Name: standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model
Uploaded: 2020-05-06T13:00:00
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Nos gustaría reconocer la asistencia del personal del Departamento de Medicina Comparada y del núcleo Molecular e Histopatología en Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Fuentes de financiación: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).

Los ratones C57BL/6 de edad de doce semanas fueron comprados en Jax Labs. Todos los ratones fueron alojados en grupos de 3-5 ratones por jaula de micro-isolator en una habitación con un horario de 12 h de luz/oscuridad. Todos los procedimientos de animales se realizaron de acuerdo con la Guía del Instituto Nacional de Salud (NIH) para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Pensilvania.
1. Modelo ...

Investigaciones recientes de osteoartritis han mejorado nuestra comprensión de la interferencia entre los diferentes tejidos dentro de la articulación y el papel que cada tejido desempeña en la iniciación de la enfermedad o progresión8,9,10,35,36. En consecuencia, se ha vuelto obvio que la evaluación de la OA no debe limitarse al análisis del cartílago...

Uno de los trastornos articulares más frecuentes en los Estados Unidos, OA se caracteriza por la degeneración progresiva del cartílago articular, principalmente en las articulaciones de cadera y rodilla, lo que resulta en impactos significativos en la movilidad del paciente y la calidad de vida1,,2,3. El cartílago articular es el tejido conectivo especializado de las articulaciones diarthrodiales diseñadas para minimizar la fricción, facilitar el movimiento y soportar la compresión articular4. El cartílago articular se compone de dos componentes principales: condrocitos y matriz extracelular. Los condrocitos son células especializadas, metabólicamente activas que desempeñan un papel principal en el desarrollo, mantenimiento y reparación de la matriz extracelular4. La hipertrofia condrocitos (CH) es uno de los principales signos patológicos del desarrollo de la OA. Se caracteriza por un aumento del tamaño celular, disminución de la producción de proteoglicano, y aumento de la producción de enzimas degradantes de la matriz de cartílago que eventualmente conducen a la degeneración del cartílago5,6,7. Además, los cambios patológicos en el hueso subcondral y el sinovium de la articulación juegan un papel importante en el desarrollo y progresión de la OA8,9,10,11,12. Hasta la fecha, no existen terapias curativas que inhiban la degeneración del cartílago1,2,3,13,14. Por lo tanto, hay una amplia investigación en curso que tiene como objetivo entender la patología oA y descubrir nuevos enfoques terapéuticos que son capaces de ralentizar o incluso detener OA. En consecuencia, existe una creciente necesidad de un enfoque cuantitativo y reproducible que permita una evaluación precisa de los cambios patológicos asociados a la OA en el cartílago, el sinovium y el hueso subcondral de la articulación.
Actualmente, la gravedad y progresión de la OA se evalúan principalmente utilizando los sistemas de puntuación OARSI o Mankin15. Sin embargo, estos sistemas de puntuación son sólo semicuantitativos y pueden verse influenciados por la subjetividad del usuario. Lo que es más importante, no evalúan con precisión los cambios sutiles que ocurren en la articulación durante la enfermedad o en respuesta a la manipulación genética o una intervención terapéutica. Hay informes esporádicos en la literatura que describen análisis histomorfométricos del cartílago, sinovium, o hueso subcondral16,17,18,19,20,21. Sin embargo, todavía falta un protocolo detallado para un análisis histomorfométrico riguroso y reproducible de todos estos componentes conjuntos, creando una necesidad insatisfecha en el campo.
Para estudiar los cambios patológicos en OA utilizando análisis histomorfométricos, utilizamos un modelo de ratón OA quirúrgico para inducir OA a través de la desestabilización del menisco medial (DMM). Entre los modelos establecidos de OA murina, DMM fue seleccionada para nuestro estudio porque implica un mecanismo menos traumático de lesión22,,23,,24,,25,26. En comparación con las cirugías de lesión menisca-ligamentoligamenta (MLI) o lesión del ligamento cruzado anterior (ACLI), DMM promueve una progresión más gradual de la OA, similar al desarrollo de OA en humanos22,,24,,25,,26. Los ratones fueron eutanasiados doce semanas después de la cirugía de MMC para evaluar los cambios en el cartílago articular, el hueso subcondral y el sinovium.
El objetivo de este protocolo es establecer un enfoque estandarizado, riguroso y cuantitativo para evaluar los cambios conjuntos que acompañan a OA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Buffered Formalin Phosphate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SF100-20</td>
			<td>For sample fixation following harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq 27QHD Creative Pen Display</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cintiq Ergo stand</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC446080010</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>F7258</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For sample section collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoPrep Xylene</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>HC-700-1GAL</td>
			<td>For sample deparrafinization and staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-182-701A</td>
			<td>For sample processing and embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Z440 Workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td>Product number: Y5C77US#ABA</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM 2235</td>
			<td>For sample sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marking pens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801880</td>
			<td>For sample labeling, cassettes and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX53 Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS DP 73 Microscope Camera</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORION STAR A211 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA2110</td>
			<td>For Decalcification Buffer preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoMeasure Software</td>
			<td>OsteoMetrics</td>
			<td>https://www.osteometrics.com/index.htm</td>
			<td>For histomorphometric measurement and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Model # 39471005</td>
			<td>For mouse knee harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRISM 7 Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Institutional Access Account</td>
			<td>Statistical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-O stain</td>
			<td>SIGMA Life Sciences</td>
			<td>S8884</td>
			<td>For sample staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage</td>
			<td>Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier)</td>
			<td>http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wacom Pro Pen Stylus</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch</td>
			<td>For histomorphometric analysis and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin A</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029713</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigerts Iron Hematoxylin B</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5029714</td>
			<td>For hematoxylin staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model

Uno de los trastornos articulares más frecuentes en los Estados Unidos, la osteoartritis (OA) se caracteriza por la degeneración progresiva del cartílago articular, principalmente en las articulaciones de la cadera y la rodilla, lo que resulta en impactos significativos en la movilidad del paciente y la calidad de vida. Hasta la fecha, no existen terapias curativas para OA capaz de ralentizar o inhibir la degeneración del cartílago. En la actualidad, hay un extenso cuerpo de investigación en curso para entender la patología de OA y descubrir nuevos enfoques terapéuticos o agentes que pueden ralentizar, detener o incluso revertir OA de manera eficiente. Por lo tanto, es crucial tener un enfoque cuantitativo y reproducible para evaluar con precisión los cambios patológicos asociados a la OA en el cartílago articular, el sinovium y el hueso subcondral. Actualmente, la gravedad y progresión de la OA se evalúan principalmente utilizando los sistemas de puntuación de Osteoarthritis Research Society International (OARSI) o Mankin. A pesar de la importancia de estos sistemas de puntuación, son semicuantitativos y pueden verse influenciados por la subjetividad del usuario. Lo que es más importante, no evalúan con precisión los cambios sutiles, pero importantes, en el cartílago durante los estados tempranos de la enfermedad o las fases de tratamiento temprano. El protocolo que describimos aquí utiliza un sistema de software histomorfométrico computarizado y semiautomatizado para establecer una metodología cuantitativa estandarizada, rigurosa y reproducible para la evaluación de cambios conjuntos en OA. Este protocolo presenta una poderosa adición a los sistemas existentes y permite una detección más eficiente de los cambios patológicos en la articulación.

Resultados de OA inducidos por DMM en degeneración del cartílago articular y pérdida de condrocitos La OA inducida por DMM dio lugar a un aumento de la puntuación de OARSI en comparación con los ratones falsos, claramente caracterizado por la erosión superficial y la pérdida de cartílago(Figura 1A,D). El protocolo de histomorfometría detallado aquí detectó varios cambios asociados a La OA, incluyendo una disminución en el área total del cart?...

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Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

El protocolo actual establece un método riguroso y reproducible para la cuantificación de los cambios morfológicos articulares que acompañan a la osteoartritis. La aplicación de este protocolo puede ser valiosa para monitorear la progresión de la enfermedad y evaluar las intervenciones terapéuticas en la osteoartritis.

Evaluación histomorfométrica estandarizada de la osteoartritis en un modelo de ratón quirúrgico

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

Nuestro protocolo aborda una necesidad insatisfecha de un método robusto y reproducible para el análisis cuantitativo de los cambios articulares en el desarrollo y progresión de la osteoartritis. Nuestra técnica describe parámetros específicos y reproducibles para el análisis cuantitativo de cambios en múltiples tejidos articulares en la osteoartritis. Como esta técnica permite el análisis cuantitativo de la osteoartritis, se puede emplear para comparar los efectos de tratamientos específicos en múltiples tejidos articulares con el fin de evaluar su eficacia terapéutica.Nuestro protocolo también se puede aplicar a otros modelos de osteoartritis o áreas de investigación musculoesquelética en las que se necesita cuantificación del cartílago y el hueso. Aunque el sistema es sencillo e intuitivo, las sesiones de entrenamiento siguen siendo necesarias para practicar la obtención de mediciones de forma repetida para lograr la reproducibilidad. Vengadeshprabhu Karuppagounder, un erudito postdoctoral de nuestro laboratorio, ahora demostrará nuestro procedimiento.Comience encendiendo el microscopio, la cámara, el ordenador y el monitor de pantalla táctil. Seleccione el objetivo 4X y haga clic en el icono de software para iniciar el programa de software. Coloque la diapositiva en la etapa del microscopio y centre la muestra dentro de la ventana de medición asegurándose de que la cuadrícula de medición se establece en el aumento adecuado para que coincida con el objetivo en que tanto la superficie articular tibial y femoral como el hueso subcondral tibial se incluyen dentro de las regiones de imagen de interés.A continuación, en el menú Archivo, seleccione Configuración de lectura. En la ventana Configuración, seleccione el archivo de configuración adecuado para los parámetros que se van a medir. Para medir el área total del cartílago, seleccione la función Tib TC y trace a lo largo del borde superior de la superficie del cartílago tibial donde el cartílago se encuentra con el espacio articular y a lo largo de la unión condro-osseous donde el cartílago calcificado se encuentra con el hueso subcondral.Para medir el área del cartílago calcificado, seleccione la función Tib CC y trace una línea a lo largo de la marca de la marea, una línea natural que separa las regiones calcificadas y no álficas del cartílago, y a lo largo de la unión condroo-ossea donde el cartílago calcificado se encuentra con el hueso subcondral. Para determinar el área del cartílago no escalificado, reste el área del cartílago calcificado del área total del cartílago. Para determinar el número de condrocitos, cree funciones de recuento independientes dentro de los ajustes del software de histomorometría para distinguir los condrocitos productores de matrices y no productores.A continuación, utilice el lápiz para hacer un pequeño punto sobre cada condrocitos expresando el fenotipo especificado para determinar el número de matrices que producen o no producen condrocitos. Para medir el parámetro de superficie articular tibial total, trace una línea a través de la superficie del cartílago tibial para definir cuidadosamente las fibrilaciones individuales. A continuación, dibuje una segunda línea a lo largo de la marca de marea para que sirva como control interno para el plano de cada sección y divida el parámetro de superficie articular tibial por el parámetro de marca de marea para calcular el índice de fibrilación de superficie articular tibial.Para medir el área de espacio de la médula subcondral, seleccione la función Area de médula. A continuación, dibuje líneas alrededor del parámetro de estas áreas para determinar el área total del espacio de la médula ósea dentro del hueso subcondral tibial. Para medir el área subcondral total, seleccione la función Hueso Subcondral y delinee la región entre la unión condro-osseous en el borde superior de la placa de crecimiento que se extiende lateralmente a las regiones de los osteofitos anterior y posterior.A continuación, reste el área del espacio de la médula ósea subcondral del área subcondral total para calcular el área ósea subcondral. Para medir el área osteofíla, seleccione la función de osteofito anterior y trace el osteofito anterior de la tibia proximal. A continuación, seleccione el osteofito posterior y trace el osteofito posterior de la tibia proximal.Para medir el grosor de la sinovial femoral anterior, haga clic en Anterior Femur Synovium Meniscus y dibuje una línea desde el punto de inserción interno del sinovium anterior en el fémur hacia su punto de unión en el menisco y una línea desde la inserción externa del sinovium en el fémur hacia su fijación al menisco. A continuación, divida el área sinovial total por el parámetro sinovial para calcular el grosor sinovial. La osteoartritis inducida por DMM resulta en un aumento de la puntuación de La Sociedad de Investigación de Osteoartritis en comparación con ratones falsos.Claramente caracterizado por la erosión de la superficie y la pérdida de cartílago. Este protocolo de histomormetría se puede utilizar para detectar varios cambios asociados a la osteoartritis, incluyendo una disminución en el cartílago total y áreas de cartílago nocalcificado. Una reducción en el número total de condrocitos y, lo que es más importante, una pérdida en el número de matriz que produce condrocitos.También se observan cambios en la superficie articular, indicativos de la gravedad de la erosión, incluyendo un aumento general en el índice de fibrilación. La osteoartritis también incluye un aumento en el área ósea subcondral y una reducción en el área del espacio de la médula ósea en ratones DMM que indican esclerosis ósea subcondral. Tanto las áreas de osteofito anterior y posterior también aumentaron en ratones DMM, lo que sugiere una remodelación ósea subcondral en curso que actúa como un mecanismo compensatorio para manejar los cambios en la carga de las articulaciones en el sitio de la lesión.El análisis histomorfométrico del sinovium muestra un aumento en el grosor sinovial en ratones DMM. Un resultado típico de la osteoartritis asociada a la inflamación sinovial y la difusión de citoquinas inflamatorias en el espacio articular. Además, no se observa ninguna variabilidad entre usuarios significativa entre el análisis histomorfométrico del área de cartílago nocalcificado en la puntuación de Osteoarthritis Research Society International.Después del análisis histomorfométrico, se pueden utilizar diapositivas secuenciales y tinción de inmunofluorescencia para examinar los cambios en la expresión de proteínas entre las muestras.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Un nuevo enfoque quirúrgico para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en un modelo de ratón fetal

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Investigación

Medicina

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

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Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

El trasplante de la válvula pulmonar Utilizando un modelo de ratón de heterotópico trasplante cardiaco

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

The Monoiodoacetate Model of Osteoarthritis Pain in the Mouse

El Modelo Monoiodoacetate del dolor de la osteoartritis en el ratón

A major symptom of patients with osteoarthritis (OA) is pain that&#160;is triggered by peripheral as well as central changes within the pain pathways. The ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

The Lower Body Positive Pressure Treadmill for Knee Osteoarthritis Rehabilitation

La cinta de correr de presión positiva del cuerpo inferior para la rehabilitación de la osteoartritis de rodilla

Here, based on a clinician&rsquo;s point-of-view, we propose a two-model lower body positive pressure (LBPP) protocol (walking and squatting models) in ...

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Evaluación de la producción hepática de glucosa en un modelo de ratón con síndrome de ovario poliquístico

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