Name: standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model
Uploaded: 2020-05-06T13:00:00
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私たちは、ペンステートミルトンS.ハーシー医療センターの比較医学部門のスタッフと分子および組織病理学コアの支援を認めたいと思います。資金源:NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1(F.K.)、ANRF関節炎研究助成金(F.K.)。

12週齢の雄C57BL/6マウスはJax Labsから購入した。すべてのマウスは、12時間の明暗スケジュールの部屋で、マイクロアイソレーターケージあたり3〜5匹のマウスのグループに収容された。すべての動物の手順は、国立衛生研究所(NIH)実験動物のケアと使用のためのガイドに従って行われ、ペンシルベニア州立大学動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 心的?...

最近の変形性関節症研究は、関節内の異なる組織と、各組織が疾患開始または進行において果たす役割の間のクロストークの理解を高めている898、9、10、35、36。10,35,36,したがって、OAの評価は軟骨の分析に限定されるべきではなく、軟骨下骨および滑膜の分析も含める?...

米国で最も流行している関節障害の1つであるOAは、関節軟骨の進行性変性を特徴とし、主に股関節および膝関節において、患者の移動性および生活の質に大きな影響を及ぼす1,1、2、3。32関節軟骨は、摩擦を最小限に抑え、動きを容易にし、関節圧迫4に耐えるように設計された、ジ関節関節の特殊な結合組織である。関節軟骨は、軟骨細胞と細胞外マトリックスの2つの主要成分で構成されています。軟骨細胞は、細胞外マトリックス4の開発、維持、修復において主要な役割を果たす特殊な代謝活性細胞である。軟骨肥大(CH)は、OAの開発の主要な病理学的徴候の一つである。細胞サイズの増加、プロテオグリカン産生の減少、および最終的に軟骨変性55、6、76,7につながる軟骨マトリックス分解酵素の産生増加を特徴とする。また、関節の軟骨下骨および滑膜の病的変化は、OAの発達および進行898、9、10、11、1210,11において重要な役割を12果たす。,現在までに,、軟骨変性1、2、3、13、142,3,13を阻害する既存の治癒療法はありません。114したがって、OA病理を理解し、OAを遅くしたり停止したりすることができる新しい治療アプローチを発見することを目的とした広範な進行中の研究があります。したがって、関節の軟骨、滑膜、および軟骨下骨におけるOA関連の病理学的変化を正確に評価できる定量的かつ再現性のあるアプローチの必要性が高まっています。
現在、OAの重症度と進行は、主にOARSIまたはマンキンスコアリングシステム15を使用して評価される。しかし、これらのスコアリングシステムは半定量的なものであり、ユーザーの主観性の影響を受ける可能性があります。さらに重要なことは、疾患の間、または遺伝子操作または治療介入に応答して関節に起こる微妙な変化を正確に評価できないことである。軟骨、滑膜、または軟骨下骨,,16、17、18、19、20、2117の組織形態測定分析を記述する16文献には散発的な報告がある。19,20,2118しかし、これらの関節成分の厳密かつ再現性のある組織形態分析のための詳細なプロトコルはまだ欠けており、現場で満たされていないニーズを生み出しています。
組織形態測定解析を用いたOAの病理学的変化を研究するために、手術用OAマウスモデルを用いて、内側半月板(DMM)の不安定化を介してOAを誘導した。マウスOAの確立されたモデルの中で、 DMM は傷害の外傷性メカニズムを含むため、我々の研究のために選択されました22,,23,,24,,25, 26.,26半月靭帯損傷(MLI)または前十字靭帯損傷(ACLI)手術と比較して、DMMは、ヒト,22、24、25、26,24,におけるOAの発達と同様に、OAのより緩やかな進行を促進する。25マウスは、関節軟骨、軟骨下骨、および滑膜の変化を評価するためにDMM手術後12週間で安楽死させた。
このプロトコルの目的は、OA に伴う共同変更を評価するための、標準化された厳格で定量的なアプローチを確立することです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>For sample fixation following harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq 27QHD Creative Pen Display</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq Ergo stand</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC446080010</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>F7258</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For sample section collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoPrep Xylene</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>HC-700-1GAL</td>
			<td>For sample deparrafinization and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-182-701A</td>
			<td>For sample processing and embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Z440 Workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td>Product number: Y5C77US#ABA</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM 2235</td>
			<td>For sample sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801880</td>
			<td>For sample labeling, cassettes and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX53 Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS DP 73 Microscope Camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORION STAR A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoMeasure Software</td>
			<td>OsteoMetrics</td>
			<td>https://www.osteometrics.com/index.htm</td>
			<td>For histomorphometric measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model # 39471005</td>
			<td>For mouse knee harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM 7 Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Institutional Access Account</td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-O stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>S8884</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage</td>
			<td>Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)</td>
			<td>http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom Pro Pen Stylus</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029713</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029714</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model

米国で最も流行している関節疾患の1つである変形性関節症(OA)は、関節軟骨の進行性変性を特徴とし、主に股関節および膝関節において、患者の移動性および生活の質に大きな影響を及ぼす。現在までに、軟骨変性を遅くまたは阻害することができるOAのための既存の治癒療法はありません。現在、OA病理を理解し、OAを効率的に減速、停止、または逆転させることができる新しい治療アプローチまたは薬剤を発見するための広範な研究機関があります。したがって、関節軟骨、滑膜、軟骨下骨のOA関連の病理学的変化を正確に評価するために、定量的かつ再現可能なアプローチを持つことは非常に重要です。現在、OAの重症度と進行は、主に変形性関節症研究協会インターナショナル(OARSI)またはマンキンスコアリングシステムを使用して評価されています。これらのスコアリングシステムの重要性にもかかわらず、半定量的であり、ユーザーの主観性の影響を受ける可能性があります。さらに重要なことは、初期の疾患状態または早期治療段階における軟骨の微妙な、まだ重要な変化を正確に評価できないことである。ここで説明するプロトコルは、コンピュータ化された半自動化された組織形態測定ソフトウェアシステムを使用して、OAにおける関節変化の評価のための標準化された厳格で再現可能な定量的方法論を確立します。このプロトコルは既存のシステムに強力な付加を提示し、継手の病理学的変化のより効率的な検出を可能にする。

DMM誘導OAは関節軟骨変性と軟骨細胞損失をもたらす DMM誘導OAは、偽マウスと比較してOARSIスコアが増加し、表面浸食および軟骨損失によって明らかに特徴づけられた(図1A、D)。Dここで詳述したヒストモルホメトリープロトコルは、総軟骨面積の減少および非定量化軟骨領域(図1A、B、E、G)を含むいくつかのOA関連のB変化をE</str...

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Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

現在のプロトコルは変形性関節症に伴う形態学的関節変化の定量化のための厳密で再現可能な方法を確立する。このプロトコルの適用は、疾患の進行を監視し、変形性関節症における治療介入を評価する上で価値がある。

外科用マウスモデルにおける変形性関節症の標準化組織形態評価

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

当社のプロトコルは、変形性関節症の発症と進行における関節変化の定量的分析のための堅牢で再現可能な方法のアンメットニーズに対応しています。変形性関節症の複数関節組織の変化を定量的に分析するための具体的で再現可能なパラメータを概説します。変形性関節症の定量的分析を可能にする手法として、治療効果を評価するために複数の関節組織に対する特定の治療法の効果を比較することが可能である。私たちのプロトコルは、他の変形性関節症モデルや軟骨と骨の定量が必要な筋骨格研究の分野にも適用できます。システムは簡単で直感的ですが、再現性を達成するために繰り返し測定を行う練習にはトレーニングセッションが必要です。ヴェンガデシュプラブ・カルプパゴウンダー、私たちの研究室からの博士研究員は、今私たちの手順を実証します.まず、顕微鏡、カメラ、コンピュータ、およびタッチスクリーンモニタの電源を入れます。4Xの目的を選択し、ソフトウェアアイコンをクリックしてソフトウェアプログラムを起動します。顕微鏡ステージにスライドを置き、測定ウィンドウ内でサンプルを中央に配置し、脛骨および大腿骨関節骨の両方が対象の画像領域に含まれるという点で、測定グリッドが目的に合わせて適切な倍率に設定されるようにします。次に、[ファイル] メニューの [設定の読み取り] を選択します。[設定]ウィンドウで、測定するパラメータに適した設定ファイルを選択します。総軟骨領域を測定するには、Tib TC機能を選択し、軟骨が関節空間に接する脛骨軟骨表面の上端に沿って、石灰化軟骨が軟骨下骨と接する軟骨骨接合部に沿ってトレースします。石灰化軟骨領域を測定するために、Tib CC機能を選択し、潮マークに沿って線をトレースし、軟骨の石灰化および非カルシウム化領域を分離する天然の線、および石灰化軟骨が軟骨骨と満たす軟骨骨軟骨接合部に沿って。非カルシウム化軟骨領域を決定するには、合計軟骨面積から石灰化軟骨領域を差し引きます。軟骨細胞数を決定するには、組織病学ソフトウェアの設定内に別々のカウント関数を作成し、マトリックス産生と非産生軟骨細胞を区別する。次にスタイラスを使用して、指定した表現型を発現する軟骨細胞の上に小さなドットを作り、軟骨細胞を産生するマトリックスの数を決定します。脛骨関節面の総パラメータを測定するには、脛骨軟骨の表面を横切る線をトレースして、個々の細動を慎重に定義します。次に、潮マークに沿って2本目の線を引き、各セクションの平面の内部制御として機能し、脛骨関節面パラメータを潮位記号パラメータで割って脛骨関節面細動指数を計算します。軟骨下骨髄領域を測定するには、骨髄領域機能を選択します。次に、これらの領域のパラメータの周りに線を引き、脛骨下骨内の骨髄空間の総面積を決定します。軟骨下腔下腔の総面積を測定するには、軟骨下骨機能を選択し、前および後骨棘の領域に横方向に伸びる成長プレートの上縁部の軟骨骨接合間の領域を概説する。次に、全軟骨下領域から軟骨下骨髄領域を差し引き、軟骨下骨面積を計算する。骨棘領域を測定するには、前骨棘機能を選択し、近位脛骨の前骨棘を追跡する。次に、後骨棘を選択し、近位脛骨の後骨棘を追跡する。前大腿前滑膜の厚さを測定するには、前大腿骨滑膜メニスカスをクリックし、大腿骨の前滑膜の内側挿入点から半月板上の付着点に向かって1本、大腿骨のシノビウムの外側挿入から半月板への付着に向かって1本の線を引く。次に、滑膜領域全体を滑膜パラメータで割って、滑膜厚さを計算します。DMM誘発変形性関節症は、偽マウスと比較して変形性関節症研究協会国際スコアの増加をもたらす。表面侵食と軟骨の喪失によって明確に特徴付けられる。このヒストモルホメトリープロトコルは、総軟骨および非カルシウム化軟骨領域の減少を含むいくつかの変形性関節症関連の変化を検出するために使用することができる。全軟骨細胞数の減少と重要なのは、軟骨細胞を産生するマトリックスの数の損失である。関節表面への変化は、浸食の重症度を示し、線維化指数の全体的な増加を含む観察される。変形性関節症はまた、軟骨下骨領域の増加および軟骨下骨硬化症を示すDMMマウスにおける骨髄空間の減少を含む。DMMマウスでは前骨および後骨棘領域の両方が増加し、損傷部位における関節負荷の変化を処理する補償機構として機能する継続的な軟骨下骨リモデリングが示唆された。滑膜のヒストモルフォメトリクス分析は、DMMマウスにおける滑膜厚さの増加を示す。変形性関節症の典型的な結果は、関節の炎症および炎症性サイトカインの関節腔への拡散に関連した。また、変形性関節症研究会国際学界の非計算軟骨領域の組織形態学的解析との間に有意なユーザ間変動は認められない。ヒストモルフォメトリクス分析後、シーケンシャルスライドおよび免疫蛍光染色を使用して、サンプル間のタンパク質発現の変化を調べることができます。

Research

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Medicine

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