Name: standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model
Uploaded: 2020-05-06T13:00:00
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Gostaríamos de reconhecer a assistência da equipe do Departamento de Medicina Comparada e do núcleo molecular e histopatológico do Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Fontes de financiamento: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).

Os ratos C57BL/6 de 12 semanas foram comprados da Jax Labs. Todos os ratos foram alojados em grupos de 3-5 ratos por gaiola micro-isolador em uma sala com um cronograma de luz/escuro de 12 horas. Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com o Guia do Instituto Nacional de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso animal da Universidade Estadual da Pensilvânia.
1. Modelo cirúrgico de osteoartrite pós-trau...

Pesquisas recentes de osteoartrite melhoraram nossa compreensão do crosstalk entre os diferentes tecidos dentro da articulação e o papel que cada tecido desempenha na iniciação ou progressão da doença8,9,10,35,36. Assim, tornou-se óbvio que a avaliação da OA não deve se limitar à análise da cartilagem, mas também deve incluir a análise do osso s...

Uma das doenças articulares mais prevalentes nos Estados Unidos, a OA é caracterizada pela degeneração progressiva da cartilagem articular, principalmente nas articulações do quadril e do joelho, o que resulta em impactos significativos na mobilidade do paciente e na qualidade de vida1,2,3. Cartilagem articular é o tecido conjuntivo especializado das articulações diartrodiais projetadas para minimizar o atrito, facilitar o movimento e suportar a compressão articular4. A cartilagem articular é composta por dois componentes primários: condrócitos e matriz extracelular. Os condrócitos são células especializadas e metabolicamente ativas que desempenham um papel primordial no desenvolvimento, manutenção e reparo da matriz extracelular4. A hipertrofia condrócito (CH) é um dos principais sinais patológicos do desenvolvimento da OA. Caracteriza-se pelo aumento do tamanho celular, diminuição da produção de proteoglicano e aumento da produção de enzimas degradantes da matriz de cartilagem que eventualmente levam à degeneração da cartilagem5,6,7. Além disso, alterações patológicas no osso subcondral e no sinóvio da articulação desempenham um papel importante no desenvolvimento e progressão da OA8,,9,10,11,12. Até o momento, não existem terapias curativas existentes que inibam a degeneração da cartilagem1,2,3,13,14. Assim, há extensas pesquisas em andamento que visam compreender a patologia da OA e descobrir novas abordagens terapêuticas que são capazes de retardar ou até mesmo parar o OA. Assim, há uma necessidade crescente de uma abordagem quantitativa e reprodutível que permita uma avaliação precisa das alterações patológicas associadas à OA na cartilagem, sinóvio e osso subcondral da articulação.
Atualmente, a gravidade e a progressão do OA são avaliadas principalmente usando os sistemas de pontuação OARSI ou Mankin15. No entanto, esses sistemas de pontuação são apenas semiquantitativos e podem ser influenciados pela subjetividade do usuário. Mais importante, eles não conseguem avaliar com precisão mudanças sutis que ocorrem na articulação durante a doença ou em resposta à manipulação genética ou a uma intervenção terapêutica. Há relatos esporádicos na literatura descrevendo análises histomorfométricas da cartilagem, sinóvio ou osso subcondral16,,17,,18,,19,,20,21. No entanto, ainda falta um protocolo detalhado para análise histomorfométrica rigorosa e reprodutível de todos esses componentes articulares, criando uma necessidade não atendida no campo.
Para estudar alterações patológicas na OA usando análise histomorfométrica, utilizou-se um modelo cirúrgico de rato oa para induzir OA através da desestabilização do menisco medial (DMM). Entre os modelos estabelecidos de Murine OA, a DMM foi selecionada para o nosso estudo por envolver um mecanismo menos traumático de lesão22,,23,24,25,26. Em comparação com as cirurgias de lesão meniscal-ligamento (MLI) ou lesão do ligamento cruzado anterior (ACLI), a DMM promove uma progressão mais gradual da OA, semelhante ao desenvolvimento de OA em humanos22,24,25,26. Os camundongos foram eutanizados doze semanas após a cirurgia de DMM para avaliar alterações na cartilagem articular, osso subcondral e sinóvio.
O objetivo deste protocolo é estabelecer uma abordagem padronizada, rigorosa e quantitativa para avaliar as mudanças conjuntas que acompanham a OA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>For sample fixation following harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq 27QHD Creative Pen Display</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq Ergo stand</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC446080010</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>F7258</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For sample section collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoPrep Xylene</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>HC-700-1GAL</td>
			<td>For sample deparrafinization and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-182-701A</td>
			<td>For sample processing and embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Z440 Workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td>Product number: Y5C77US#ABA</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM 2235</td>
			<td>For sample sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801880</td>
			<td>For sample labeling, cassettes and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX53 Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS DP 73 Microscope Camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORION STAR A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoMeasure Software</td>
			<td>OsteoMetrics</td>
			<td>https://www.osteometrics.com/index.htm</td>
			<td>For histomorphometric measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model # 39471005</td>
			<td>For mouse knee harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM 7 Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Institutional Access Account</td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-O stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>S8884</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage</td>
			<td>Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)</td>
			<td>http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom Pro Pen Stylus</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029713</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029714</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model

Uma das doenças articulares mais prevalentes nos Estados Unidos, a osteoartrite (OA) é caracterizada pela degeneração progressiva da cartilagem articular, principalmente nas articulações do quadril e do joelho, o que resulta em impactos significativos na mobilidade e qualidade de vida do paciente. Até o momento, não existem terapias curativas existentes para OA capazes de retardar ou inibir a degeneração da cartilagem. Atualmente, há um extenso corpo de pesquisas em andamento para entender a patologia da OA e descobrir novas abordagens terapêuticas ou agentes que podem reduzir eficientemente, parar ou até mesmo reverter o OA. Assim, é fundamental ter uma abordagem quantitativa e reprodutível para avaliar com precisão as alterações patológicas associadas à OA na cartilagem articular, no sinóvio e no osso subcondral. Atualmente, a gravidade e a progressão da OA são avaliadas principalmente usando os sistemas de pontuação Da Osteoarthritis Research Society International (OARSI) ou Mankin. Apesar da importância desses sistemas de pontuação, eles são semiquantitativos e podem ser influenciados pela subjetividade do usuário. Mais importante, não conseguem avaliar com precisão mudanças sutis, mas importantes, na cartilagem durante os estados precoces da doença ou fases de tratamento precoce. O protocolo que descrevemos aqui usa um sistema de software histomorfométrico computadorizado e semi-automatizado para estabelecer uma metodologia quantitativa padronizada, rigorosa e reprodutível para a avaliação de mudanças conjuntas na OA. Este protocolo apresenta uma poderosa adição aos sistemas existentes e permite uma detecção mais eficiente de alterações patológicas na articulação.

OA induzido por DMM resulta em degeneração da cartilagem articular e perda de condrócito A OA induzida pelo DMM resultou em um aumento da pontuação de OARSI em comparação com camundongos falsos, caracterizado distintamente pela erosão da superfície e perda de cartilagem(Figura 1A,D). O protocolo de histomormormetria detalhado aqui detectou várias alterações associadas à OA, incluindo uma diminuição na área total da cartilagem e na área de...

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Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

O protocolo atual estabelece um método rigoroso e reprodutível para quantificação de alterações articulares morfológicas que acompanham a osteoartrite. A aplicação deste protocolo pode ser valiosa no monitoramento da progressão da doença e na avaliação de intervenções terapêuticas na osteoartrite.

Avaliação histomorfométrica padronizada da osteoartrite em um modelo de rato cirúrgico

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Nosso protocolo aborda uma necessidade não atendida de um método robusto e reprodutível para análise quantitativa de mudanças articulares no desenvolvimento e progressão da osteoartrite. Nossa técnica traça parâmetros específicos e reprodutíveis para a análise quantitativa de alterações em múltiplos tecidos articulares na osteoartrite. Como essa técnica permite a análise quantitativa da osteoartrite, pode ser empregada para comparar os efeitos de tratamentos específicos em múltiplos tecidos articulares, a fim de avaliar sua eficácia terapêutica.Nosso protocolo também pode ser aplicado a outros modelos de osteoartrite ou áreas de pesquisa musculoesquelético em que a quantificação da cartilagem e osso é necessária. Embora o sistema seja simples e intuitivo, as sessões de treinamento ainda são necessárias para praticar a obtenção de medições de forma repetida para alcançar a reprodutibilidade. Vengadeshprabhu Karuppagounder, um estudioso de pós-doutorado do nosso laboratório, agora estará demonstrando nosso procedimento.Comece ligando o microscópio, câmera, computador e monitor de tela sensível ao toque. Selecione o objetivo 4X e clique no ícone de software para iniciar o programa de software. Coloque o slide no estágio do microscópio e centralizar a amostra dentro da janela de medição garantindo que a grade de medição seja definida para a ampliação adequada para corresponder ao objetivo, na medida em que tanto a superfície articular tibial quanto o osso subcondral tibial estão incluídos nas regiões de interesse da imagem.Em seguida, no menu Arquivo, selecione "Ler configurações". Na janela Configurações, selecione o arquivo de configurações apropriado para que os parâmetros sejam medidos. Para medir a área total da cartilagem, selecione a função Tib TC e rastreie ao longo da borda superior da superfície da cartilagem tibial onde a cartilagem encontra o espaço articular e ao longo da junção condro-osseosa onde a cartilagem calcificada encontra o osso subcondral.Para medir a área de cartilagem calcificada selecione a função Tib CC e trace uma linha ao longo da marca da maré, uma linha natural que separa as regiões calcificadas e não calcificadas da cartilagem, e ao longo da junção condro-ósseo onde a cartilagem calcificada encontra o osso subcondral. Para determinar a área de cartilagem não calcificada, subtraia a área de cartilagem calcificada da área total da cartilagem. Para determinar o número de condrocitos, crie funções de contagem separadas dentro das configurações do software histomorfometria para distinguir os condrocitos de produção de matriz e matriz que não produzem.Em seguida, use a caneta para fazer um pequeno ponto sobre cada condrocito expressando o fenótipo especificado para determinar o número de matrizs produzindo ou não produzindo condrocitos. Para medir o parâmetro total da superfície articular tibial, rastreie uma linha através da superfície da cartilagem tibial para definir cuidadosamente as fibrilações individuais. Em seguida, desenhe uma segunda linha ao longo da marca da maré para servir como um controle interno para o plano de cada seção e divida o parâmetro de superfície articular tibial pelo parâmetro da marca da maré para calcular o índice de fibrilação da superfície articular tibial.Para medir a área de espaço de medula subcondral, selecione a função Área da Medula. Em seguida, desenhe linhas ao redor do parâmetro dessas áreas para determinar a área total do espaço da medula óssea dentro do osso subcondral tibial. Para medir a área subcondral total, selecione a função óssea subcondral e delineie a região entre a junção condro-osseosa na borda superior da placa de crescimento que se estende lateralmente às regiões dos osteófitos anteriores e posteriores.Em seguida, subtraia a área de espaço de medula óssea subcondral da área subcondral total para calcular a área óssea subcondral. Para medir a área de osteofita, selecione a função de osteofitto anterior e rastreie o osteofitfise anterior da tíbia proximal. Em seguida, selecione o osteofite posterior e rastreie o osteofite posterior da tíbia proximal.Para medir a espessura sinovial femoral anterior, clique no Anterior Femur Synovium Meniscus e desenhe uma linha do ponto de inserção interna do sinolio anterior no fêmur em direção ao seu ponto de fixação no menisco e uma linha da inserção externa do sintédio no fêmur em direção ao seu apego ao menisco. Em seguida, divida a área sinovial total pelo parâmetro sinovial para calcular a espessura sinovial. A osteoartrite induzida por DMM resulta em um aumento da pontuação da Osteoartrite Research Society International em comparação com camundongos falsos.Distintamente caracterizado pela erosão superficial e cartilagem perdida. Este protocolo de histomorfometria pode ser usado para detectar várias alterações associadas à osteoartrite, incluindo uma diminuição na cartilagem total e áreas de cartilagem não calcificadas. Redução do número total de condrocitos e, importante, perda no número de condrócitos produtores matricial.Alterações na superfície articular, indicativas da gravidade da erosão, também são observadas, incluindo um aumento global do índice de fibrilação. A osteoartrite também inclui um aumento na área óssea subcondral e uma redução na área do espaço de medula óssea em camundongos DMM indicando esclerose óssea subcondral. As áreas de osteofito anterior e posterior também aumentaram em camundongos DMM, sugerindo uma remodelagem óssea subcondral contínua que atua como um mecanismo compensatório para lidar com mudanças no carregamento articular no local da lesão.A análise histomorfométrica do sinodolio mostra um aumento na espessura sinovial em camundongos DMM. Um resultado típico da osteoartrite associado à inflamação sinovial e à difusão de citocinas inflamatórias no espaço articular. Além disso, não é observada variabilidade significativa entre os histomorphométricos da área de cartilagem não calcificada no escore da Osteoartrite Research Society International.Após análise histomorfométrica, slides sequenciais e coloração de imunofluorescência podem ser usados para examinar alterações na expressão proteica entre as amostras.

Research

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