Name: standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model
Uploaded: 2020-05-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

Nous tenons à remercier l’aide du personnel du Département de médecine comparée et du noyau moléculaire et histopathologique du Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Sources de financement : NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).

Des souris mâles de 12 semaines C57BL/6 ont été achetées auprès de Jax Labs. Toutes les souris ont été logées dans des groupes de 3-5 souris par cage de micro-isolateur dans une pièce avec un programme clair/foncé de 12 h. Toutes les procédures animales ont été effectuées selon le National Institute of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Pennsylvanie.
<p class="jove_ti...

La recherche récente sur l’arthrose a amélioré notre compréhension de la traque entre les différents tissus de l’articulation et le rôle que chaque tissu joue dans l’initiation ou la progression de la maladie8,9,10,35,36. Par conséquent, il est devenu évident que l’évaluation de l’œil ne devrait pas se limiter à l’analyse du cartilage, m...

L’un des troubles articulaires les plus répandus aux États-Unis, l’arthrose se caractérise par une dégénérescence progressive du cartilage articulaire, principalement dans les articulations de la hanche et du genou, ce qui entraîne des impacts significatifs sur la mobilité des patients et la qualité de vie1,2,3. Le cartilage articulaire est le tissu conjonctif spécialisé des articulations diarthrodiales conçues pour minimiser la friction, faciliter le mouvement et supporter la compression articulaire4. Le cartilage articulaire est composé de deux composants primaires : les chondrocytes et la matrice extracellulaire. Les chondrocytes sont des cellules spécialisées et métaboliquement actives qui jouent un rôle principal dans le développement, l’entretien et la réparation de la matrice extracellulaire4. L’hypertrophie chondrocyte (CH) est l’un des principaux signes pathologiques du développement de l’œd de l’œux. Il est caractérisé par l’augmentation de la taille cellulaire, la diminution de la production de protéoglycan, et l’augmentation de la production d’enzymes de matrice de cartilage dégradant qui mènent par la suite à la dégénérescence du cartilage5,6,7. En outre, les changements pathologiques dans l’os et le synovium subchondral de l’articulation jouent un rôle important dans le développement et la progressionde l’OV 8,9,10,11,12. À ce jour, il n’existe pas de thérapies curatives existantes qui inhibent la dégénérescence du cartilage1,2,3,13,14. Ainsi, il existe des recherches approfondies en cours qui visent à comprendre la pathologie de l’œa et à découvrir de nouvelles approches thérapeutiques qui sont capables de ralentir ou même d’arrêter l’œd de l’œil. En conséquence, il y a un besoin croissant pour une approche quantitative et reproductible qui permet l’évaluation précise des changements pathologiques oA-associés dans le cartilage, le synovium, et l’os subchondral de l’articulation.
Actuellement, la gravité et la progression de l’œd de l’œux sont principalement évaluées à l’aide des systèmes de notation OARSI ou Mankin15. Cependant, ces systèmes de notation ne sont que semi-quantitatifs et peuvent être influencés par la subjectivité de l’utilisateur. Plus important encore, ils ne parviennent pas à évaluer avec précision les changements subtils qui se produisent dans l’articulation pendant la maladie ou en réponse à une manipulation génétique ou une intervention thérapeutique. Il y a des rapports sporadiques dans la littérature décrivant des analyses histomorphométriques du cartilage, du synovium, ou de l’os subchondral16,17,18,19,20,21. Cependant, un protocole détaillé pour l’analyse histomorphométrique rigoureuse et reproductible de tous ces composants articulaires fait encore défaut, créant un besoin non satisfait sur le terrain.
Pour étudier les changements pathologiques dans l’arthrose à l’aide de l’analyse histomorphométrique, nous avons utilisé un modèle chirurgical de souris oA pour induire l’arthrose par déstabilisation du ménisque médial (DMM). Parmi les modèles établis de l’OA murine, DMM a été sélectionné pour notre étude parce qu’il implique un mécanisme moins traumatique de la blessure22,23,24,25,26. Par rapport aux blessures ménisque-ligamentaires (MLI) ou aux chirurgies antérieures des ligaments croisés (ACLI), DMM favorise une progression plus graduelle de l’OA, similaire au développement de l’OA chez l’homme22,24,25,26. Les souris ont été euthanasiées douze semaines après chirurgie de DMM pour évaluer des changements dans le cartilage articulaire, l’os subchondral, et le synovium.
L’objectif de ce protocole est d’établir une approche normalisée, rigoureuse et quantitative pour évaluer les changements conjoints qui accompagnent l’œil de sécurité.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>For sample fixation following harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq 27QHD Creative Pen Display</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq Ergo stand</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC446080010</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>F7258</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For sample section collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoPrep Xylene</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>HC-700-1GAL</td>
			<td>For sample deparrafinization and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-182-701A</td>
			<td>For sample processing and embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Z440 Workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td>Product number: Y5C77US#ABA</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM 2235</td>
			<td>For sample sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801880</td>
			<td>For sample labeling, cassettes and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX53 Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS DP 73 Microscope Camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORION STAR A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoMeasure Software</td>
			<td>OsteoMetrics</td>
			<td>https://www.osteometrics.com/index.htm</td>
			<td>For histomorphometric measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model # 39471005</td>
			<td>For mouse knee harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM 7 Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Institutional Access Account</td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-O stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>S8884</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage</td>
			<td>Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)</td>
			<td>http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom Pro Pen Stylus</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029713</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029714</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model

L’un des troubles articulaires les plus répandus aux États-Unis, l’arthrose (ARTH) se caractérise par une dégénérescence progressive du cartilage articulaire, principalement dans les articulations de la hanche et du genou, ce qui a des répercussions importantes sur la mobilité des patients et la qualité de vie. À ce jour, il n’existe aucune thérapie curative existante pour l’œud de œvé capable de ralentir ou d’inhiber la dégénérescence du cartilage. À l’heure actuelle, il existe un vaste ensemble de recherches en cours pour comprendre la pathologie de l’œd de l’œil et découvrir de nouvelles approches thérapeutiques ou des agents qui peuvent ralentir efficacement, arrêter ou même inverser l’œd de soi. Ainsi, il est crucial d’avoir une approche quantitative et reproductible pour évaluer avec précision les changements pathologiques associés à l’OA dans le cartilage articulaire, le synovium et l’os subchondral. À l’heure actuelle, la gravité et la progression de l’arthrose sont principalement évaluées à l’aide des systèmes internationaux de recherche sur l’arthrose (OARSI) ou Mankin. Malgré l’importance de ces systèmes de notation, ils sont semi-quantitatifs et peuvent être influencés par la subjectivité de l’utilisateur. Plus important encore, ils ne parviennent pas à évaluer avec précision les changements subtils, mais importants, dans le cartilage au cours des premiers états de la maladie ou des phases de traitement précoce. Le protocole que nous décrivons ici utilise un système logiciel histomorphométrique informatisé et semi-automatisé pour établir une méthodologie quantitative normalisée, rigoureuse et reproductible pour l’évaluation des changements conjoints dans l’arthrose. Ce protocole présente un ajout puissant aux systèmes existants et permet une détection plus efficace des changements pathologiques dans l’articulation.

L’OA induit par DMM entraîne une dégénérescence articulaire du cartilage et une perte de chondrocyte L’OA induit par le DMM a entraîné une augmentation du score d’OARSI par rapport aux souris simulées, caractérisées distinctement par l’érosion de surface et la perte de cartilage(figure 1A,D). Le protocole d’histomorphométrie détaillé ici a détecté plusieurs changements associés à l’OA, y compris une diminution de la région to...

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Le protocole actuel établit une méthode rigoureuse et reproductible pour la quantification des changements articulaires morphologiques qui accompagnent l’arthrose. L’application de ce protocole peut être utile en surveillant la progression de la maladie et en évaluant les interventions thérapeutiques dans l’arthrose.

Évaluation histomorphométrique normalisée de l’arthrose dans un modèle chirurgical de souris

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Notre protocole répond à un besoin non satisfait d’une méthode robuste et reproductible pour l’analyse quantitative des changements articulaires dans le développement et la progression de l’arthrose. Notre technique décrit des paramètres spécifiques et reproductibles pour l’analyse quantitative des changements dans les tissus articulaires multiples dans l’arthrose. Comme cette technique permet une analyse quantitative de l’arthrose, elle peut être utilisée pour comparer les effets de traitements spécifiques sur plusieurs tissus articulaires afin d’évaluer leur efficacité thérapeutique.Notre protocole peut également être appliqué à d’autres modèles d’arthrose ou à des domaines de recherche musculo-squelettique dans lesquels la quantification du cartilage et de l’os est nécessaire. Bien que le système soit simple et intuitif, des sessions de formation sont encore nécessaires pour pratiquer l’obtention de mesures de manière répétée pour atteindre la reproductibilité. Vengadeshprabhu Karuppagounder, un chercheur postdoctoral de notre laboratoire va maintenant démontrer notre procédure.Commencez par allumer le microscope, la caméra, l’ordinateur et le moniteur d’écran tactile. Sélectionnez l’objectif 4X et cliquez sur l’icône logicielle pour lancer le logiciel. Placez la diapositive sur le stade du microscope et centrez l’échantillon à l’intérieur de la fenêtre de mesure en veillant à ce que la grille de mesure soit réglée au grossissement approprié pour correspondre à l’objectif en ce que la surface articulaire tibiale et fémorale et l’os subchondral tibial sont inclus dans les régions d’image d’intérêt.Ensuite, sous le menu Fichier, sélectionnez Paramètres de lecture. Dans la fenêtre Paramètres, sélectionnez le fichier paramètres approprié pour mesurer les paramètres. Pour mesurer la surface totale du cartilage, sélectionnez la fonction Tib TC et tracez le long du bord supérieur de la surface du cartilage tibial où le cartilage rencontre l’espace articulaire et le long de la jonction chondro-osseous où le cartilage calcifié rencontre l’os subchondral.Pour mesurer la zone calcifiée du cartilage, sélectionnez la fonction Tib CC et tracez une ligne le long de la marque de marée, une ligne naturelle séparant les régions calcifiées et non calcifiées du cartilage, et le long de la jonction chondro-osseous où le cartilage calcifié rencontre l’os subchondral. Pour déterminer la zone non calcalcifiée du cartilage, soustrayez la zone calcifiée du cartilage de la zone totale du cartilage. Pour déterminer le nombre de chondrocytes, créez des fonctions de comptage distinctes dans les paramètres du logiciel d’histomorphométrie pour distinguer la matrice produisant et matricielle des chondrocytes non productifs.Ensuite, utilisez le stylet pour faire un petit point sur chaque chondrocyte exprimant le phénotype spécifié pour déterminer le nombre de matrices produisant ou ne produisant pas de chondrocytes. Pour mesurer le paramètre total de surface articulaire tibiale, tracez une ligne à travers la surface du cartilage tibial pour définir soigneusement les fibrillations individuelles. Puis tracez une deuxième ligne le long de la marque de marée pour servir de contrôle interne pour le plan de chaque section et diviser le paramètre de surface articulaire tibiale par le paramètre de la marque de marée pour calculer l’indice de fibrillation de surface articulaire tibiale.Pour mesurer la zone spatiale subchondral de moelle, sélectionnez la fonction zone de moelle. Puis tracer des lignes autour du paramètre de ces zones pour déterminer la zone totale de l’espace de moelle osseuse dans l’os sous-chondral tibial. Pour mesurer la zone subchondral totale, sélectionnez la fonction d’os subchondral et décrivent la région entre la jonction chondro-osseous dans la frontière supérieure de la plaque de croissance s’étendant latéralement aux régions des ostéophytes antérieurs et postérieurs.Puis soustrayez la zone d’espace subchondral de moelle de la zone subchondral totale pour calculer la zone subchondral d’os. Pour mesurer la zone ostéophyte, sélectionnez la fonction ostéophyte antérieure et tracez l’ostéophyte antérieur du tibia proximal. Sélectionnez ensuite l’ostéophyte postérieur et tracez l’ostéophyte postérieur du tibia proximal.Pour mesurer l’épaisseur synoviale fémorale antérieure, cliquez sur Le Ménisque antérieur de Synovium de Fémur et tracez une ligne du point d’insertion interne du synovium antérieur sur le fémur vers son point d’attachement sur le ménisque et une ligne de l’insertion externe du synovium sur le fémur vers son attachement au ménisque. Divisez ensuite la zone synoviale totale par le paramètre synovial pour calculer l’épaisseur synoviale. L’arthrose induite par le DMM entraîne une augmentation du score de la Société internationale de recherche sur l’arthrose par rapport aux souris factices.Nettement caractérisé par l’érosion de surface et le cartilage perdu. Ce protocole d’histomorphométrie peut être utilisé pour détecter plusieurs changements associés à l’arthrose, y compris une diminution du cartilage total et des zones cartilagineux noncalcifiées. Une réduction du nombre total de chondrocytes et, surtout, une perte du nombre de matrices produisant des chondrocytes.Des changements à la surface articulaire, indicatifs de la gravité de l’érosion, sont également observés, y compris une augmentation globale de l’indice de fibrillation. L’arthrose comprend également une augmentation de la zone osseuse subchondral et une réduction de la zone de l’espace de moelle osseuse chez les souris DMM indiquant la sclérose osseuse subchondral. Les secteurs antérieurs et postérieurs d’osteophyte ont également augmenté chez les souris de DMM, suggérant un remodelage subchondral continu d’os qui agit comme mécanisme compensatoire pour manipuler des changements dans la charge commune au site de la blessure.L’analyse histomorphométrique du synovium montre une augmentation de l’épaisseur synoviale chez les souris DMM. Un résultat typique de l’ostéoarthrite a associé l’inflammation synoviale et la diffusion des cytokines inflammatoires dans l’espace commun. En outre, aucune variabilité inter-utilisateur significative entre l’analyse histomorphométrique de la zone noncalcifiée de cartilage dans le score international d’Osteoarthritis Research Society n’est observée.Après analyse histomorphométrique, des diapositives séquentielles et des taches d’immunofluorescence peuvent être utilisées pour examiner les changements dans l’expression des protéines entre les échantillons.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Une nouvelle approche chirurgicale pour l&#39;administration intratrachéale d&#39;agents bioactifs dans un modèle de souris fœtale

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Recherche

Médecine

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Implantation de veine cave inférieure interposition de greffe en modèle de souris

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Transplantation de valve pulmonaire en utilisant un modèle de souris de transplantation cardiaque hétérotopique

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

The Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis Pain in the Mouse

Le modèle monoïodacétate de douleur arthrosique chez la souris

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

Le tapis roulant à pression positive du bas du corps pour la réadaptation de l'arthrose du genou

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Évaluation de la production de glucose hépatique dans un modèle murin du syndrome des ovaires polykystiques

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

Évaluation physiopathologique rétinienne dans un modèle de rat

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Treating Knee Osteoarthritis with Tuina in a Rabbit Model

Tuina Intervention in Rabbit Model of Knee Osteoarthritis

Using a Rabbit Model to Explore the Efficacy of Tuina in Treating Knee Osteoarthritis (Video) | JoVE

Intervention Tuina chez le lapin Modèle d’arthrose du genou

Knee osteoarthritis (KOA) is mainly characterized by degenerative changes in the knee joint's cartilage and surrounding soft tissues. The efficacy of ...

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model (Video) | JoVE

Évaluation de la microarchitecture de l’os trabéculaire dans un modèle murin d’ostéoporose

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...