Name: standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model
Uploaded: 2020-05-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

Мы хотели бы отметить помощь сотрудников Департамента сравнительной медицины и молекулярной и гистопатологии ядро в штате Пенсильвания Милтон С. Херши медицинский центр. Источники финансирования: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).

Двенадцатинедельные мыши C57BL/6 были приобретены в Jax Labs. Все мыши были размещены в группах 3-5 мышей на микро-изолатор клетке в комнате с 12 ч свет / темное расписание. Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения (NIH) по у?...

Недавние исследования остеоартрита улучшили наше понимание перекрестного разговора между различными тканями в суставе и роль каждой ткани играет в инициации болезни или прогрессирования8,9,10,35,36. ...

Один из наиболее распространенных заболеваний суставов в Соединенных Штатах, ОА характеризуется прогрессирующей дегенерации суставного хряща, в первую очередь в тазобедренных и коленных суставов, что приводит к значительному воздействию на мобильность пациента и качество жизни1,2,3. Суставной хрящ является специализированной соединительной ткани диартродиальных суставов, предназначенных для минимизации трения, облегчения движения, и терпеть совместное сжатие4. Суставной хрящ состоит из двух основных компонентов: хондроцитов и внеклеточной матрицы. Хондроциты являются специализированными, метаболически активными клетками, которые играют главную роль в развитии, поддержании и ремонте внеклеточной матрицы4. Гипертрофия хондроцитов (Ch) является одним из основных патологических признаков развития ОА. Он характеризуется увеличением клеточных размеров, снижением протеогликана производства, а также увеличением производства хряща матрицы деградации ферментов, которые в конечном итоге приводят к дегенерации хряща5,6,7. Далее, патологические изменения в подхнольной кости и синовиуме сустава играют важную роль в развитии ОА и прогрессии8,,9,,10,11,12. На сегодняшний день нет существующих лечебных методов лечения, которые подавляют дегенерацию хряща1,,2,,3,,13,,14. Таким образом, существует обширные текущие исследования, направленные на понимание патологии ОА и открыть новые терапевтические подходы, которые способны замедлить или даже остановить ОА. Соответственно, возрастает потребность в количественном и воспроизводимом подходе, который позволяет точно оценить связанные с ОА патологические изменения хряща, синовия и подхноровленной кости сустава.
В настоящее время, ОА тяжести и прогрессии в первую очередь оцениваются с помощью OARSI или Манкин скоринговых систем15. Однако эти системы скоринга являются лишь полуколичественными и могут зависеть от субъективности пользователей. Что еще более важно, они не в состоянии точно оценить тонкие изменения, которые происходят в суставе во время болезни или в ответ на генетические манипуляции или терапевтического вмешательства. Есть спорадические доклады в литературе, описывающие гистоморфометрический анализ хряща, синовия, или подхнольной кости16,17,18,19,20,21. Тем не менее, подробный протокол для строгого и воспроизводимого гистоморфометрического анализа всех этих совместных компонентов по-прежнему отсутствует, создавая неудовлетворенную потребность в этой области.
Для изучения патологических изменений в ОА с помощью гистоморфометрического анализа, мы использовали хирургическую модель мыши ОА, чтобы вызвать ОА через дестабилизацию медиальный мениск (DMM). Среди установленных моделей мурина ОА, DMM был выбран для нашего исследования, поскольку она включает в себя менее травматический механизм травмы22,23,24,25,26. По сравнению с менискаль-связкой травмы (MLI) или передней крестообразной связки травмы (ACLI) операции, DMM способствует более постепенное прогрессирование ОА, подобно развитию ОА у людей22,24,25,26. Мыши были усыплены двенадцать недель после операции DMM для оценки изменений в суставном хряще, подхноловой кости и синовиума.
Целью данного протокола является создание стандартизированного, строгого и количественного подхода к оценке совместных изменений, сопровождающих ОА.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>For sample fixation following harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq 27QHD Creative Pen Display</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq Ergo stand</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC446080010</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>F7258</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For sample section collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoPrep Xylene</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>HC-700-1GAL</td>
			<td>For sample deparrafinization and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-182-701A</td>
			<td>For sample processing and embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Z440 Workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td>Product number: Y5C77US#ABA</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM 2235</td>
			<td>For sample sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801880</td>
			<td>For sample labeling, cassettes and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX53 Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS DP 73 Microscope Camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORION STAR A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoMeasure Software</td>
			<td>OsteoMetrics</td>
			<td>https://www.osteometrics.com/index.htm</td>
			<td>For histomorphometric measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model # 39471005</td>
			<td>For mouse knee harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM 7 Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Institutional Access Account</td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-O stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>S8884</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage</td>
			<td>Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)</td>
			<td>http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom Pro Pen Stylus</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029713</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029714</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model

Один из наиболее распространенных заболеваний суставов в Соединенных Штатах, остеоартрит (ОА) характеризуется прогрессирующей дегенерации суставного хряща, в первую очередь в тазобедренных и коленных суставов, что приводит к значительному воздействию на мобильность пациента и качество жизни. На сегодняшний день, Есть нет существующих лечебных методов лечения ОА в состоянии замедлить или ингибировать дегенерацию хряща. В настоящее время существует обширный объем текущих исследований, чтобы понять патологию ОА и открыть новые терапевтические подходы или агенты, которые могут эффективно замедлить, остановить, или даже обратить вспять ОА. Таким образом, крайне важно иметь количественный и воспроизводимый подход для точной оценки Связанных СОвРом патологических изменений в суставном хряще, синовиуме и подхондрятельной кости. В настоящее время, ОА тяжести и прогрессии в первую очередь оцениваются с помощью остеоартрита научно-исследовательского общества International (OARSI) или Манкин скоринга систем. Несмотря на важность этих систем скоринга, они являются полуколичественными и могут зависеть от субъективности пользователя. Что еще более важно, они не в состоянии точно оценить тонкие, но важные, изменения в хряще в начале состояния болезни или ранних фаз лечения. В описанном здесь протоколе используется компьютеризированная и полуавтоматизированная гистоморфетричная система программного обеспечения для создания стандартизированной, строгой и воспроизводимой количественной методологии для оценки совместных изменений в ОА. Этот протокол представляет собой мощное дополнение к существующим системам и позволяет более эффективно обнаруживать патологические изменения в суставе.

DMM-индуцированной ОА приводит к дегенерации суставного хряща и потери хондроцитов DMM-индуцированной ОА привело к увеличению OARSI оценка по сравнению с фиктивными мышами, четко характеризуется поверхностной эрозии и потери хряща(Рисунок 1A,D). В протоко?...

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model at JoVE.com

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

Действующий протокол устанавливает строгий и воспроизводимый метод количественной оценки морфологических изменений суставов, которые сопровождают остеоартрит. Применение этого протокола может быть полезным в мониторинге прогрессирования заболевания и оценке терапевтических вмешательств при остеоартрите.

Стандартизированная гистоморфометрическая оценка остеоартрита в модели хирургической мыши

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

В нашем протоколе рассматривается неудовлетворенная потребность в надежном и воспроизводимом методе количественного анализа изменений суставов при развитии и прогрессировании остеоартрита. Наша методика определяет конкретные и воспроизводимые параметры количественного анализа изменений в тканях нескольких суставов при остеоартрите. Поскольку этот метод позволяет количественного анализа остеоартрита, он может быть использован для сравнения воздействия конкретных методов лечения на несколько тканей суставов, с тем чтобы оценить их терапевтическую эффективность.Наш протокол также может быть применен к другим моделям остеоартрита или областям исследований опорно-двигательного мозга, в которых необходима количественная оценка хряща и кости. Хотя эта система проста и интуитивно понятна, учебные занятия по-прежнему необходимы для повторного получения измерений для достижения воспроизводимости. Vengadeshprabhu Karuppagounder, докторант из нашей лаборатории теперь будет демонстрировать нашу процедуру.Начните с включением монитора микроскопа, камеры, компьютера и сенсорного экрана. Выберите цель 4X и нажмите значок программного обеспечения для запуска программного обеспечения. Поместите слайд на стадии микроскопа и центр образца в окне измерения обеспечения того, чтобы сетка измерения установлена на надлежащее увеличение, чтобы соответствовать цели в том, что как тибиальной и бедренной суставной поверхности и тибиальной субхондральной кости включены в области изображения интерес.Затем в меню Файла выберите Настройки чтения. В окне Настройки выберите соответствующий файл настроек для измеренных параметров. Чтобы измерить общую площадь хряща, выберите функцию Tib TC и проследите вдоль верхнего края поверхности хряща, где хрящ встречается с суставным пространством и вдоль хондро-оссейного соединения, где кальциновый хрящ встречается с субхондральной костью.Для измерения кальцинифицированной области хряща выберите функцию Tib CC и проследите линию вдоль отметки прилива, естественной линии, разделяющей кальцинифицированные и некалифицированные области хряща, и вдоль хондро-оссейного соединения, где кальцинифицированный хрящ встречается с субхондральной костью. Чтобы определить некалифицированную область хряща, вычесть кальцинифицированную область хряща из общей области хряща. Чтобы определить число хондроцитов, создайте отдельные функции подсчета в настройках в программном обеспечении гистоморфометрии, чтобы отличить матрицу производства и матрицы не-производящих хондроцитов.Затем используйте стилус, чтобы сделать небольшую точку над каждым хондроцитом, выражают указанный фенотип, чтобы определить количество матриц, производящих или не производящих хондроциты. Чтобы измерить общий параметр поверхности мибия, проследите линию по всей поверхности хряща, чтобы тщательно определить отдельные фибрилляции. Затем нарисуйте вторую линию вдоль отметки прилива, чтобы служить внутренним контролем для плоскости каждого участка и разделить параметр поверхности трибиаля по параметру отметки прилива для расчета индекса фибрилляции поверхности трибия.Для измерения области пространства субхондриального мозга выберите функцию зоны костного мозга. Затем нарисуйте линии вокруг параметра этих областей, чтобы определить общую площадь пространства костного мозга в подхондриальной кости. Для измерения общей субхондральной области выберите функцию субхондральной кости и наметьте область между хондро-оссеозным соединением в верхней границе пластины роста, простирающейся боковой к регионам переднего и заднего остеофитов.Затем вычесть область пространства субхондриального костного мозга из общей субхондриальной области для расчета субхондриальной области кости. Для измерения остеофитной области выберите передняя остеофитная функция и проследите передний остеофит проксимальной голени. Затем выберите задний остеофит и проследить задний остеофит проксимальной голени.Чтобы измерить переднюю бедренную синовиаловую толщину, щелкните передней бедренной оболочки synovium Meniscus и нарисуйте одну линию от внутренней точки вставки переднего синовия на бедренной кости к точке крепления мениска и одну линию от внешней вставки синовиума на бедренной кости к его привязанности к мениска. Затем разделите общую синовиаловую область на синовиальный параметр для расчета синовиальной толщины. DMM индуцированных остеоартрита приводит к увеличению остеоартрита Научно-исследовательское общество Международный балл по сравнению с фиктивных мышей.Отчетливо характеризуется эрозией поверхности и потерянным хрящом. Этот протокол гистоморфометрии может быть использован для обнаружения нескольких остеоартрит связанных изменений, включая уменьшение общего хряща и некалифицированных областей хряща. Снижение общего числа хондроцитов и, что важно, потеря количества матриц, производящих хондроциты.Наблюдаются также изменения поверхности суставов, свидетельствующие о серьезности эрозии, включая общее увеличение индекса фибрилляции. Остеоартрит также включает в себя увеличение области субхондриальной кости и уменьшение площади пространства костного мозга у мышей ДММ, указывающих на субхондриальный склероз костей. Как передние, так и задние области остеофита также увеличились у мышей ДММ, что свидетельствует о продолжающейся подхондриальной ремоделирования костей, которая выступает в качестве компенсационного механизма для обработки изменений в совместной нагрузке в месте травмы.Гистоморфометрический анализ синовия показывает увеличение толщины синовиальной клетки у мышей ДММ. Типичным исходом остеоартрита связано синовиальное воспаление и диффузия воспалительных цитокинов в суставное пространство. Кроме того, не наблюдается существенной межвидовой изменчивости между гистоморфометрическим анализом некалифицированной области хряща в международном исследовании остеоартрита.После гистоморфометрического анализа для изучения изменений экспрессии белка между образцами могут использоваться последовательные слайды и окрашивание иммунофлюоресценции.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Новый хирургический подход к интратрахеального введения биологически активных веществ в фетальный модель мыши

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Имплантация нижней полой вены вмешательство трансплантат в мышиной модели

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Трансплантация клапана легочной артерии с помощью мыши Модель гетеротопической Трансплантация сердца

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

The Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis Pain in the Mouse

Monoiodoacetate модель остеоартрита боли у мышей

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Изометрические сократимости измерение верхней брыжеечной артерии мыши, с помощью проволоки миография

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

Нижняя телесно-положительная протектора для реабилитации остеоартрита коленного сустава

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

Оценка производства глюкозы в печени в мышиной модели синдрома поликистозных яичников

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a common disease that results in disorders of glucose metabolism, such as insulin resistance and glucose intolerance. ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

Патофизиологическая оценка сетчатки в модели крысы

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Treating Knee Osteoarthritis with Tuina in a Rabbit Model

Tuina Intervention in Rabbit Model of Knee Osteoarthritis

Using a Rabbit Model to Explore the Efficacy of Tuina in Treating Knee Osteoarthritis (Video) | JoVE

Вмешательство Туина в кроличью модель остеоартроза коленного сустава

Knee osteoarthritis (KOA) is mainly characterized by degenerative changes in the knee joint's cartilage and surrounding soft tissues. The efficacy of ...

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model (Video) | JoVE

Оценка микроархитектуры трабекулярной кости на мышиной модели остеопороза

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...