproducerbare parametre for den kvantitative analyse af ændringer i flere ledvæv i slidgigt. Da denne teknik giver mulighed for kvantitativ analyse af slidgigt, Det kan anvendes til at sammenligne virkningerne af specifikke behandlinger på flere ledvæv for at vurdere deres terapeutiske effekt.Vores protokol kan også anvendes på andre slidgigt modeller eller områder af bevægeapparatet forskning, hvor kvantificering af brusk og knogler er nødvendig. Selv om systemet er ligetil og intuitivt, er træningssessioner stadig nødvendige for at øve sig i at opnå målinger på en gentagen måde for at opnå reproducerbarhed. Vengadeshprabhu Karuppagounder, en postdoc fra vores laboratorium vil nu demonstrere vores procedure.Begynd med at tænde for mikroskopet, kameraet, computeren og berøringsskærmen. Vælg 4X objektivet, og klik på softwareikonet for at starte programmet. Anvend diaset på mikroskopstadiet, og centrer prøven i målevinduet, der sikrer, at målegitteret er indstillet til den korrekte forstørrelse, så det svarer til målet, idet både den tibiale og femorale ledflade og tibial underkondoskopale knogle er inkluderet i billedområderne af interesse.Vælg derefter Læseindstillinger under menuen Filer. Vælg den relevante indstillingsfil for de parametre, der skal måles, i vinduet Indstillinger. For at måle det samlede bruskområde skal du vælge Tib TC-funktionen og spore langs den overlegne kant af den tibiale bruskoverflade, hvor brusken møder det fælles rum og langs chondro-forbenet kryds, hvor forkalket brusk møder underkodvenden.For at måle det forkalkede bruskområde skal du vælge Tib CC-funktionen og spore en linje langs tidevandsmærket, en naturligt forekommende linje, der adskiller bruskens forkalkede og ikke-beregnede områder, og langs det korndrooseøse kryds, hvor den forkalkede brusk opfylder underkodlen. For at bestemme det ukaksificerede bruskområde trækkes det forkalkede bruskområde fra det samlede bruskområde. For at bestemme chondrocytnummeret skal du oprette separate optællingsfunktioner i indstillingerne i histomorphometrisoftwaren for at skelne mellem matrixproducerende og matrix ikke-producerende chondrocytter.Brug derefter pennen til at lave en lille prik over hver chondrocyt, der udtrykker den angivne fænotype, til at bestemme antallet af matrixproducerende eller ikke producerer chondrocytter. For at måle den samlede tibial leddeparameter spores en linje over overfladen af tibialbrusk for omhyggeligt at definere de enkelte fibrillationer. Tegn derefter en anden linje langs tidevandsmærket for at fungere som et internt kontrolelement for planet af hver sektion og dividere den tibial ledfladeparameter med tidevandsmærkeparameteren for at beregne det tibial leddeliske overfladeflimmeringsindeks.Hvis du vil måle det underkolde marvområde, skal du vælge funktionen Marvområde. Derefter tegnes linjer omkring parameteren for disse områder for at bestemme det samlede område af knoglemarvsrummet inden for den tibiale underkodle. For at måle det samlede underkondobærle område skal du vælge funktionen Subchondral knogle og skitsere området mellem chondro-osseous krydset i den overlegne grænse af vækstplade, der strakte sig sidesom til områderne af de forreste og bageste osteophytes.Træk derefter det subchondrale knoglemarvsrumområde fra det samlede subchondralområde for at beregne det subchondrale knogleområde. For at måle osteophyt området, skal du vælge den forreste osteophyte funktion og spore den forreste osteophyte af det proksimale skinneben. Vælg derefter posterior osteophyte og spore den bageste osteophyte af det proksimale skinneben.For at måle den forreste femteroriske synovial tykkelse, skal du klikke på Forreste Femur Synovium Meniscus og trække en linje fra den indre indsættelse punkt af den forreste synovium på lårbenet mod sin fastgørelse punkt på menisken og en linje fra den ydre indsættelse af synovium på lårbenet mod dens tilknytning til menisken. Divider derefter det samlede synovialområde med synovialparameteren for at beregne synovialtykkelsen. DMM induceret slidgigt resulterer i en øget Slidgigt Research Society International score i forhold til fingeret mus.Tydeligt karakteriseret ved overflade erosion og brusk tabt. Denne histomormormetri protokol kan bruges til at opdage flere slidgigt associerede ændringer, herunder et fald i den samlede brusk og ukaksificeret brusk områder. En reduktion i det samlede chondrocyte antal og vigtigere, et tab i antallet af matrix producerer chondrocytter.Ændringer i ledfladen, der indikerer erosionens sværhedsgrad, observeres også, herunder en samlet stigning i fibrillationsindekset. Slidgigt omfatter også en stigning i subchondral knogleområde og en reduktion i området af knoglemarvsrummet i DMM mus, der angiver subchondral knoglesklerose. Både den forreste og bageste osteophyte områder også steget i DMM mus, hvilket tyder på en igangværende subchondral knogle remodeling, der fungerer som en kompenserende mekanisme til at håndtere ændringer i fælles belastning på stedet for skade.Histomorfmetrisk analyse af synoviumtet viser en stigning i synovialtykkelsen i DMM-mus. Et typisk resultat af slidgigt associeret synovial inflammation og diffusion af inflammatoriske cytokiner i det fælles rum. Desuden observeres der ingen signifikant variation mellem den histomorfmetriske analyse af det ukaksificerede bruskområde i Slidgigt Research Society International score.Efter histomorfologisk analyse kan sekventielle lysbilleder og immunfluorescensfarvning bruges til at undersøge ændringer i proteinudtryk mellem prøverne.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Implantation af ringere Vena Cava indskydning Graft i musemodel

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Transplantation af pulmonale ventilen med en musemodel af Heterotop Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

The Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis Pain in the Mouse

Den Monoiodoacetate Model of Slidgigt Smerter i Mus

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet måling af musen mesenterica arterie ved hjælp af Wire blodkar

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

Den nedre krop positive tryk løbebånd for knæ slidgigt rehabilitering

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Evaluering af leverglukoseproduktion i en polycystisk ovarie syndrom musemodel

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

Retinal patofysiologisk evaluering i en rottemodel

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Treating Knee Osteoarthritis with Tuina in a Rabbit Model

Tuina Intervention in Rabbit Model of Knee Osteoarthritis

Using a Rabbit Model to Explore the Efficacy of Tuina in Treating Knee Osteoarthritis (Video) | JoVE

Tuina intervention i kanin model af knæ slidgigt

Knee osteoarthritis (KOA) is mainly characterized by degenerative changes in the knee joint's cartilage and surrounding soft tissues. The efficacy of ...

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model (Video) | JoVE

Trabekulær knoglemikroarkitektur evaluering i en osteoporose mus model

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...