Name: standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model
Uploaded: 2020-05-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

We willen graag de hulp erkennen van het departement vergelijkende geneeskunde personeel en de moleculaire en histopathologie kern in Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Financieringsbronnen: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Artritis Research Grant (F.K.).

Twaalf weken oude mannelijke C57BL/6 muizen werden gekocht bij Jax Labs. Alle muizen werden gehuisvest in groepen van 3-5 muizen per micro-isolator kooi in een kamer met een 12 uur licht / donker schema. Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de National Institute of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van Pennsylvania State University.
1. Posttraumatische artrose (PTOA) chirurgisch model
<o...

Recent onderzoek naar artrose heeft ons begrip van de kruisbestuiving tussen de verschillende weefsels in het gewricht en de rol die elk weefsel speelt bij het initiëren van de ziekte of progressie8,,9,10,35,36. Het is dan ook duidelijk geworden dat de beoordeling van OA niet beperkt moet blijven tot de analyse van het kraakbeen, maar ook een analyse van het ...

Een van de meest voorkomende gewrichtsaandoeningen in de Verenigde Staten, OA wordt gekenmerkt door progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen, voornamelijk in de heup-en kniegewrichten, wat resulteert in aanzienlijke effecten op de mobiliteit van de patiënt en de kwaliteit van leven1,2,3. Gewrichtskraakbeen is het gespecialiseerde bindweefsel van diarthrodiale gewrichten ontworpen om wrijving te minimaliseren, beweging te vergemakkelijken en gewrichtscompressie te verdragen4. Gewrichtskraakbeen bestaat uit twee primaire componenten: chondrocyten en extracellulaire matrix. Chondrocyten zijn gespecialiseerde, metabolisch actieve cellen die een primaire rol spelen in de ontwikkeling, het onderhoud en de reparatie van de extracellulaire matrix4. Chondrocyte hypertrofie (CH) is een van de belangrijkste pathologische tekenen van OA-ontwikkeling. Het wordt gekenmerkt door een verhoogde cellulaire grootte, verminderde proteoglycan productie, en verhoogde productie van kraakbeen matrix-vernederende enzymen die uiteindelijk leiden tot kraakbeen degeneratie5,6,7. Verder spelen pathologische veranderingen in het subchondal bot en synovium van het gewricht een belangrijke rol in oa-ontwikkeling en progressie8,9,10,11,12. Tot op heden zijn er geen bestaande curatieve therapieën diekraakbeendegeneratie1,2,3,13,14remmen . Zo is er uitgebreid lopend onderzoek dat tot doel heeft oa-pathologie te begrijpen en nieuwe therapeutische benaderingen te ontdekken die in staat zijn om OA te vertragen of zelfs te stoppen. Daarom is er een toenemende behoefte aan een kwantitatieve en reproduceerbare aanpak die een nauwkeurige evaluatie van oa-geassocieerde pathologische veranderingen in het kraakbeen, synovium en subchondrale bot van het gewricht mogelijk maakt.
Momenteel worden oa ernst en progressie voornamelijk beoordeeld met behulp van de OARSI of Mankin scoring systems15. Deze scoresystemen zijn echter slechts semikwantitatief en kunnen worden beïnvloed door de subjectiviteit van de gebruiker. Wat nog belangrijker is, ze niet nauwkeurig te evalueren subtiele veranderingen die zich voordoen in het gewricht tijdens de ziekte of in reactie op genetische manipulatie of een therapeutische interventie. Er zijn sporadische rapporten in de literatuur die histomorfometrische analyses van het kraakbeen, synovium, of subchondralbot16,17,18,19,,,20,21beschrijven . Een gedetailleerd protocol voor een rigoureuze en reproduceerbare histomorfometrische analyse van al deze gemeenschappelijke componenten ontbreekt echter nog steeds, waardoor een onvervulde behoefte in het veld ontstaat.
Om pathologische veranderingen in OA te bestuderen met histomorfometrische analyse, gebruikten we een chirurgisch OA-muismodel om OA te induceren via destabilisatie van de mediale meniscus (DMM). Onder de gevestigde modellen van murine OA, DMM werd geselecteerd voor onze studie, omdat het gaat om een minder traumatisch mechanisme van letsel22,23,24,25,26. In vergelijking met meniscal-ligamenteuze letsel (MLI) of voorste kruisbandletsel (ACLI) operaties, DMM bevordert een meer geleidelijke progressie van OA, vergelijkbaar met OA ontwikkeling bij de mens22,24,25,26. Muizen werden twaalf weken na de DMM-operatie geëuthanaseerd om veranderingen in het gewrichtskraakbeen, subchondrale bot en synovium te evalueren.
Het doel van dit protocol is om een gestandaardiseerde, rigoureuze en kwantitatieve aanpak vast te stellen om gezamenlijke veranderingen te evalueren die oa vergezellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>For sample fixation following harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq 27QHD Creative Pen Display</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq Ergo stand</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC446080010</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>F7258</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For sample section collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoPrep Xylene</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>HC-700-1GAL</td>
			<td>For sample deparrafinization and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-182-701A</td>
			<td>For sample processing and embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Z440 Workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td>Product number: Y5C77US#ABA</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM 2235</td>
			<td>For sample sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801880</td>
			<td>For sample labeling, cassettes and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX53 Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS DP 73 Microscope Camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORION STAR A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoMeasure Software</td>
			<td>OsteoMetrics</td>
			<td>https://www.osteometrics.com/index.htm</td>
			<td>For histomorphometric measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model # 39471005</td>
			<td>For mouse knee harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM 7 Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Institutional Access Account</td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-O stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>S8884</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage</td>
			<td>Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)</td>
			<td>http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom Pro Pen Stylus</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029713</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029714</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model

Een van de meest voorkomende gewrichtsaandoeningen in de Verenigde Staten, artrose (OA) wordt gekenmerkt door progressieve degeneratie van gewrichtskraakbeen, voornamelijk in de heup-en kniegewrichten, wat resulteert in aanzienlijke effecten op de mobiliteit van de patiënt en de kwaliteit van leven. Tot op heden zijn er geen bestaande curatieve therapieën voor OA in staat om te vertragen of te remmen kraakbeen degeneratie. Momenteel is er een uitgebreid lichaam van lopend onderzoek om OA-pathologie te begrijpen en nieuwe therapeutische benaderingen of middelen te ontdekken die efficiënt kunnen vertragen, stoppen of zelfs OA kunnen omkeren. Het is dus van cruciaal belang om een kwantitatieve en reproduceerbare benadering te hebben om oa-geassocieerde pathologische veranderingen in het gewrichtskraakbeen, synovium en subchondrale bot nauwkeurig te evalueren. Momenteel, OA ernst en progressie worden voornamelijk beoordeeld met behulp van de Artrose Research Society International (OARSI) of Mankin scoren systemen. Ondanks het belang van deze scoresystemen zijn ze semikwantitatief en kunnen ze worden beïnvloed door de subjectiviteit van de gebruiker. Wat nog belangrijker is, ze niet nauwkeurig te evalueren subtiele, maar toch belangrijk, veranderingen in het kraakbeen tijdens de vroege ziekte staten of vroege behandelingsfasen. Het protocol dat we hier beschrijven maakt gebruik van een geautomatiseerd en semigeautomatiseerd histomorfometrisch softwaresysteem om een gestandaardiseerde, rigoureuze en reproduceerbare kwantitatieve methodologie vast te stellen voor de evaluatie van gezamenlijke veranderingen in OA. Dit protocol biedt een krachtige aanvulling op de bestaande systemen en zorgt voor een efficiëntere detectie van pathologische veranderingen in het gewricht.

DMM-geïnduceerde OA resulteert in gewrichtskraakbeendegeneratie en chondrocyteverlies DMM-geïnduceerde OA resulteerde in een verhoogde OARSI score in vergelijking met sham muizen, duidelijk gekenmerkt door oppervlakteerosie en kraakbeenverlies (Figuur 1A,D). Het hier beschreven histomorfometrieprotocol heeft verschillende oa-geassocieerde veranderingen gedetecteerd, waaronder een afname van het totale kraakbeenareaal en in het ongecalcificeerde kraakbee...

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Het huidige protocol stelt een rigoureuze en reproduceerbare methode voor kwantificering van morfologische gewrichtsveranderingen die gepaard gaan met artrose. Toepassing van dit protocol kan waardevol zijn bij het monitoren van ziekteprogressie en het evalueren van therapeutische interventies bij artrose.

Gestandaardiseerde Histomormetrische evaluatie van artrose in een chirurgisch muismodel

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Ons protocol gaat in op een onvervulde behoefte aan een robuuste en reproduceerbare methode voor kwantitatieve analyse van gewrichtsveranderingen in de ontwikkeling en progressie van artrose. Onze techniek schetst specifieke en reproduceerbare parameters voor de kwantitatieve analyse van veranderingen in meerdere gewrichtsweefsels bij artrose. Aangezien deze techniek zorgt voor kwantitatieve analyse van artrose, kan het worden gebruikt om de effecten van specifieke behandelingen op meerdere gewrichtsweefsels te vergelijken om hun therapeutische werkzaamheid te evalueren.Ons protocol kan ook worden toegepast op andere artrose modellen of gebieden van bewegingsapparaat onderzoek waarin kwantificering van kraakbeen en bot nodig is. Hoewel het systeem eenvoudig en intuïtief is, zijn trainingssessies nog steeds nodig om het verkrijgen van metingen op een herhaalde manier te oefenen om reproduceerbaarheid te bereiken. Vengadeshprabhu Karuppagounder, een postdoctoraal geleerde uit ons laboratorium zal nu onze procedure demonstreren.Begin met het inschakelen van de microscoop, camera, computer en touchscreen monitor. Selecteer de doelstelling 4X en klik op het softwarepictogram om het softwareprogramma te starten. Plaats de dia op het microscoopstadium en centreer het monster in het meetvenster, zodat het meetraster op de juiste vergroting is ingesteld om aan de doelstelling te voldoen, omdat zowel het scheenbeen- als het dijbeengewrichtsoppervlak en het scheenbeen subchondrale bot in de beeldgebieden van belang zijn opgenomen.Selecteer vervolgens onder het menu Bestand de optie Leesinstellingen. Selecteer in het venster Instellingen het juiste instellingenbestand voor de te meten parameters. Om het totale kraakbeengebied te meten, selecteert u de Tib TC-functie en traceert u langs de superieure rand van het scheenbeenoppervlak waar het kraakbeen de gewrichtsruimte en langs de chondro-osseous-kruising ontmoet waar verkalkt kraakbeen het subchondrale bot ontmoet.Om het verkalkte kraakbeengebied te meten, selecteert u de Tib CC-functie en traceert u een lijn langs het getijmerk, een natuurlijk voorkomende lijn die de verkalkte en niet-gecalceerde kraakbeengebieden scheidt en langs de chondro-osseous-kruising waar het verkalkte kraakbeen het subchondrale bot ontmoet. Om het niet-gecalcificeerde kraakbeengebied te bepalen, trekt u het verkalkte kraakbeengebied af van het totale kraakbeengebied. Om het chondrocyte-getal te bepalen, maakt u afzonderlijke telfuncties binnen de instellingen in de histomorphometry-software om de matrixproducerende en matrix niet-producerende chondrocyten te onderscheiden.Gebruik vervolgens de stylus om een kleine stip te maken over elke chondrocyte die het opgegeven fenotype uitdrukt om het aantal matrixen te bepalen dat al dan niet chondrocyten produceert. Om de totale scheenbeen articulaire oppervlakteparameter te meten, traceer een lijn over het oppervlak van het scheenbeen om de individuele fibrillaties zorgvuldig te definiëren. Teken vervolgens een tweede lijn langs het getijmarkering om te dienen als een interne controle voor het vlak van elke sectie en verdeel de scheeniële articulaire oppervlakteparameter door de parameter getijmarkering om de cibial articulaire illusbrilleringsindex te berekenen.Als u het subchondrale mergruimtegebied wilt meten, selecteert u de functie Merggebied. Teken vervolgens lijnen rond de parameter van deze gebieden om het totale gebied van beenmergruimte binnen het scheenbeen subchondrale bot te bepalen. Om het totale subchondrale gebied te meten, selecteert u de subchondrale botfunctie en schetst u het gebied tussen de chondro-osseous-verbinding in de superieure rand van de groeiplaat die zich zijdelings uitstrekt tot de gebieden van de voorste en achterste osteofyten.Trek vervolgens het subchondrale beenmergoppervlak af van het totale subchondrale gebied om het subchondrale botgebied te berekenen. Om het osteofytgebied te meten, selecteert u de voorste osteofytenfunctie en traceert u de voorste osteofyt van het proximale scheenbeen. Selecteer vervolgens achterste osteofyt en traceer de achterste osteofyt van het proximale scheenbeen.Om de voorste dijbeensynoviale dikte te meten, klikt u op Anterior Femur Synovium Meniscus en trekt u één lijn van de binneninbrengende punt van het voorste synovium op het dijbeen naar het bevestigingspunt op de meniscus en één regel van de buitenste invoeging van het synovium op het dijbeen naar de bevestiging aan de meniscus. Verdeel vervolgens het totale synoviale gebied door de synoviale parameter om de synoviale dikte te berekenen. DMM geïnduceerde artrose resulteert in een verhoogde Artrose Research Society International score in vergelijking met sham muizen.Duidelijk gekenmerkt door oppervlakteerosie en kraakbeen verloren. Dit histomorphomemetrie protocol kan worden gebruikt om verschillende artrose geassocieerde veranderingen, waaronder een afname van het totale kraakbeen en niet-calcified kraakbeen gebieden op te sporen. Een vermindering van het totale chondrocyte aantal en nog belangrijker, een verlies in het aantal matrix producerende chondrocyten.Veranderingen in het gewrichtsoppervlak, indicatief voor de ernst van erosie, worden ook waargenomen, waaronder een algehele toename van de fibrillatie-index. Artrose omvat ook een toename van het subchondrale botgebied en een vermindering van het gebied van de beenmergruimte in DMM-muizen die subchondrale botsclerose aangeven. Zowel de voorste en achterste osteofyten gebieden ook toegenomen in DMM muizen, wat suggereert een voortdurende subchondrale bot remodelleren dat fungeert als een compenserend mechanisme om veranderingen in de gezamenlijke belasting op de plaats van letsel te behandelen.Histomorfometrische analyse van het synovium toont een toename van de synoviale dikte bij DMM muizen. Een typische uitkomst van artrose geassocieerd synoviale ontsteking en de verspreiding van inflammatoire cytokinen in de gewrichtsruimte. Bovendien wordt geen significante variabiliteit tussen de gebruikers waargenomen tussen de histomorfometrische analyse van het niet-gecalcificeerde kraakbeengebied in de Artrose Research Society International-score.Na histomorfometrische analyse kunnen sequentiële dia's en immunofluorescentievlekken worden gebruikt om veranderingen in eiwitexpressie tussen monsters te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

A Novel chirurgische benadering voor intratracheale toediening van bioactieve stoffen in een Foetale Muis Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Implantatie van de vena cava inferior Interpositie Graft in muismodel

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Transplantatie van Pulmonary Valve een muis model van Heterotope Heart Transplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

The Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis Pain in the Mouse

De Monoiodoacetate Model van Artrose Pijn in de muis

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrische Contractility meting van de muis mesenterische slagader met behulp van draad Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

De onderlichaam positieve druk loopband voor knie artrose revalidatie

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Evaluatie van leverglucoseproductie in een muismodel met polycysteus ovariumsyndroom

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

Retinale pathofysiologische evaluatie in een rattenmodel

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Treating Knee Osteoarthritis with Tuina in a Rabbit Model

Tuina Intervention in Rabbit Model of Knee Osteoarthritis

Using a Rabbit Model to Explore the Efficacy of Tuina in Treating Knee Osteoarthritis (Video) | JoVE

Tuina-interventie in konijnenmodel van knieartrose

Knee osteoarthritis (KOA) is mainly characterized by degenerative changes in the knee joint's cartilage and surrounding soft tissues. The efficacy of ...

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model (Video) | JoVE

Evaluatie van de microarchitectuur van het trabeculaire bot in een muismodel met osteoporose

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...