Name: murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology
Uploaded: 2020-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح بحثية من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا (المنحة رقم 100/2000). APP1048740 وAPP1142394 إلى G.A.R. APP1160323 إلى J.E.E.T. ، J.K.O. ، G.A.R.). يتم دعم Grant A. Ramm من قبل زمالة أبحاث كبار من NHMRC في أستراليا (المنحة رقم APP1061332). تم دعم مانويل فرنانديز روخو من قبل برنامج TALENTO في مدريد، إسبانيا (T1-BIO-1854).

وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمدونة الأسترالية لرعاية الحيوانات واستخدامها للأغراض العلمية في معهد البحوث الطبية QIMR Berghofer بموافقة لجنة أخلاقيات الحيوانات في المعهد. تم الحصول على ذكور فئران C57BL/6 (15-20 أسبوعاً) من مركز الموارد الحيوانية، غرب أستراليا.
ملاحظة: يجب ?...

<ol>
	<li>Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Insight+into+the+Role+of+Fibrosis+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis-Related+Hepatocellular+Carcinoma.">Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).</li><li>Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+liver+progenitor+cells+during+liver+regeneration,+fibrogenesis,+and+carcinogenesis.">The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).</li><li>Ouchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Steatohepatitis+in+Humans+with+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoids.">Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids.</a> Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).</li><li>Vickers, A. E., Fisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+slices+for+the+evaluation+of+human+drug+toxicity.">Organ slices for the evaluation of human drug toxicity.</a> Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).</li><li>Olinga, P., Schuppan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+liver+slices:+a+tool+to+model+the+liver+ex+vivo.">Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo.</a> Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).</li><li>Paish, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bioreactor+Technology+for+Modeling+Fibrosis+in+Human+and+Rodent+Precision-Cut+Liver+Slices.">A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices.</a> Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).</li><li>Prins, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pathophysiological+Model+of+Non-Alcoholic+Fatty+Liver+Disease+Using+Precision-Cut+Liver+Slices.">A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices.</a> Nutrients. 11 (3), 507 (2019).</li><li>Ramm, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrogenesis+in+pediatric+cholestatic+liver+disease:+role+of+taurocholate+and+hepatocyte-derived+monocyte+chemotaxis+protein-1+in+hepatic+stellate+cell+recruitment.">Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment.</a> Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).</li><li>Pozniak, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taurocholate+Induces+Biliary+Differentiation+of+Liver+Progenitor+Cells+Causing+Hepatic+Stellate+Cell+Chemotaxis+in+the+Ductular+Reaction:+Role+in+Pediatric+Cystic+Fibrosis+Liver+Disease.">Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease.</a> The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).</li><li>Clouzeau-Girard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+bile+acids+on+biliary+epithelial+cell+proliferation+and+portal+fibroblast+activation+using+rat+liver+slices.">Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices.</a> Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).</li><li>Szalowska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oxygen+concentration+and+selected+protocol+factors+on+viability+and+gene+expression+of+mouse+liver+slices.">Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices.</a> Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).</li><li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+precision-cut+liver+slices+(PCLS):+a+new+tool+for+studying+tumor+microenvironments+and+cell+signaling+ex+vivo.">Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo.</a> Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).</li><li>Granitzny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+high+quality+rat+precision+cut+liver+slices+during+culture+to+study+hepatotoxic+responses:+Acetaminophen+as+a+model+compound.">Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound.</a> Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+human+liver+slice+cultures+as+an+immunological+platform.">Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform.</a> Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).</li><li>Zarybnicky, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-Individual+Variability+in+Acute+Toxicity+of+R-Pulegone+and+R-Menthofuran+in+Human+Liver+Slices+and+Their+Influence+on+miRNA+Expression+Changes+in+Comparison+to+Acetaminophen.">Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).</li><li>van de Bovenkamp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+liver+slices+as+a+new+model+to+study+toxicity-induced+hepatic+stellate+cell+activation+in+a+physiologic+milieu.">Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu.</a> Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).</li><li>Buettner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+analysis+of+hepatic+glucose+output+and+insulin+action+using+a+liver+slice+culture+system.">Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system.</a> Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).</li><li>Lagaye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-hepatitis+C+virus+potency+of+a+new+autophagy+inhibitor+using+human+liver+slices+model.">Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model.</a> World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).</li><li>Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+model+for+studying+hepatic+schistosomiasis+and+the+effect+of+released+protein+from+dying+eggs.">An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).</li><li>Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+acts+as+a+hepatoprotectant+in+carbofuran+treated+rat+liver+slices+in+vitro.">Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro.</a> Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).</li><li>Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+xenobiotic-induced+DNA+damage+by+the+comet+assay+applied+to+human+and+rat+precision-cut+liver+slices.">Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices.</a> Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).</li><li>van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+fibrotic+rat+liver+slices+as+a+new+model+to+test+the+effects+of+anti-fibrotic+drugs+in+vitro.">Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro.</a> Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).</li><li>Guyot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrogenic+cell+phenotype+modifications+during+remodelling+of+normal+and+pathological+human+liver+in+cultured+slices.">Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices.</a> Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).</li><li>Bigaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+organ-specific+features+of+fibrogenesis+using+murine+precision-cut+tissue+slices.">Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices.</a> Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).</li><li>Kiziltas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+in+pathophysiology+of+liver+diseases.">Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases.</a> World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).</li><li>Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+as+targets+in+chronic+liver+diseases.">Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases.</a> Gut. 58 (5), 704-720 (2009).</li><li>Finot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Stimulation+with+the+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+and+the+Epidermal+Growth+Factor+Promotes+the+Proliferation+of+Hepatocytes+in+Rat+Liver+Cultured+Slices.">Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices.</a> International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).</li><li>Marshall, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+between+hepatocyte+G1+arrest,+impaired+hepatic+regeneration,+and+fibrosis+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection.</a> Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).</li><li>Alpini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+feeding+increased+proliferative+activity+and+apical+bile+acid+transporter+expression+in+both+small+and+large+rat+cholangiocytes.">Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes.</a> Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).</li><li>Studer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugated+bile+acids+activate+the+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+in+primary+rodent+hepatocytes.">Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes.</a> Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).</li></ol>

يوضح البروتوكول تطبيق عزل PCLS murine وزراعة الأنسجة ، وتم تصميم الإجراءات لتقييم كل من الجدوى والفائدة وكذلك دراسة آثار الوسطاء الخارجيين لعلم أمراض الباثوبيولوجيا الكبد باستخدام الاختبارات الكيميائية الحيوية ، وعلم الأنسجة ، وqPCR. وقد ثبت فائدة تجريبية من الأنسجة PCLS الاستزراع في القوارض وا...

الإمراض من أمراض الكبد المزمنة معظم (أي التهاب الكبد الفيروسي، والتهاب الكبد غير الكحولية، وإصابة الكبد cholestatic وسرطان الكبد) ينطوي على تفاعلات معقدة بين أنواع خلايا الكبد المختلفة المتعددة التي تدفع الالتهاب، والتولد الليفي، وتطور السرطان1،2. لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الأمراض المزمنة القائمة على الكبد، يجب التحقيق في التفاعلات بين أنواع خلايا الكبد المتعددة. في حين أن خطوط الخلايا الكبدية المتعددة (ومؤخرا، organoids) يمكن أن تكون مثقفة في المختبر، وهذه النماذج لا تحاكي بدقة بنية معقدة، وظيفة، والتنوع الخلوي للبيئة الدقيقة الكبدية3. وعلاوة على ذلك، فإن خلايا الكبد المستزرعة (على وجه الخصوص، خطوط الخلايا المتحولة) قد تنحرف عن بيولوجيا مصدرها الأصلي. وتستخدم نماذج الحيوانات تجريبيا للتحقيق في التفاعلات بين أنواع خلايا الكبد متعددة. ومع ذلك، قد تصبح منخفضة بشكل كبير في نطاق التلاعب التجريبي، وذلك بسبب آثار كبيرة خارج الهدف في الأعضاء خارج الكبد (على سبيل المثال، عند اختبار العلاجات المحتملة).
استخدام شرائح الكبد الدقيقة القطع (PCLS) في زراعة الأنسجة هو تقنية تجريبية استخدمت لأول مرة في دراسات استقلاب المخدرات وسميتها، وهي تنطوي على قطع شرائح الكبد القابلة للحياة وفائقة النحافة (حوالي 100-250 ميكرومتر) . هذا يسمح التلاعب التجريبي المباشر من أنسجة الكبد السابقين الجسم الحي4. هذه التقنية الجسور الفجوة التجريبية بين في الدراسات الحيوانية في الجسم الحي وطرق زراعة الخلايا في المختبر ، والتغلب على العديد من العيوب من كلا الطريقتين (أي ، حدود عملية على مجموعة من التجارب التي يمكن القيام بها في الحيوانات كلها ، فضلا عن فقدان الهيكل / وظيفة والتنوع الخلوي مع أساليب زراعة الخلية المختبرية).
وعلاوة على ذلك، يزيد PCLS بشكل كبير من القدرة التجريبية مقارنة بالدراسات الحيوانية الكاملة. كما يمكن أن تنتج ماوس واحد أكثر من 48 شرائح الكبد، وهذا يسهل أيضا استخدام كل من مجموعات التحكم والعلاج من نفس الكبد. بالإضافة إلى ذلك ، تفصل هذه التقنية فعليًا أنسجة الكبد عن أنظمة الأعضاء الأخرى . لذلك ، فإنه يزيل الآثار المحتملة خارج الهدف التي يمكن أن تحدث في الحيوانات بأكملها عند اختبار آثار المحفزات الخارجية.
في هذا البروتوكول ، يتم إنشاء PCLS باستخدام هزاز مع شفرة تهتز بشكل طولاني. وقد استخدمت دراسات أخرى بنجاح تقطيع الأنسجة Krumdieck، كما هو موضح في أولينغا وشوبان5. في الهزاز ، يمنع الاهتزاز الجانبي للشفرة تمزق الأنسجة فائقة النحافة الناجمة عن إجهاد القص ، حيث يتم دفع النصل إلى الأنسجة. يعمل كل من الهزاز وتقطيع الأنسجة Krumdieck بشكل فعال دون التضمين الهيكلي لأنسجة الكبد ، مما يبسط إجراء التقطيع. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لإنشاء PCLS من الكبد المريضة، بما في ذلك تلك من نماذج الماوس من التليف / تليف الكبد6 والتهاب الكبد7.
بالإضافة إلى إظهار التقنيات اللازمة لإعداد وزراعة الأنسجة من PCLS، وهذا التقرير يدرس أيضا صلاحية هذه الأنسجة الجسم الحي السابقين عن طريق قياس مستويات أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) وفحص أنسجة الأنسجة لتقييم نخر والتليف. كإجراء تجريبي تمثيلي ، يتم التعامل مع PCLS بتركيزات فيزيولوجية ثلاثية من ثلاثة أحماض صفراء مختلفة (glycocholic ، taurocholic ، والأحماض التشوليك) لمحاكاة إصابة الكبد الالمرارة. في سياق إصابة الكبد التشوستاتيكي ، ثبت أن حمض الطوروكوليك على وجه الخصوص قد زاد بشكل كبير في كل من المصل والصفراء للأطفال الذين يعانون من التليف الكيسي المرتبط بمرض الكبد8.
كما تم علاج خلايا ذرية الكبد في المختبر مع حمض التاوروشوليك لمحاكاة مستويات حمض التاوروشوليك المرتفعة التي لوحظت في المرضى ، وتسبب هذا العلاج في زيادة انتشار وتمايز خلايا ذرية الكبد نحو نمط فينوتاي (cholangiocyte) الصفراري (cholangiocyte)9. وفي وقت لاحق، عولجت الـ PCLS بالجسم الحي السابق بمستويات مرتفعة من حمض الطوروكوليتش، ولوحظت علامات الكولينجيوسيتي المتزايدة. وهذا يدعم الملاحظة المختبرية أن حمض الطوروتشوليك يدفع الانتشار الصفراري و / أو التمايز في سياق مرض الكبد المرتبط بالتليف الكيسي للأطفال9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri Dish</td>
			<td>GREINER</td>
			<td>664160</td>
			<td>Sterile Dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol Solution (made with AR Grade)</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>EA043-20L-P</td>
			<td>Disinfection solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>AA008-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1129-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate Super Glue</td>
			<td>Parfix, DuluxGroup (Australia)</td>
			<td></td>
			<td>Other brands should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Single Edge Safety Razor Blades</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Board</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td>Sterile material over polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare Australia Pty Ltd</td>
			<td>SH30084.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps sharp point 130 mm long</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MET2115-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycocholic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2878-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOLATE II RNA Mini Kit</td>
			<td>Bioline (Aust) Pty Ltd</td>
			<td>BIO-52073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 50 ml</td>
			<td>Provet</td>
			<td>KETAI1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K3753</td>
			<td>Can also be made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hepa air filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picro Sirius Red</td>
			<td>ABCAM Australia Pty Ltd</td>
			<td>ab246832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 1000 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 10 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 200 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 20 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000669-PR240-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protractor</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td>To measure blade angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block</td>
			<td>Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Holder</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bioline (Aust) PTY LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Paintbrush with Plastic Handle</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td>Plastic handle resists ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square-Head Foreceps</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50 ml Plastic Tubes</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Clamps</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Forceps</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Pins</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurochoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-4009-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-NVSLM1</td>
			<td>With thermoelectric cooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams Medium E</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>12551032</td>
			<td>2.0 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 100 mg/mL 50 mL</td>
			<td>Provet</td>
			<td>XYLAZ4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology

فهم آليات إصابة الكبد، والتليف الكبدي، وتليف الكبد التي تكمن وراء أمراض الكبد المزمنة (أي التهاب الكبد الفيروسي، وأمراض الكبد الدهنية غير الكحولية، وأمراض الكبد الأيضية، وسرطان الكبد) يتطلب التلاعب التجريبي نماذج الحيوانات وثقافات الخلايا المختبرية. كلا الأسلوبين لها قيود ، مثل متطلبات أعداد كبيرة من الحيوانات للتلاعب في الجسم الحي. ومع ذلك، لا تستنسخ الخلايا المختبرية بنية ووظيفة البيئة الكبدية متعددة الخلايا. استخدام شرائح الكبد بدقة قطع هو تقنية التي يتم الحفاظ على شرائح موحدة من كبد الماوس قابلة للحياة في زراعة الأنسجة المختبرية للتلاعب التجريبي. تحتل هذه التقنية مكانة تجريبية موجودة بين الدراسات الحيوانية وأساليب زراعة الخلايا المختبرية. يصف البروتوكول المقدم طريقة مباشرة وموثوقة لعزل وزراعة شرائح الكبد الدقيقة من الفئران. وتطبيقا لهذه التقنية، يتم التعامل مع شرائح الكبد الجسم الحي السابق مع الأحماض الصفراوية لمحاكاة إصابة الكبد cholestatic وتقييم آليات الخلايا الليفية الكبدية في نهاية المطاف.

لتحديد صلاحية الخلية من PCLS مع مرور الوقت، تم قياس مستويات ATP الأنسجة. عادة ما تكون مستويات ATP متناسبة مع الجدوى. تمت زراعة PCLS (حوالي 15 مم2 في المنطقة) في وسط William's E العادي مع 10٪ FBS ، ثم في نقاط زمنية محددة ، تمت إزالة شرائح الكبد من زراعة الأنسجة وتجانسها مع كل من تركيزات ATP والبروتين (للتط?...

Watch this Scientific Journal Video about Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology at JoVE.com

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وموثوقة لإنتاج شرائح الكبد الدقيقة القابلة للتطبيق من الفئران. يمكن الحفاظ على عينات الأنسجة الجسمية السابقة في ظل ظروف زراعة الأنسجة المختبرية لعدة أيام ، مما يوفر نموذجًا مرنًا لفحص أمراض الباثوبيولوجيا الكبدية.

المورين الدقة قطع شرائح الكبد كنموذج السابق فيفو بيولوجيا الكبد

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

هذا الفيديو يوضح إنتاج وتطبيق شرائح الكبد قطع الدقة كنموذج تجريبية السابقين vivo من بيولوجيا أنسجة الكبد. شرائح الكبد الدقيقة التي تحتل مكانة تجريبية موجودة بين في الدراسات الحيوانية في الجسم الحي وأساليب ثقافة الخلايا في المختبر. هذه التقنية لديها العديد من الفوائد الرئيسية في دراسات الحيوانات الحية، بما في ذلك القدرة على استخدام عينات التحكم والعلاج من نفس الكبد، وعزل أنسجة الكبد لإزالة الآثار خارج الهدف من أنظمة الجهاز الأخرى، والقدرة على استخدام الكواشف التي قد يكون لها تأثير سلبي إذا طبقت على فأر حي كامل، على سبيل المثال، مثبطات المسارات السامة.تتضمن هذه التقنية استخدام شفرة تهتز بشكل عرضي لقطع شرائح الكبد الرقيقة جدًا من أنسجة الكبد القابلة للحياة متبوعة بثقافة الأنسجة المختبرية. الاهتزازات من شفرة يمنع تمزق الناجمة عن الإجهاد القص. في هذا المثال، سوف نعرض تقنيات تحضيرات شرائح الكبد السابقين vivo قابلة للحياة، وإظهار فائدة ثقافة شريحة الكبد في التجارب سبيل المثال حيث يتم التعامل مع هذه الأنسجة الحية السابقة مع الأحماض الصفراوية لتحفيز إصابة الكبد cholestatic لتقييم آليات الخلايا الليفية الكبدية.أدخل الشفرة في الذراع القاطع. تطهير شفرة والذراع قطع مع محلول الإيثانول 70٪. كن حذرا دائما لتجنب الاتصال مع شفرة.تطهير علبة العازلة مع محلول الإيثانول 70٪ ، ومسحها مع الأنسجة المعقمة. أدخل علبة المخزن المؤقت في الاهتزاز وقم بتشدّد المسمار المتصاعد. تعيين الذراع القطع إلى أقصى ارتفاع المتاحة.تحقق من زاوية النصل. على اهتزاز لدينا، ونحن نستخدم زاوية 10 درجة من الأفقي، مع شفرة المنحدرة إلى أسفل نحو العينة. تأكد من أن زاوية النصل ثابتة بإحكام.تطهير حامل العينة، مرة أخرى، مع محلول الإيثانول 70٪. قم بتوصيل مياه التبريد لمبرد بلتيير الحراري، الموجود تحت درج العازلة. بعض نماذج هزاز استخدام حمام الجليد للتبريد بدلا من ذلك.إصلاح أنبوب المياه خارج إلى استنزاف، وتشغيل الماء. تعيين برودة إلى أربع درجات مئوية. أضف عازل Krebs-Henseleit الجليدي البارد إلى علبة المخزن المؤقت.يجب أن تكون جميع الأدوات والمواد الجراحية معقمة. يجب أن تكون الفئران تخديرًا عميقًا أو قتلًا رحيمًا. تم تطهير أسطح الجلد على الفئران عن طريق التبول مع محلول الإيثانول بنسبة 70٪.إجراء شق في منتصف الجلد من قاعدة تجويف البطن إلى الحجاب الحاجز. باستخدام ملقط نظيفة ومقص، وفتح تجويف البطن. إزالة الكبد بسرعة، دون إتلاف الفصوص.دفع الكبد إلى أسفل، وقطع النسيج الضام في الجزء العلوي من الكبد. دفع الكبد صعودا. عقد منطقة الأوعية الدموية مركز الكبد مع ملقط وسحب إلى أعلى.قطع الأوعية الدموية النسيج الضام. الحرص على عدم تلف فصوص الكبد, وأيضا, الحرص على عدم قطع في الجهاز الهضمي. وضع الكبد إزالتها في طبق معقمة من الجليد الباردة كريبس-Henseleit العازلة.فصل الكبد إلى فصوص فردية. حدد فص كبد واحد ووضع الجانب المسطح أسفل على طبق معقمة جديدة. إبقاء فصوص أخرى على الجليد في كريبس هينسيليت العازلة.تقليم حواف فصوص الكبد. التشذيب مهم، لا سيما على الحافة التي سوف الاتصال شفرة القطع أولا، وجود حافة الأنسجة عمودي نسبيا على شفرة القطع سوف تمنع ضغط الأنسجة التي يمكن أن تحدث في زوايا ضحلة. قطع الأنسجة حول حواف الثلاثة الأخرى يزيل الكثير من كبسولات ليفية في حافة الأنسجة، وعادة ما يسمح إزالة أسهل من شرائح الأنسجة.ضع طبقة رقيقة من الغراء سيانوكريلا على الحافة الأمامية لحامل العينة، أكبر قليلا من فصوص الكبد المشذبة. إزالة أي بقايا من العازلة من الأنسجة باستخدام مواد ماصة معقمة. وضع فص الكبد على الغراء سيانوكريات, مع أكبر حافة تواجه نحو الجبهة.السماح لعلاج في الهواء لمدة دقيقة إلى دقيقتين. ضع الأنسجة المتصلة بصاحب العينة في الاهتزاز. ضبط سرعة هزاز.خفض شفرة القطع حتى يقع فوق فص الكبد. تشغيل ذراع قطع تهتز على العينة. يتم تنشيط الاهتزاز من النصل على هذا الجهاز من قبل دواسة القدم.العودة إلى الوراء شفرة، وخفض ارتفاع شفرة بمقدار 250 ميكرومتر. كرر هذه العملية حتى تتم إزالة الطبقة العليا من الأنسجة. تجاهل أول شريحة أو شريحتين، حيث ستحتوي هذه الكبسولة غليسون، وبالتالي، لن تحتوي على الكثير من أنسجة الكبد الوظيفية.لقطع شرائح الكبد، تقدم ببطء شفرة تهتز في الأنسجة عن طريق تحويل المقبض. استخدام فرشاة صغيرة لتوجيه بلطف الأنسجة أثناء عملية القطع. استخدام فرشاة لالتقاط قسم قطع الأنسجة، ومن ثم وضع قسم الأنسجة في أنبوب معقمة تحتوي على مخزن كريبس-هينسليت للتخزين.عندما لا تكون قيد الاستخدام، والحفاظ على هذا الأنبوب على الجليد. بعض الوقت، والأنسجة لا المسيل للدموع أثناء عملية القطع، ولكن بالنسبة لمعظم الأغراض، والأنسجة لا تزال قابلة للاستخدام. قطع شرائح الأنسجة حتى بالقرب من الغراء سيانواكريلات.لا تقطع الغراء كرر مع فصوص الكبد الأخرى، التي تجلس على الجليد، حتى يتم الحصول على العدد المطلوب من شرائح الأنسجة. لتنظيف حامل العينة، إما استخدام شفرة لكشط خليط الغراء الأنسجة قبالة، أو يمكن تخفيف الخليط باستخدام المذيبات مثل الأسيتون أو ثنائي الميثيل السلفوكسيد.في غطاء لثقافة الأنسجة، ماصة واحدة مل من وسط Williams'E تحتوي على 10٪ مصل الأبقار الجنينية ومضادات الميكروبات في لوحة 12-جيدا. إزالة شرائح الأنسجة عن طريق دوامة بلطف الخليط وطرف في طبق معقمة. قطع الأنسجة إلى حجم موحد تقريبا.في هذا المثال، نحن تهدف لشرائح الأنسجة مع مساحة سطح حوالي 50 ملليمتر مربع. الحرص على فحص شرائح الأنسجة للاتساق. تشير الشرائح الداكنة إلى زيادة سماكة الأنسجة ، ويجب التخلص منها.شرائح أخف تشير إلى وجود صمغ سيانواكريلات الشفاء، وينبغي التخلص منها. نقل شرائح الأنسجة إلى لوحة 12-جيدا تحتوي على ملليلتر واحد من وسائل الإعلام. احتضان شرائح الكبد في ظل ظروف زراعة الأنسجة الطبيعية.إذا كان ذلك ممكنا، واستخدام أساليب لتعزيز توافر الأكسجين لشرائح الأنسجة. في اليوم التالي، تغيير وسائل الإعلام باستخدام ماصة دليل لمنع فقدان الأنسجة عن طريق الشفط. شرائح الكبد الدقيقة هي الآن جاهزة للاستخدام التجريبي.لتطبيقنا، تعاملنا شرائح الكبد مع الأحماض الصفراوية لمدة يومين، ومتجانسة في عازلة تحلل لاستخراج رسول RNA وتحليل qPCR. لفحص جدوى شرائح الكبد الدقيقة مع مرور الوقت، استخدمنا مستويات ATP كوكيل لقابلية الخلية. تم تطبيع مستويات ATP إلى البروتين ، وتم قياسها في نقاط زمنية متعددة بعد العزل.وانخفضت مستويات ATP في العينات الفورية وساعة واحدة، ولكن هذا تعافى من قبل ثلاث ساعات. وبعد ذلك، تم الحفاظ على مستويات ATP لمدة خمسة أيام، على الرغم من أنها اتجهت نحو الانخفاض مع مرور الوقت. تم استخدام تلطيخ H&E لفحص شرائح الكبد الدقيقة التي تم الحفاظ عليها في الثقافة لمدة تصل إلى خمسة أيام.كان مورفولوجيا الأنسجة موحية من بعض النخر التي تحدث في اليوم الثاني ، مع نخر شديد يحدث في اليوم الخامس. بسبب النخر يحدث بين يومين وخمسة أيام، نوصي الأداة التجريبية لهذه التقنية يقتصر على حوالي ثلاثة أيام. ومع ذلك، يمكن تعزيز هذا باستخدام أفضل تقنيات توصيل الأوكسجين إلى شرائح الأنسجة.كما يبدو أن شرائح الكبد الدقيقة تحتوي على سماكة من ألياف الكولاجين بالنسبة للوقت في الثقافة. هذا هو موحية من العمليات الليفية العفوية التي تحدث. في التجربة المثال، تم التعامل مع شرائح الكبد الدقيقة مع ثلاثة أحماض الصفراوية منفصلة لمدة يومين، لمحاكاة cholestasis الكبد.وبالنظر إلى تعبير مرنا عن ثلاثة جينات خاصة بتشولانجيوسيت، فإن الأحماض الصفراوية المترافقة، والأحماض الغليشوكية والتوروشولية، زادت بشكل كبير من التعبير عن كل من السيتوكيراتين-19 وconnexin-43. وهذا يتفق مع التنمية cholangiocyte. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء شرائح الكبد قطع دقيق، وكيفية تنفيذ زراعة الأنسجة الأساسية.يمكن استخدام شرائح الكبد الدقيقة في مجموعة واسعة جدًا من التطبيقات ، بما في ذلك التحقيقات التجريبية في التعبير الريبي ، والتعبير البروتيني ، وعلم الوراثة اللاجينية ، وربط الحمض النووي ، والتمثيل الغذائي ، وآليات العدوى ، وغزو السرطان ، وعلم الصيدلة ، وبيولوجيا الخلايا ، ودراسات الإفراز ، فقط على سبيل المثال لا الحصر.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

والإنسان<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; تصلب الشرايين البلاك نموذج لدراسة علم الأحياء الآفات

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

تحليل مجسم الفيديو لنقص الأكسجين الرئوي من الشرايين داخل الرئة باستخدام مورين الدقة قطع شرائح الرئة

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

تقنية Subnormothermic<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الكبد الإرواء للتخزين، تقييم، وإصلاح الطعوم الكبد الهامشية

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

ال<em&gt; في البيضة</em&gt; الفرخ مشيمائي غشاء (CAM) الفحص بمثابة طعم أجنبي نموذج فعال لسرطان الكبد

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

تقييم تخثر البلازما في أنسجة الكبد في نموذج حيوانات كبيرة في فيفو

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

نموذج حيوانات صغيرة من نضح الكبد نورموثيرميك السابقين فيفو

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

نموذج زراعة الأنسجة فيفو السابقين لمضاعفات فيبروفاسكولار في اعتلال الشبكية السكري التكاثري

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

كلوريد الفينيل وحمية عاليه الدسم كنموذج للتفاعل مع البيئة والسمنة

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

الدقة قص شرائح الرئة كأداة فعالة لهيكل الأوعية الرئوية في الجسم الحي السابق ودراسات الانقباض

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...