Name: standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model
Uploaded: 2020-05-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

우리는 비교 의학 직원의 부 및 펜 스테이트 밀튼 S. 허쉬 메디컬 센터에서 분자 및 조직 병리학 코어의 지원을 인정하고 싶습니다. 자금 출처: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF 관절염 연구 보조금 (F.K.).

12 주 된 남성 C57BL/6 쥐 잭스 연구소에서 구입 했다. 모든 마우스는 12시간 의 밝은/어두운 스케줄을 가진 방에 있는 마이크로 이솔레이터 케이지 당 3-5 마우스의 단으로 수용되었다. 모든 동물 절차는 국립 보건원 (NIH) 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었으며 펜실베니아 주립 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 외상 후 골관?...

최근 골관절염 연구는 관절 내의 다른 조직과 각 조직이 질병 개시 또는 진행에서 수행하는 역할 사이의 크로스토크에 대한 우리의 이해를 향상시켰으며88, 9,9,10,,35,,36. 따라서, OA의 평가는 연골의 분석에 국한되어서는 안되지만 또한 연골 뼈와 수축기의 분석을 포함해야한?...

미국에서 가장 널리 퍼진 관절 질환 중 하나인 OA는 주로 엉덩이와 무릎 관절에서 관절 연골의 점진적 변성을 특징으로 하며, 이는 환자의 이동성 및 삶의질에중대한 영향을 미치며1,2,,3. 관절 연골은 마찰을 최소화하고, 운동을 용이하게하고, 관절 압축을 견딜 수 있도록 설계된 이단 관절의 특수 결합조직입니다 4. 관절 연골은 두 가지 주요 구성 요소로 구성되어 있습니다 : 연골 세포와 세포 외 매트릭스. 연골세포는 세포외 기매트릭스의 개발, 유지 및 수리에 1차적인 역할을4하는 전문화된 대사 활성 세포이다. 연골 세포 비대 (CH)는 OA 발달의 주요 병리학 적 징후 중 하나입니다. 그것은 증가 세포 크기, 감소 프로테오글리칸 생산, 결국 연골 변성으로 이어질 연골 매트릭스 분해 효소의 증가 생산을 특징으로5,,6,,7. 또한, 관절의 상골골과 경막의 병리학적 변화는 OA 발달 및진행에중요한 역할을 한다8,9,10,,11,,12.9 현재까지 연골 변성을 억제하는 기존 치료법은 없습니다1,2,23,,13,,14.3 따라서, OA 병리학을 이해하고 OA를 감속하거나 중지 할 수있는 새로운 치료 접근법을 발견하는 것을 목표로 하는 광범위한 지속적인 연구가 있습니다. 따라서, 관절의 연골, 수축기 및 아초골 골에서 OA 관련 병리학적 변화를 정확하게 평가할 수 있는 정량적 및 재현가능한 접근법에 대한 필요성이 증가하고 있다.
현재, OA 심각도 및 진행은 주로 OARSI 또는 Mankin 채점시스템(15)을사용하여 평가된다. 그러나 이러한 채점 시스템은 반정적일 뿐이며 사용자 주관성에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 더 중요한 것은, 그(것)들은 정확하게 질병 도중 또는 유전 조작 또는 치료 내정간섭에 응하여 합동에서 생기는 미묘한 변경을 평가하지 못합니다. 연골, 연골 또는 골격16,,17,,18,,19,,20,,21의조직 체형 분석을 설명하는 문헌에 산발적 인 보고서가 있습니다. 그러나 이러한 모든 관절 구성 요소의 엄격하고 재현 가능한 조직 체형 분석을 위한 상세한 프로토콜은 여전히 부족하여 현장에서 충족되지 않은 필요성을 야기합니다.
조직 형 분석을 사용하여 OA의 병리학 적 변화를 연구하기 위해, 우리는 내측 반월 상 연골 (DMM)의 불안정화를 통해 OA를 유도하기 위해 수술 OA 마우스 모델을 사용했다. murine OA의 확립 된 모델 중, DMM은 부상22,,23,,24,,25,,26의덜 외상성 메커니즘을 수반하기 때문에 우리의 연구를 위해 선택되었다. 반월 상 연골 인대 부상 (MLI) 또는 전방 십자 인대 부상 (ACLI) 수술에 비해, DMM은인간22,,24,,25,,26에서OA 발달과 유사한 OA의 보다 점진적인 진행을 촉진한다. 마우스는 관절 연골, 골격 및 경막의 변화를 평가하기 위해 DMM 수술 후 12주 동안 안락사시켰다.
이 프로토콜의 목표는 OA와 함께 제공되는 공동 변화를 평가하기 위해 표준화되고 엄격하며 정량적인 접근 방식을 수립하는 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>For sample fixation following harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq 27QHD Creative Pen Display</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq Ergo stand</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC446080010</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>F7258</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For sample section collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoPrep Xylene</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>HC-700-1GAL</td>
			<td>For sample deparrafinization and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-182-701A</td>
			<td>For sample processing and embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Z440 Workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td>Product number: Y5C77US#ABA</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM 2235</td>
			<td>For sample sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801880</td>
			<td>For sample labeling, cassettes and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX53 Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS DP 73 Microscope Camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORION STAR A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoMeasure Software</td>
			<td>OsteoMetrics</td>
			<td>https://www.osteometrics.com/index.htm</td>
			<td>For histomorphometric measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model # 39471005</td>
			<td>For mouse knee harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM 7 Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Institutional Access Account</td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-O stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>S8884</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage</td>
			<td>Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)</td>
			<td>http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom Pro Pen Stylus</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029713</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029714</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model

미국에서 가장 널리 퍼진 관절 질환 중 하나, 골관절염 (OA) 관절 연골의 점진적 변성을 특징으로, 주로 엉덩이와 무릎 관절에, 이는 환자의 이동성과 삶의 질에 중요한 영향을 초래. 현재까지, 연골 변성을 늦추거나 억제 할 수있는 OA에 대한 기존의 치료 요법이 없습니다. 현재, OA 병리학을 이해하고 효율적으로 감속, 중지 또는 OA를 역전시킬 수 있는 새로운 치료 접근법 또는 에이전트를 발견하기 위한 광범위한 연구가 진행되고 있습니다. 따라서, 관절 연골, 수축기 및 골격 뼈에서 OA 관련 병리학 적 변화를 정확하게 평가하기 위해 정량적이고 재현 가능한 접근 법을 가지고하는 것이 중요합니다. 현재, OA 심각도 및 진행은 주로 골관절염 연구 학회 국제 (OARSI) 또는 만킨 채점 시스템을 사용하여 평가된다. 이러한 채점 시스템의 중요성에도 불구하고, 그들은 반정적이며 사용자 주관성에 의해 영향을받을 수 있습니다. 더 중요한 것은, 그들은 정확하게 초기 질병 상태 또는 초기 치료 단계 동안 연골의 미묘한, 아직 중요한 변화를 평가하는 데 실패. 여기서 설명하는 프로토콜은 전산화되고 반자동화된 조직체형 소프트웨어 시스템을 사용하여 OA의 공동 변경 평가를 위한 표준화되고 엄격하며 재현 가능한 정량적 방법론을 수립합니다. 이 프로토콜은 기존 시스템에 강력한 추가를 제시하고 관절의 병리학 적 변화를 보다 효율적으로 감지 할 수 있습니다.

DMM 유도 OA 는 관절 연골 변성 및 연골 세포 손실의 결과 DMM-유도 OA는 샴 마우스에 비해 OARSI 점수가 증가하여, 표면 침식 및 연골 손실을 뚜렷하게 특징으로하였다(도 1A,D). 여기에 상세한 히스토모퍼홈트리 프로토콜은 총 연골 영역과 비석연골 영역의 감소를 포함하여 여러 OA 관련 변화를 검출했다(도1A,B,E,...

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Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

현재 프로토콜은 골관절염을 동반하는 형태학적 관절 변화를 정량화하기 위한 엄격하고 재현 가능한 방법을 확립합니다. 이 프로토콜의 적용은 질병 진행을 모니터링하고 골관절염의 치료 적 개입을 평가하는 데 유용 할 수 있습니다.

외과 마우스 모형에 있는 골관절염의 표준화한 조직 형측정 평가

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

우리의 프로토콜은 골관절염 발달 및 진행에 있는 합동 변경의 정량적 분석을 위한 강력하고 재현가능한 방법에 대한 충족되지 않은 필요를 해결합니다. 우리의 기술은 골관절염에 있는 다중 합동 조직의 변경의 정량분석에 대한 구체적이고 재현 가능한 매개 변수를 간략하게 설명합니다. 이 기술은 골관절염의 정량적 분석을 허용하므로, 그들의 치료 효능을 평가하기 위해 여러 관절 조직에 대한 특정 치료의 효과를 비교하는 데 사용할 수 있습니다.우리의 프로토콜은 또한 다른 골관절염 모형 또는 연골과 뼈의 정량화가 필요한 근골격계 연구의 지역에 적용될 수 있습니다. 시스템은 간단하고 직관적이지만 재현성을 달성하기 위해 반복적인 방식으로 측정을 얻는 연습을 연습하기 위해 교육 세션이 여전히 필요합니다. 방가데스프라부 카루파고언더, 우리의 실험실에서 박사 후 학자는 이제 우리의 절차를 시연 할 것입니다.현미경, 카메라, 컴퓨터 및 터치 스크린 모니터를 켜는 것으로 시작합니다. 4X 목표를 선택하고 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 소프트웨어 프로그램을 시작합니다. 현미경 단계에 슬라이드를 배치하고 측정 그리드가 정골 및 대퇴 관절 표면과 티볼 서브콘드리아 뼈가 모두 관심의 이미지 영역 내에 포함된다는 점에서 목표에 맞게 적절한 배율로 설정되어 있는지 확인측정 창 내의 샘플을 중심으로 한다.그런 다음 파일 메뉴에서 읽기 설정을 선택합니다. 설정 창에서 측정할 매개 변수에 대한 적절한 설정 파일을 선택합니다. 총 연골 영역을 측정하려면 Tib TC 기능을 선택하고 연골이 관절 공간과 만나는 티브 연골 표면의 우수한 가장자리를 따라 추적하고 석회화 된 연골이 연골뼈와 만나는 연골 - osseous 접합을 따라 추적하십시오.석회화연골 영역을 측정하기 위해 Tib CC 기능을 선택하고 조수 마크를 따라 선을 추적하며, 연골의 석회화 및 미석화 영역을 분리하는 자연발생선이 있으며, 석회화된 연골이 하부촌 골과 만나는 콘드로-오스수우스 접합을 따라 한다. 비석화된 연골 영역을 결정하기 위해 석회화된 연골 영역을 전체 연골 영역에서 빼는다. 연골세포 수를 결정하려면, 히스토모홈트리 소프트웨어의 설정 내에서 별도의 카운트 함수를 만들어 매트릭스 생성 및 매트릭스비 생산 연골세포를 구별한다.그런 다음 스타일러스를 사용하여 지정된 표현형을 표현하는 각 연골 세포 위에 작은 점을 만들어 연골구를 생산하거나 생산하지 않는 매트릭스의 수를 결정한다. 총 티비알 관절 표면 매개변수를 측정하려면 정골 연골 표면을 가로질러 선을 추적하여 개별 세동을 신중하게 정의합니다. 그런 다음 조수 표시를 따라 두 번째 선을 그려 각 섹션의 평면에 대한 내부 제어 역할을 하고 조수 표시 매개변수에 의해 양면 관절 표면 매개변수를 분할하여 양면 관절 표면 세동 인덱스를 계산합니다.서브콘드리아 골수 공간 영역을 측정하려면 골수 영역 기능을 선택합니다. 그런 다음 이러한 영역의 매개 변수 주위에 선을 그려 서 골수 공간의 총 면적을 결정하고 정골 부전 골본 내의 골수 공간. 총 아전드랄 영역을 측정하기 위해, 서브콘드리아 뼈 기능을 선택하고 전방 및 후방 골체의 영역으로 측면으로 확장성장판의 우수한 경계에서 연골-오스수우스 접합 사이의 영역을 윤곽을 형성한다.그런 다음 총 부전드랄 영역에서 지하 골수 공간 영역을 빼서 부전골 영역을 계산한다. 골피질 영역을 측정하려면 전방 골체 기능을 선택하고 근접 경골의 전방 골체를 추적합니다. 그런 다음 후방 골체를 선택하고 근위 경골의 후방 골체를 추적합니다.전방 대퇴 대퇴 경연 두께를 측정하려면, 전방 페무르 시노비움 반유동을 클릭하고 반월 상 연골에 부착 포인트와 메수에 대한 부착 지점으로 대퇴골 시노비움의 내부 삽입 지점에서 한 줄을 그립니다. 그런 다음 총 연면적을 막연한 파라미터로 나누어 연면적두께를 계산한다. DMM 유도 골관절염은 샴 마우스에 비해 증가 된 골관절염 연구 학회 국제 점수결과.표면 침식과 연골이 손실되는 것을 특징으로 합니다. 이 히스토모폰트리 프로토콜은 전체 연골 및 미균 연골 부위의 감소를 포함하여 여러 골관절염 관련 변화를 검출하는 데 사용될 수 있다. 총 연골세포 수의 감소와 중요한 것은, 연골세포를 생산하는 매트릭스의 수의 손실.침식의 심각성을 나타내는 관절 표면에 대한 변화도 세동 지수의 전반적인 증가를 포함하여 관찰된다. 골관절염은 또한 부전건조골 영역의 증가와 부전골 골경화증을 나타내는 DMM 마우스의 골수 공간의 면적감소를 포함한다. 전방 및 후방 골육영역은 DMM 마우스에서도 증가하여 부상 부위의 관절 하중 변화를 처리하기 위한 보상 메커니즘역할을 하는 지속적인 아콘드리아 뼈 리모델링을 제안합니다.synovium의 히스토모폰 분석은 DMM 마우스의 연액 두께의 증가를 나타낸다. 관절염의 전형적인 결과 관련 된 혈 안 염증 및 관절 공간에 염증 성 사이토 카인의 확산. 또한, 골관절염 연구학회 국제점수에서 유정화된 연골 부위의 조직형태 분석 사이에 유의한 사용자 간 가변성이 관찰되지 않는다.조직학적 분석 후 순차적 슬라이드 및 면역 형광 염색을 사용하여 샘플 간의 단백질 발현의 변화를 검사할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

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연구

의학

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