Name: standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model
Uploaded: 2020-05-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

Vi vil gjerne anerkjenne hjelp fra Department of Comparative Medicine ansatte og Molecular og Histopathology kjernen på Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Finansieringskilder: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).

Tolv uker gamle hannC57BL/6 mus ble kjøpt fra Jax Labs. Alle musene ble plassert i grupper på 3-5 mus per mikroisolatorbur i et rom med en 12 timers lys / mørk tidsplan. Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til National Institute of Health (NIH) Guide for care and use of Laboratory Animals og godkjent av Animal Care and Use Committee of Pennsylvania State University.
1. Posttraumatisk slitasjegikt (PTOA) kirurgisk modell
<ol><li>Bedøve mus ved hjelp av en ketamin (100 mg/kg...

Nyere slitasjegikt forskning har forbedret vår forståelse av crosstalk mellom de ulike vev ene i leddet og rollen hvert vev spiller i sykdom initiering eller progresjon8,9,10,35,36. Følgelig har det blitt åpenbart at vurderingen av OA ikke bør begrenses til analyse av brusk, men bør også inkludere analyse av subkondralbenet og synovium. Til tross for de...

En av de mest utbredte leddforstyrrelser i USA, OA er preget av progressiv degenerasjon av leddbrusk, primært i hofte- og kneledd, noe som resulterer i betydelige konsekvenser for pasientens mobilitet og livskvalitet1,2,3. Leddbrusk er spesialisert bindevev av diartropdiale ledd designet for å minimere friksjon, lette bevegelse og tåle felles kompresjon4. Leddbrusk består av to primære komponenter: kondrocytter og ekstracellulær matrise. Chondrocytes er spesialiserte, metabolsk aktive celler som spiller en primær rolle i utvikling, vedlikehold og reparasjon av den ekstracellulære matrisen4. Chondrocyte hypertrofi (CH) er en av de viktigste patologiske tegn på OA utvikling. Det er preget av økt cellulær størrelse, redusert proteoglykanproduksjon, og økt produksjon av brusk matrise-nedverdigende enzymer som til slutt fører til brusk degenerasjon5,6,7. Videre patologiske forandringer i subkondralbenet og synovium av leddet spiller en viktig rolle i OA utvikling og progresjon8,9,10,11,12. Til dags dato er det ingen eksisterende kurative terapier som hemmer bruskdegenerasjon1,2,3,13,14. Dermed er det omfattende pågående forskning som tar sikte på å forstå OA patologi og oppdage nye terapeutiske tilnærminger som er i stand til å bremse eller til og med stoppe OA. Følgelig er det et økende behov for en kvantitativ og reproduserbar tilnærming som muliggjør nøyaktig evaluering av OA-tilknyttede patologiske forandringer i brusk, synovium og subkondralbein i leddet.
For tiden vurderes OA-alvorlighetsgrad og progresjon primært ved hjelp av OARSI- eller Mankin-poengsystemer15. Disse scoringssystemene er imidlertid bare semikvantitative og kan påvirkes av brukersubjektivitet. Enda viktigere, de unnlater å nøyaktig vurdere subtile endringer som oppstår i leddet under sykdom eller som svar på genetisk manipulasjon eller en terapeutisk intervensjon. Det er sporadiske rapporter i litteraturen som beskriver histomorfoometriske analyser av brusk, synovium, eller subchondral bein16,17,18,19,20,21. Imidlertid mangler en detaljert protokoll for streng og reproduserbar histomorfoometrisk analyse av alle disse felleskomponentene fortsatt, noe som skaper et udekket behov i feltet.
For å studere patologiske forandringer i OA ved hjelp av histomorfoometrisk analyse, brukte vi en kirurgisk OA-musemodell til å indusere OA via destabilisering av medial menisken (DMM). Blant de etablerte modellene av murine OA ble DMM valgt for vår studie fordi det innebærer en mindre traumatisk mekanisme for skade22,23,24,25,26. Sammenlignet med menisk-ligamentskade (MLI) eller fremre korsbåndskade (ACLI) operasjoner, fremmer DMM en mer gradvis progresjon av OA, lik OA-utvikling hos mennesker22,24,25,26. Mus ble euthanized tolv uker etter DMM kirurgi for å evaluere endringer i leddbrusk, subchondral bein, og synovium.
Målet med denne protokollen er å etablere en standardisert, streng og kvantitativ tilnærming til å evaluere felles endringer som følger med OA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>For sample fixation following harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq 27QHD Creative Pen Display</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq Ergo stand</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC446080010</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>F7258</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For sample section collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoPrep Xylene</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>HC-700-1GAL</td>
			<td>For sample deparrafinization and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-182-701A</td>
			<td>For sample processing and embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Z440 Workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td>Product number: Y5C77US#ABA</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM 2235</td>
			<td>For sample sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801880</td>
			<td>For sample labeling, cassettes and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX53 Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS DP 73 Microscope Camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORION STAR A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoMeasure Software</td>
			<td>OsteoMetrics</td>
			<td>https://www.osteometrics.com/index.htm</td>
			<td>For histomorphometric measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model # 39471005</td>
			<td>For mouse knee harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM 7 Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Institutional Access Account</td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-O stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>S8884</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage</td>
			<td>Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)</td>
			<td>http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom Pro Pen Stylus</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029713</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029714</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model

En av de mest utbredte leddforstyrrelsene i USA, slitasjegikt (OA) er preget av progressiv degenerasjon av leddbrusk, hovedsakelig i hofte- og kneleddene, noe som resulterer i betydelige konsekvenser for pasientens mobilitet og livskvalitet. Til dags dato er det ingen eksisterende kurative terapier for OA i stand til å bremse eller hemme bruskdegenerasjon. For tiden er det en omfattende mengde pågående forskning for å forstå OA-patologi og oppdage nye terapeutiske tilnærminger eller agenter som effektivt kan bremse ned, stoppe eller til og med reversere OA. Dermed er det avgjørende å ha en kvantitativ og reproduserbar tilnærming for å nøyaktig evaluere OA-tilknyttede patologiske forandringer i leddbrusk, synovium og subkondral bein. For tiden vurderes OA-alvorlighetsgrad og progresjon primært ved hjelp av Osteoarthritis Research Society International (OARSI) eller Mankin-scoringssystemer. Til tross for viktigheten av disse scoringssystemene, er de semikvantitative og kan påvirkes av brukersubjektivitet. Enda viktigere, de unnlater å nøyaktig vurdere subtile, men viktige, endringer i brusk under de tidlige sykdomstilstander eller tidlige behandlingsfaser. Protokollen vi beskriver her bruker et datastyrt og halvautomatisk histomorfoometrisk programvaresystem for å etablere en standardisert, streng og reproduserbar kvantitativ metodikk for evaluering av fellesendringer i OA. Denne protokollen presenterer et kraftig tillegg til de eksisterende systemene og gir mer effektiv påvisning av patologiske forandringer i leddet.

DMM-indusert OA resulterer i leddbruskdegenerasjon og konnodrocyte tap DMM-indusert OA resulterte i økt OARSI-score sammenlignet med shammus, tydelig preget av overflateerosjon og brusktap (figur 1A,D). Den histomorfotoriskprotokollen som er beskrevet her oppdaget flere OA-tilknyttede endringer, inkludert en reduksjon i totalt bruskområde og i det uforkalkede bruskområdet (Figur 1A,B,E,<st...

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Den nåværende protokollen etablerer en streng og reproduserbar metode for kvantifisering av morfologiske leddendringer som følger med slitasjegikt. Anvendelse av denne protokollen kan være verdifull i overvåking av sykdomsprogresjon og evaluering av terapeutiske inngrep i slitasjegikt.

Standardisert histomorfoometrisk evaluering av slitasjegikt i en kirurgisk musemodell

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Vår protokoll tar for seg et udekket behov for en robust og reproduserbar metode for kvantitativ analyse av leddendringer i slitasjegiktutvikling og progresjon. Vår teknikk skisserer spesifikke og reproduserbare parametere for kvantitativ analyse av endringer i flere leddvev i slitasjegikt. Da denne teknikken tillater kvantitativ analyse av slitasjegikt, kan det brukes til å sammenligne effekten av spesifikke behandlinger på flere leddvev for å evaluere deres terapeutiske effekt.Vår protokoll kan også brukes på andre slitasjegiktmodeller eller områder av muskel-skjelettforskning der kvantifisering av brusk og bein er nødvendig. Selv om systemet er enkelt og intuitivt, er treningsøkter fortsatt nødvendig for å øve på å oppnå målinger på en gjentatt måte for å oppnå reproduserbarhet. Vengadeshprabhu Karuppagounder, en postdoktor fra laboratoriet vårt, vil nå demonstrere vår prosedyre.Begynn med å slå på mikroskopet, kameraet, datamaskinen og berøringsskjermen. Velg 4X-målet, og klikk på programvareikonet for å starte programmet. Plasser lysbildet på mikroskopstadiet og sentrer prøven i målevinduet, slik at målerutenettet er satt til riktig forstørrelse for å matche målet ved at både tibial og lårartikulær overflate og tibial subkondralben er inkludert i bildeområdene av interesse.Velg deretter Leseinnstillinger under Fil-menyen. I Vinduet Innstillinger velger du riktig innstillingsfil for parameterne som skal måles. For å måle det totale bruskområdet velger du Tib TC-funksjonen og sporer langs den overlegne kanten av tibialbruskoverflaten der brusk møter fellesrommet og langs det kondro-osseous krysset der forkalket brusk møter subkondralbenet.For å måle det forkalkede bruskområdet velger du Tib CC-funksjonen og sporer en linje langs tidevannsmerket, en naturlig forekommende linje som skiller de forkalkede og uberegnede områdene av brusk, og langs kondro-osseous krysset der den forkalkede brusk møter subkondralbenet. Hvis du vil bestemme det ikke-beregnede bruskområdet, trekker du det forkalkde bruskområdet fra det totale bruskområdet. For å bestemme kondrocyttnummeret, opprett separate tellefunksjoner i innstillingene i histomorphometry-programvaren for å skille matrisen som produserer og matriserer ikke-produserende kondrocytter.Bruk deretter pekepennen til å lage en liten prikk over hver kondrocytt som uttrykker den angitte fenotypen for å bestemme antall matriseproduserende eller ikke produsere kondrocytter. For å måle den totale tibiale leddflateparameteren, spor en linje over overflaten av tibialbrusk for å nøye definere de enkelte flimmer. Deretter tegner du en annen linje langs tidevannsmerket for å fungere som en intern kontroll for planet av hver seksjon og dele tibial leddflateparameteren med tidevannsmerkeparameteren for å beregne tibial leddflateflimmerindeks.Hvis du vil måle området for underkondralmargsplass, velger du Margområde-funksjonen. Trekk deretter linjer rundt parameteren til disse områdene for å bestemme det totale arealet av benmargsplass i tibial subkondralbenet. For å måle det totale subkondralområdet, velg Subchondral Bone-funksjonen og skissere regionen mellom kondro-osseous-krysset i den overlegne grensen av vekstplate som strekker seg sidelengs til regionene i fremre og bakre osteofytter.Trekk deretter subchondral benmargsplassområdet fra det totale subkondralområdet for å beregne subchondralbenområdet. For å måle osteofyttområdet, velg den fremre osteofyttfunksjonen og spor fremre osteofytt av proksimal tibia. Velg deretter bakre osteofytt og spor den bakre osteofytten av proksimal tibia.Hvis du vil måle den fremre lårsynovialtykkelsen, klikker du Fremre Femur Synovium Meniscus og tegner en linje fra det indre innsettingspunktet til det fremre synoviumet på lårbenet mot menisken. Del deretter det totale synovialområdet med synovialparameteren for å beregne synovialtykkelsen. DMM indusert slitasjegikt resulterer i en økt slitasjegikt Research Society International score sammenlignet med sham mus.Tydelig preget av overflateerosjon og brusk tapt. Denne histomorphometry protokollen kan brukes til å oppdage flere slitasjegikt tilknyttede endringer inkludert en reduksjon i den totale brusk og uberegnet brusk områder. En reduksjon i det totale kondrocyttnummeret og viktigst, et tap i antall matriseproduserende kondrocytter.Endringer i leddoverflaten, som indikerer alvorlighetsgraden av erosjon, observeres også, inkludert en generell økning i flimmerindeksen. Artrose inkluderer også en økning i subkondralbenområdet og en reduksjon i benmargsområdet i DMM-mus som indikerer subkondral bensklerose. Både de fremre og bakre osteofyttområdene økte også i DMM-mus, noe som tyder på en pågående subkondral benombygging som fungerer som en kompenserende mekanisme for å håndtere endringer i leddbelastning på skadestedet.Histomorphometrisk analyse av synovium viser en økning i synovial tykkelsen i DMM mus. Et typisk utfall av slitasjegikt assosiert synovial betennelse og diffusjon av inflammatoriske cytokiner inn i fellesrommet. I tillegg observeres ingen signifikant inter-brukervariabilitet mellom histomorphometrisk analyse av det uberegnede bruskområdet i Osteoarthritis Research Society International score.Etter histomorphometrisk analyse kan sekvensielle lysbilder og immunofluorescence farging brukes til å undersøke endringer i proteinuttrykk mellom prøver.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Implantasjon av vena cava inferior inter Graft i Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Transplantasjon av Pulmonary Valve Bruke en mus modell av Heterotop hjertetransplantasjon

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

The Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis Pain in the Mouse

Den Monoiodoacetate modell av Artrose Smerter i Mus

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk Contractility måling av musen hvem arterien bruker Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

Den nedre kroppen positivt trykk tredemølle for kneet slitasjegikt rehabilitering

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Evaluering av leverglukoseproduksjon i en musmodell av polycystisk eggstokksyndrom

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

Retinal patofysiologisk evaluering i en rottemodell

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Treating Knee Osteoarthritis with Tuina in a Rabbit Model

Tuina Intervention in Rabbit Model of Knee Osteoarthritis

Using a Rabbit Model to Explore the Efficacy of Tuina in Treating Knee Osteoarthritis (Video) | JoVE

Tuina-intervensjon i kaninmodell av knet artrose

Knee osteoarthritis (KOA) is mainly characterized by degenerative changes in the knee joint's cartilage and surrounding soft tissues. The efficacy of ...

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model (Video) | JoVE

Evaluering av trabekulær benmikroarkitektur i en osteoporosemusemodell

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...