Name: standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model
Uploaded: 2020-05-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

ברצוני להכיר בעזרתם של צוות המחלקה לרפואה השוואתית והליבה המולקולרית וההיסטולוגיה במרכז הרפואי פן מילטון ס. הרשי. מקורות מימון: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (סיר f סאוויני), דלקת מפרקים אנRF מחקר מענק (סיר f סאוויני).

בן שתים עשרה שבועות C57BL עכברים שנרכשו ממעבדות ג'אקס. כל העכברים שוכנו בקבוצות של 3 – 5 עכברים לכל כלוב מיקרו מבודדת בחדר עם לוח זמנים של 12 שעות אור/כהה. כל ההליכים בעלי חיים בוצעו על פי המדריך הלאומי לבריאות (NIH) מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמ?...

מחקר אוסטיאוארתריטיס האחרונות הגדילו את ההבנה שלנו של הוצלב בין הרקמות השונות בתוך המפרק ואת התפקיד כל רקמה משחק חניכה המחלה או התקדמות8,9,10,35,36. בהתאם, זה הפך ברור כי הערכה של OA לא צריך להיות מוגבל נית?...

אחת ההפרעות המשותפת הנפוצות ביותר בארצות הברית, OA מאופיין על ידי ניוון פרוגרסיבי של סחוס משני, בעיקר הירך ואת מפרקי הברך, אשר תוצאות השפעות משמעותיות על ניידות המטופל איכות החיים1,2,3. סחוס מעבר העור הוא רקמת החיבור המקצועית של המפרקים diarthrodial נועד למזער את החיכוך, להקל על התנועה, ולסבול דחיסה משותפת4. הסחוס הראשי מורכב משני מרכיבים עיקריים: כונדרוציטים ו מטריקס מסחטות. כונדרוציטים הם התמחה, metabolically תאים פעילים המשחק תפקיד עיקרי בפיתוח, תחזוקה, ותיקון של מטריצה החילוץ4. היפרפרס כונדרוציטים (CH) הוא אחד הסימנים הפתולוגיים העיקריים של התפתחות OA. הוא מאופיין על ידי גודל הסלולר גדל, ירידה בייצור פרוטאוגליקן, וייצור מוגבר של אנזימים מכמטריקס משפיל הסחוס כי בסופו של דבר להוביל את ניוון הסחוס5,6,7. עוד, שינויים פתולוגיים בעצם subchondral ו synovium של משותף לשחק תפקיד חשוב בפיתוח OA התקדמות8,9,10,11,12. עד כה, אין טיפולים מרפא קיימים המעעכב את ניוון הסחוס1,2,3,13,14. לפיכך, יש מחקר מתמשך נרחב שמטרתו להבין מחלות OA ולגלות גישות טיפוליות הרומן כי הם מסוגלים להאט או אפילו לעצור OA. לפיכך, יש צורך הולך וגובר לגישה כמותית ומשתנה המאפשר הערכה מדויקת של שינויים פתולוגיים OA הקשורים הסחוס, synovium, ו subchondral bone של המפרק.
כיום, חומרת OA והתקדמות מוערך בעיקר באמצעות מערכות הניקוד OARSI או Mankin15. עם זאת, מערכות הניקוד הללו הן רק חצי כמותית ויכולות להיות מושפעות מסובייקטיביות משתמשים. חשוב מכך, הם נכשלים בהערכת מדויק של שינויים עדינים המתרחשים במפרק במהלך המחלה או בתגובה מניפולציה גנטית או התערבות טיפולית. ישנם דיווחים מאוד בספרות המתארת ניתוחים היסטומריים של הסחוס, סינובינום, או subchondral bone16,17,18,19,20,21. עם זאת, פרוטוקול מפורט לניתוח היסטראומטרי קפדני ומעמיק של כל הרכיבים המשותפים הללו עדיין חסר, ויוצר צורך בלתי מתקיים בתחום.
כדי ללמוד שינויים פתולוגיים ב OA באמצעות ניתוח histomorphometric, השתמשנו במודל העכבר OA כירורגית כדי לגרום OA באמצעות חוסר יציבות של מניסקוס המדילי (dmm). בין המודלים הקימו של מורנה OA, dmm נבחר עבור המחקר שלנו כי זה כרוך מנגנון פחות טראומטי של פציעה22,23,24,25,26. בהשוואה ל-meniscal-ligamentous פציעה (mli) או פציעה ברצועה הצולבת הקדמית (acli) ניתוחים, dmm מקדם התקדמות הדרגתית יותר של OA, דומה לפיתוח oa בבני אדם22,24,25,26. עכברים הורדמים 12 שבועות לאחר ניתוח DMM להערכת שינויים הסחוס הפרקולארית, subchondral bone, ו synovium.
המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור גישה סטנדרטית, קפדנית וכמותית להערכת שינויים משותפים המלווים OA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>For sample fixation following harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq 27QHD Creative Pen Display</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq Ergo stand</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC446080010</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>F7258</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For sample section collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoPrep Xylene</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>HC-700-1GAL</td>
			<td>For sample deparrafinization and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-182-701A</td>
			<td>For sample processing and embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Z440 Workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td>Product number: Y5C77US#ABA</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM 2235</td>
			<td>For sample sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801880</td>
			<td>For sample labeling, cassettes and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX53 Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS DP 73 Microscope Camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORION STAR A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoMeasure Software</td>
			<td>OsteoMetrics</td>
			<td>https://www.osteometrics.com/index.htm</td>
			<td>For histomorphometric measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model # 39471005</td>
			<td>For mouse knee harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM 7 Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Institutional Access Account</td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-O stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>S8884</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage</td>
			<td>Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)</td>
			<td>http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom Pro Pen Stylus</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029713</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029714</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model

אחת ההפרעות המשותפת הנפוצות ביותר בארצות הברית, אוסטיאוארתריטיס (OA) מאופיין על ידי ניוון פרוגרסיבי של סחוס משני, בעיקר הירך ואת המפרקים בברך, אשר התוצאה משפיע משמעותית על ניידות המטופל איכות החיים. עד כה, אין טיפולים מרפא קיימים עבור OA מסוגל להאט או לעכב ניוון הסחוס. כיום, יש גוף נרחב של מחקר מתמשך להבין פתולוגיה OA לגלות גישות טיפוליות הרומן או סוכנים שיכולים ביעילות להאט, לעצור, או אפילו הפוכה OA. לפיכך, חיוני לקבל גישה כמותית ומשובת להעריך במדויק שינויים פתולוגיים המשויכים OA הסחוס המפרק, synovium, ו subchondral bone. כיום, חומרת OA והתקדמות מוערך בעיקר באמצעות החברה מחקר אוסטיאוארתריטיס הבינלאומי (OARSI) או מנצ מערכות הניקוד. למרות החשיבות של מערכות הניקוד הללו, הן כמותיים למחצה ויכולות להיות מושפעות מסובייקטיביות של המשתמש. חשוב מכך, הם לא מצליחים להעריך במדויק מעודן, אך חשובות, שינויים בסחוס במהלך מצבי המחלה המוקדמים או שלבי הטיפול המוקדמים. הפרוטוקול שאנו מתארים כאן משתמש במערכת תוכנה ממוחשבת וחצי אוטומטית ליצירת מתודולוגיה כמותית מתוקננת ומחמירה להערכת שינויים משותפים ב OA. פרוטוקול זה מציג תוספת רבת עוצמה למערכות הקיימות ומאפשר זיהוי יעיל יותר של שינויים פתולוגיים במפרק.

DMM-המושרה תוצאות OA בניוון הסחוס הפרקולארית והפסד כונדרוציטוט OA המושרה DMM הביא לציון OARSI גדל לעומת עכברים מזויפים, מאופיין בבירור על ידי שחיקת פני השטח ואובדן הסחוס (איור 1A,D). פרוטוקול histomorphometry מפורט כאן זיהה כמה שינויים OA הקשורים, כולל ירידה באזור הסחוס ה...

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

הפרוטוקול הנוכחי יוצר שיטה קפדנית ומתוכנות לכמת של שינויים מורפולוגיים המלווים אוסטיאוארתריטיס. יישום פרוטוקול זה יכול להיות בעל ערך בניטור התקדמות המחלה והערכת התערבויות טיפוליות אוסטיאוארתריטיס.

מתוקננת הערכה היסטראורמטרית של אוסטיאוארתריטיס במודל עכבר כירורגי

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

הפרוטוקול שלנו מטפל בצורך בלתי ניתן לשחזור בשיטה חזקה ובלתי ניתנת לשחזור לניתוח כמותי של שינויים במפרקים בפיתוח והתקדמות של דלקת מפרקים ניוונית. הטכניקה שלנו מתארת פרמטרים ספציפיים וניתנים לשחזור לניתוח כמותי של שינויים ברקמות מפרקים מרובות בדלקת מפרקים ניוונית. כמו טכניקה זו מאפשרת ניתוח כמותי של דלקת מפרקים ניוונית, זה יכול להיות מועסק כדי להשוות את ההשפעות של טיפולים ספציפיים על רקמות מפרקים מרובים על מנת להעריך את היעילות הטיפולית שלהם.הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם גם על מודלים אחרים דלקת מפרקים ניוונית או אזורים של מחקר השלד והשרירים שבו כימות של סחוס ועצמות יש צורך. למרות שהמערכת פשוטה ואינטואיטיבית, עדיין יש צורך באימונים כדי לתרגל קבלת מדידות באופן חוזר ונשנה כדי להשיג רבייה. ונגדשפראבהו קארופגונדר, חוקר פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו, ידגים כעת את ההליך שלנו.התחל בהפניית המיקרוסקופ, המצלמה, המחשב וצג מסך המגע. בחר את המטרה 4X ולחץ על סמל התוכנה כדי להפעיל את התוכנה. מקם את השקופית על שלב המיקרוסקופ ומרכז את המדגם בתוך חלון המדידה כדי להבטיח שרשתות המדידה מוגדרות להגדלה המתאימה כדי להתאים למטרה בכך שגם משטח המשטחים הטיביאלי וגם עצם המשנה התת-גולגולתית נכללים באזורי התמונה המעניינים.לאחר מכן, תחת תפריט קובץ, בחר הגדרות קריאה. בחלון הגדרות, בחר את קובץ ההגדרות המתאים כדי למדוד את הפרמטרים. כדי למדוד את שטח הסחוס הכולל, בחר את הפונקציה TC TC טיב ולעקוב לאורך הקצה העליון של משטח הסחוס tibial שבו הסחוס פוגש את החלל המשותף ולאורך צומת כונדרו-osseous שבו סחוס הסתייד פוגש את עצם subchondral.כדי למדוד את אזור הסחוס המסויד, בחר את הפונקציה Tib CC ועקוב אחר קו לאורך סימן הגאות והשפל, קו המתרחש באופן טבעי המפריד בין אזורי הסחוס המסוידים והבלתי מחושבים, ולאורך הצומת כונדרו- osseous שבו הסחוס הסתייד פוגש את עצם subchondral. כדי לקבוע את אזור הסחוס הלא מחושב, הפחת את אזור הסחוס הסתיידות מאזור הסחוס הכולל. כדי לקבוע את מספר chondrocyte, ליצור פונקציות ספירה נפרדות בתוך ההגדרות בתוכנת היסטומורפיטריה כדי להבחין את מטריצה לייצר מטריצה שאינם מייצרים chondrocytes.לאחר מכן השתמש חרט לעשות נקודה קטנה על כל chondrocyte להביע את פנוטיפ שצוין כדי לקבוע את מספר מטריצה לייצר או לא לייצר chondrocytes. כדי למדוד את הפרמטר הכולל של משטח המחשוף הטיביאלי, עקוב אחר קו על פני השטח של הסחוס הטיביאלי כדי להגדיר בזהירות את פרפור בודדים. לאחר מכן צייר קו שני לאורך סימן הגאות כדי לשמש כבקרה פנימית עבור המישור של כל מקטע ולחלק את פרמטר פני השטח של הטיביאלי על ידי הפרמטר סימן הגאות כדי לחשב את מדד פרפור פני השטח של הטיביאלי.כדי למדוד את אזור מרחב מח העצם המשני, בחר את הפונקציה אזור מח עצם. ואז לצייר קווים סביב הפרמטר של אזורים אלה כדי לקבוע את השטח הכולל של שטח מח העצם בתוך עצם subchondral tibial. כדי למדוד את האזור התת-כולנדראלי הכולל, בחר את הפונקציה Subchondral Bone והתאר את האזור שבין צומת כונדרו-אוסאוס בגבול העליון של לוח הצמיחה המשתרע באופן הצדדי לאזורי האוסטיאופיטים האחוריים והמאחררים.לאחר מכן הפחת את אזור מרחב מח העצם התת-כולנדראלי מאזור התת-כולנדרל הכולל כדי לחשב את אזור העצם התת-כולדי. כדי למדוד את האזור osteophyte, בחר את הפונקציה אוסטאופיט לפני ולעקוב אחר osteophyte anterior של השוקה הפרוקסימלית. לאחר מכן בחרו אוסטאופיט אחורי ועקבו אחר האוסטיאופיט האחורי של השוקה הפרוקסימלית.כדי למדוד את עובי סינוביאלי הירך הקדמי, לחץ על קדמיור עצם הירך סינוביום מניסקוס ולצייר קו אחד מנקודת הכניסה הפנימית של הסינוביום הקדמי על עצם הירך לקראת נקודת ההתקשרות שלה על המניסקוס שורה אחת מן הכניסה החיצונית של הסינוביום על עצם הירך לקראת ההחזקה שלה מניסקוס. לאחר מכן לחלק את האזור הסינוביאלי הכולל על ידי הפרמטר סינוביאלי כדי לחשב את עובי סינוביאלי. DMM המושרה דלקת מפרקים ניוונית תוצאות מוגברת דלקת מפרקים ניוונית מחקר האגודה הבינלאומית בהשוואה עכברים מזויפים.מאופיין בבירור על ידי שחיקת פני השטח וסחוס לאיבוד. פרוטוקול היסטומורפיטריה זה יכול לשמש כדי לזהות מספר שינויים הקשורים דלקת מפרקים ניוונית כולל ירידה בסחוס הכולל אזורי סחוס לא מחושב. הפחתה במספר הכונדרוציטים הכולל וחשוב מכך, אובדן במספר המטריצה המייצרת כונדרוציטים.שינויים במשטח המשטחים, המעידים על חומרת הסחף, נצפים גם הם, כולל עלייה כוללת במדד פרפור. דלקת מפרקים ניוונית כוללת גם עלייה באזור העצם subchondral וירידה באזור של שטח מח העצם בעכברי DMM המציין טרשת עצם subchondral. הן האזורים הקדמיים והן אזורי האוסטיאופיט האחוריים גדלו גם בעכברי DMM, מה שמרמז על שיפוץ עצם תת-כולדי מתמשך המשמש כמנגנון פיצוי לטיפול בשינויים בהעמסת מפרקים באתר הפציעה.ניתוח היסטומורפי של הסינוביום מראה עלייה בעובי הסינוביאלי בעכברי DMM. תוצאה אופיינית של דלקת מפרקים ניוונית הקשורים דלקת סינוביאלית ואת דיפוזיה של ציטוקיני דלקתיים לתוך החלל המשותף. בנוסף, אין שונות בין משתמשים משמעותית בין הניתוח ההיסטומורפי של אזור הסחוס הלא מחושב בציון הבינלאומי של החברה הבינלאומית לחקר דלקת מפרקים ניוונית.לאחר ניתוח היסטומורפי, ניתן להשתמש בשקופיות רציפות וכתמי שפעת חיסונית כדי לבחון שינויים בביטוי החלבון בין דגימות.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

גישה ניתוחית חדשנית למנהל Intratracheal של סוכני יו במודל של עכברים עוברי

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

השתלה של וריד נבוב חציצת שתל נחותה בעכבר דגם

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

השתלה של הריאה Valve שימוש במודל עכבר של Heterotopic לב והשתלות

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

The Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis Pain in the Mouse

מודל Monoiodoacetate של אוסטיאוארתריטיס כאב העכבר

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

הגוף התחתון חיובי לחץ הליכון עבור שיקום אוסטיאוארתריטיס ברך

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

הערכה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Treating Knee Osteoarthritis with Tuina in a Rabbit Model

Tuina Intervention in Rabbit Model of Knee Osteoarthritis

Using a Rabbit Model to Explore the Efficacy of Tuina in Treating Knee Osteoarthritis (Video) | JoVE

התערבות טווינה במודל ארנב של דלקת מפרקים ניוונית בברך

Knee osteoarthritis (KOA) is mainly characterized by degenerative changes in the knee joint's cartilage and surrounding soft tissues. The efficacy of ...

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model (Video) | JoVE

הערכת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם טרבקולרית במודל עכבר אוסטאופורוזיס

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...