Name: murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology
Uploaded: 2020-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australien (Grant No. APP1048740 og APP1142394 til G.A.R.; APP1160323 til J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm støttes af et Senior Research Fellowship fra NHMRC of Australia (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo blev støttet af TALENTO-programmet i Madrid, Spanien (T1-BIO-1854).

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med den australske kode for pasning og anvendelse af dyr til videnskabelige formål på QIMR Berghofer Medical Research Institute med godkendelse fra instituttets dyreetiske komité. Mandlige C57BL/6 mus (15−20 uger gamle) blev fremstillet fra Animal Resources Centre, WA, Australien.
BEMÆRK: Alle opløsninger, medier, instrumenter, hardware og rør, der kommer i kontakt med prøverne, skal steriliseres eller desinficeres grundigt med en 70 % ...

<ol>
	<li>Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Insight+into+the+Role+of+Fibrosis+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis-Related+Hepatocellular+Carcinoma.">Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).</li><li>Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+liver+progenitor+cells+during+liver+regeneration,+fibrogenesis,+and+carcinogenesis.">The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).</li><li>Ouchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Steatohepatitis+in+Humans+with+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoids.">Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids.</a> Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).</li><li>Vickers, A. E., Fisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+slices+for+the+evaluation+of+human+drug+toxicity.">Organ slices for the evaluation of human drug toxicity.</a> Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).</li><li>Olinga, P., Schuppan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+liver+slices:+a+tool+to+model+the+liver+ex+vivo.">Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo.</a> Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).</li><li>Paish, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bioreactor+Technology+for+Modeling+Fibrosis+in+Human+and+Rodent+Precision-Cut+Liver+Slices.">A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices.</a> Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).</li><li>Prins, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pathophysiological+Model+of+Non-Alcoholic+Fatty+Liver+Disease+Using+Precision-Cut+Liver+Slices.">A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices.</a> Nutrients. 11 (3), 507 (2019).</li><li>Ramm, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrogenesis+in+pediatric+cholestatic+liver+disease:+role+of+taurocholate+and+hepatocyte-derived+monocyte+chemotaxis+protein-1+in+hepatic+stellate+cell+recruitment.">Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment.</a> Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).</li><li>Pozniak, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taurocholate+Induces+Biliary+Differentiation+of+Liver+Progenitor+Cells+Causing+Hepatic+Stellate+Cell+Chemotaxis+in+the+Ductular+Reaction:+Role+in+Pediatric+Cystic+Fibrosis+Liver+Disease.">Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease.</a> The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).</li><li>Clouzeau-Girard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+bile+acids+on+biliary+epithelial+cell+proliferation+and+portal+fibroblast+activation+using+rat+liver+slices.">Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices.</a> Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).</li><li>Szalowska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oxygen+concentration+and+selected+protocol+factors+on+viability+and+gene+expression+of+mouse+liver+slices.">Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices.</a> Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).</li><li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+precision-cut+liver+slices+(PCLS):+a+new+tool+for+studying+tumor+microenvironments+and+cell+signaling+ex+vivo.">Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo.</a> Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).</li><li>Granitzny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+high+quality+rat+precision+cut+liver+slices+during+culture+to+study+hepatotoxic+responses:+Acetaminophen+as+a+model+compound.">Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound.</a> Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+human+liver+slice+cultures+as+an+immunological+platform.">Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform.</a> Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).</li><li>Zarybnicky, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-Individual+Variability+in+Acute+Toxicity+of+R-Pulegone+and+R-Menthofuran+in+Human+Liver+Slices+and+Their+Influence+on+miRNA+Expression+Changes+in+Comparison+to+Acetaminophen.">Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).</li><li>van de Bovenkamp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+liver+slices+as+a+new+model+to+study+toxicity-induced+hepatic+stellate+cell+activation+in+a+physiologic+milieu.">Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu.</a> Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).</li><li>Buettner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+analysis+of+hepatic+glucose+output+and+insulin+action+using+a+liver+slice+culture+system.">Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system.</a> Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).</li><li>Lagaye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-hepatitis+C+virus+potency+of+a+new+autophagy+inhibitor+using+human+liver+slices+model.">Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model.</a> World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).</li><li>Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+model+for+studying+hepatic+schistosomiasis+and+the+effect+of+released+protein+from+dying+eggs.">An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).</li><li>Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+acts+as+a+hepatoprotectant+in+carbofuran+treated+rat+liver+slices+in+vitro.">Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro.</a> Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).</li><li>Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+xenobiotic-induced+DNA+damage+by+the+comet+assay+applied+to+human+and+rat+precision-cut+liver+slices.">Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices.</a> Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).</li><li>van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+fibrotic+rat+liver+slices+as+a+new+model+to+test+the+effects+of+anti-fibrotic+drugs+in+vitro.">Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro.</a> Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).</li><li>Guyot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrogenic+cell+phenotype+modifications+during+remodelling+of+normal+and+pathological+human+liver+in+cultured+slices.">Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices.</a> Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).</li><li>Bigaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+organ-specific+features+of+fibrogenesis+using+murine+precision-cut+tissue+slices.">Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices.</a> Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).</li><li>Kiziltas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+in+pathophysiology+of+liver+diseases.">Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases.</a> World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).</li><li>Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+as+targets+in+chronic+liver+diseases.">Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases.</a> Gut. 58 (5), 704-720 (2009).</li><li>Finot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Stimulation+with+the+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+and+the+Epidermal+Growth+Factor+Promotes+the+Proliferation+of+Hepatocytes+in+Rat+Liver+Cultured+Slices.">Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices.</a> International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).</li><li>Marshall, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+between+hepatocyte+G1+arrest,+impaired+hepatic+regeneration,+and+fibrosis+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection.</a> Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).</li><li>Alpini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+feeding+increased+proliferative+activity+and+apical+bile+acid+transporter+expression+in+both+small+and+large+rat+cholangiocytes.">Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes.</a> Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).</li><li>Studer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugated+bile+acids+activate+the+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+in+primary+rodent+hepatocytes.">Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes.</a> Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).</li></ol>

Protokollen viser anvendelsen af murine PCLS isolation og væv kultur, og procedurerne er designet til at vurdere både levedygtighed og nytte samt undersøge virkningerne af udefrakommende mediatorer af leverenpatobiologi ved hjælp af biokemiske assays, histologi, og qPCR. Den eksperimentelle nytte af PCLS vævkultur hos gnavere og mennesker er blevet påvist i en bred vifte af applikationer, herunder eksperimentelle undersøgelser i microRNA15/RNA9/ protein udtryk<sup cl...

Patogenesen af de fleste kroniske leversygdomme (dvs. viral hepatitis, ikke-alkoholiske steatohepatitis, cholestatisk leverskade og leverkræft) indebærer komplekse interaktioner mellem flere forskellige levercelletyper, der driver inflammation, fibrogenesis, og kræft udvikling1,2. For at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse kroniske leverbaserede sygdomme, skal samspillet mellem flere levercelletyper undersøges. Mens flere hepatiske cellelinjer (og for nylig, organoids) kan dyrkes in vitro, disse modeller ikke præcist efterligne den komplekse struktur, funktion, og cellulære mangfoldighed af leveren mikromiljø3. Desuden kan dyrkede leverceller (især transformerede cellelinjer) afvige fra deres oprindelige kildebiologi. Dyremodeller anvendes eksperimentelt til at undersøge samspillet mellem flere levercelletyper. De kan dog blive betydeligt reduceret i mulighederne for eksperimentel manipulation på grund af betydelige off-target-virkninger i ekstrahepatiske organer (f.eks. ved test af potentielle terapeutiske).
Brugen af præcisionsskårne leverskiver (PCLS) i vævskultur er en eksperimentel teknik, der første gang anvendes i lægemiddelmetabolisme- og toksicitetsundersøgelser, og det indebærer skæring af levedygtige, ultratynde (ca. 100−250 μm tykke) leverskiver. Dette muliggør direkte eksperimentel manipulation af levervæv ex vivo4. Teknikken bygger bro mellem in vivo-dyreforsøg og in vitro-cellekulturmetoder og overvinder mange ulemper ved begge metoder (dvs. praktiske grænser for de forskellige forsøgsforsøg, der kan udføres hos hele dyr samt tab af struktur/funktion og cellulær mangfoldighed med in vitro-cellekulturmetoder).
Desuden øger PCLS forsøgskapaciteten betydeligt sammenlignet med hele dyreforsøg. Som en mus kan producere mere end 48 leverskiver, Dette letter også brugen af både kontrol og behandling grupper fra samme lever. Desuden adskiller teknikken fysisk levervævet fra andre organsystemer; Den fjerner derfor potentielle off-target-effekter, der kan opstå hos hele dyr, når virkningerne af udefrakommende stimuli testes.
I denne protokol genereres PCLS ved hjælp af en vibratome med en sideværts vibrerende klinge. Andre undersøgelser har med succes brugt en Krumdieck væv pålægsmaskine, som beskrevet i Olinga og Schuppan5. I vibratomen forhindrer lateral vibration af klingen at rive det ultratynde væv på grund af forskydningsstress, da klingen skubbes ind i vævet. Både vibratome og Krumdieck væv pålægsmaskine arbejde effektivt uden strukturel indlejring af levervæv, som strømliner udskæring procedure. Denne teknik kan også bruges til at skabe PCLS fra syge lever, herunder dem fra musemodeller af fibrose/ skrumpelever6 og leversteatose7.
Ud over at demonstrere de teknikker, der er nødvendige for fremstilling og vævskultur af PCLS, undersøger denne rapport også levedygtigheden af disse ex vivo-væv ved at måle adenosintrifosfat (ATP) niveauer og undersøge vævhistologi til vurdering af nekrose og fibrose. Som en repræsentativ eksperimentel procedure behandles PCLS med patofysiologiske koncentrationer af tre forskellige galdesyrer (glykocholic, taurocholic og cholic syrer) for at simulere cholestatisk leverskade. I forbindelse med kolestatisk leverskade har især taurocholic syre vist sig at være signifikant forøget i både serum og galde hos børn med cystisk fibroserelateret leversygdom8.
Leverstamceller er også blevet behandlet in vitro med taurocholic syre for at simulere de forhøjede taurocholic syreniveauer observeret hos patienter, og denne behandling forårsagede øget spredning og differentiering af leverstamceller mod en galde (cholangiocyt) fænotype9. Efterfølgende blev PCLS behandlet ex vivo med forhøjede niveauer af taurocholic syre, og øget cholangiocyt markører blev observeret. Dette understøtter in vitro observation, at taurocholic syre drev galdespredning og / eller differentiering i forbindelse med pædiatriske cystisk fibrose-associeret leversygdom9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri Dish</td>
			<td>GREINER</td>
			<td>664160</td>
			<td>Sterile Dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol Solution (made with AR Grade)</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>EA043-20L-P</td>
			<td>Disinfection solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>AA008-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1129-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate Super Glue</td>
			<td>Parfix, DuluxGroup (Australia)</td>
			<td></td>
			<td>Other brands should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Single Edge Safety Razor Blades</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Board</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td>Sterile material over polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare Australia Pty Ltd</td>
			<td>SH30084.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps sharp point 130 mm long</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MET2115-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycocholic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2878-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOLATE II RNA Mini Kit</td>
			<td>Bioline (Aust) Pty Ltd</td>
			<td>BIO-52073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 50 ml</td>
			<td>Provet</td>
			<td>KETAI1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K3753</td>
			<td>Can also be made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hepa air filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picro Sirius Red</td>
			<td>ABCAM Australia Pty Ltd</td>
			<td>ab246832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 1000 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 10 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 200 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 20 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000669-PR240-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protractor</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td>To measure blade angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block</td>
			<td>Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Holder</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bioline (Aust) PTY LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Paintbrush with Plastic Handle</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td>Plastic handle resists ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square-Head Foreceps</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50 ml Plastic Tubes</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Clamps</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Forceps</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Pins</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurochoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-4009-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-NVSLM1</td>
			<td>With thermoelectric cooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams Medium E</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>12551032</td>
			<td>2.0 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 100 mg/mL 50 mL</td>
			<td>Provet</td>
			<td>XYLAZ4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology

Forståelse af mekanismerne i leverskader, leverfibrose, og skrumpelever, der ligger til grund for kroniske leversygdomme (dvs. viral hepatitis, ikke-alkoholiske fedtlever sygdom, metabolisk leversygdom, og leverkræft) kræver eksperimentel manipulation af dyremodeller og in vitro-cellekulturer. Begge teknikker har begrænsninger, såsom kravet om et stort antal dyr til in vivo manipulation. In vitro-cellekulturer gengiver dog ikke strukturen og funktionen af det flercellede levermiljø. Brugen af præcision-cut leverskiver er en teknik, hvor ensartede skiver af levedygtige muselever opretholdes i laboratoriet væv kultur for eksperimentel manipulation. Denne teknik indtager en eksperimentel niche, der eksisterer mellem dyreforsøg og in vitro celle kultur metoder. Den præsenterede protokol beskriver en enkel og pålidelig metode til at isolere og kultur præcision-cut leverskiver fra mus. Som en anvendelse af denne teknik, ex vivo leverskiver behandles med galdesyrer til at simulere cholestatisk leverskade og i sidste ende vurdere mekanismerne i hepatisk fibrogenese.

For at bestemme pcls' levedygtighed over tid blev der målt atfastsætte ATP-vævsniveauer. ATP-niveauerne er typisk proportionale med levedygtigheden. PCLS (ca. 15 mm2 i området) blev dyrket i normale William's E medium med 10% FBS, derefter på bestemte tidspunkter, leverskiver blev fjernet fra vævkultur og homogeniseret med både ATP og protein (for normalisering) koncentrationer (<a href="https://www.jove.com/pdf-materials/60992?refresh=1" target="_blank">Tabel af materialer</a>) måles ...

Watch this Scientific Journal Video about Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology at JoVE.com

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Denne protokol giver en enkel og pålidelig metode til produktion af levedygtige præcision-cut leverskiver fra mus. Ex vivo vævsprøver kan opretholdes under laboratorievæv kultur betingelser for flere dage, hvilket giver en fleksibel model til at undersøge leveren patobiologi.

Murine Precision-Cut Lever skiver som en Ex Vivo Model af leverbiologi

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Denne video viser produktion og anvendelse af præcision-cut lever skiver som en eksperimentel ex vivo model af levervæv biologi. Præcisionsskårne leverskiver indtager en eksperimentel niche, der eksisterer mellem in vivo dyreforsøg og in vitro cellekultur metoder. Denne teknik har flere vigtige fordele i forhold til in vivo dyreforsøg, herunder evnen til at bruge kontrol og behandling prøver fra samme lever, isolering af levervæv til at fjerne off-target effekter fra andre organsystemer, og evnen til at bruge reagenser, der kan have en negativ effekt, hvis de anvendes på en hel levende mus, for eksempel, giftige vej hæmmere.Teknikken indebærer at bruge en sidemalisk vibrerende klinge til at skære ultra-tynde, lever skiver af levedygtige levervæv efterfulgt af laboratorium væv kultur. Vibrationerne på klingen forhindrer rivning forårsaget af forskydningsstress. I dette eksempel vil vi vise teknikker til præparater af levedygtige ex vivo lever skiver, og demonstrere nytten af lever skive kultur i eksempel eksperimenter, hvor denne ex vivo væv behandles med galdesyrer til at stimulere cholestatic leverskade at vurdere mekanismerne i hepatisk fibrogenesis.Sæt klingen ind i skærearmen. Desinficere klingen og skærearmen med en 70% ethanol opløsning. Vær altid omhyggelig med at undgå kontakt med klingen.Desinficere bufferbakken med en 70% ethanol opløsning, og tør med et sterilt væv. Sæt bufferbakken i vibratomen, og stram monteringsskruen. Indstil skærearmen til den maksimale tilgængelige højde.Tjek klingevinklen. På vores vibratome bruger vi en 10-graders vinkel fra vandret, med klingen skrånende ned mod prøven. Sørg for, at klingevinklen er tæt fastgjort.Prøveholderen desinficeres igen med en 70% ethanolopløsning. Tilslut kølevandet til peltierterokriske køleren, der er placeret under bufferbakken. Nogle vibratome modeller bruger et isbad til køling i stedet.Fastgør vand-out rør til et afløb, og tænde for vandet. Indstil køleren til fire grader Celsius. Tilføj iskold Krebs-Henseleit buffer til bufferbakken.Alle kirurgiske instrumenter og materialer skal være sterile. Mus bør være dybt bedøvet eller aflivet. Hudoverflader på musene blev desinficeret ved befugtning med 70% ethanol opløsning.Lav en midterlinje snit ind i huden fra bunden af bughulen til mellemgulvet. Brug rene sniver og saks, åbne bughulen. Fjern leveren hurtigt, uden at beskadige lapperne.Skub leveren nedad, og skær bindevævet i toppen af leveren. Skub leveren opad. Hold det midterste vaskulære område af leveren med snævrerne og træk opad.Skær bindevæv blodkar. Pas på ikke at beskadige leverlapper, og også passe på ikke at skære ind i mave-tarmkanalen. Placer den fjernede lever i en steril skål af iskold Krebs-Henseleit buffer.Adskalle leveren i de enkelte lapper. Vælg en leverlap og placer flad side ned på en ny steril skål. Hold andre lapper på is i Krebs-Henseleit buffer.Trim kanterne af leveren lapper. Trimning er vigtig, især ved den kant, der vil komme i kontakt med skærebladet først, da en vævskant, der er relativt vinkelret på skærebladet, vil forhindre vævskompression, der kan forekomme ved lavvandede vinkler. Skæring af væv omkring de tre andre kanter fjerner meget af de fibrøse kapsler på vævskanten, og typisk giver lettere fjernelse af væv skiver.Anlæder et tyndt lag cyanoacrylatlim på prøveholderens forkant, lidt større end de trimmede leverlapper. Fjern eventuelle rester af buffer fra vævet ved hjælp af sterilt absorberende materiale. Placer leverklappen på cyanoacrylat lim, med den største kant vender mod forsiden.Lad det helbrede i luften i et til to minutter. Anbring det væv, der er fastgjort til prøveholderen, i vibratomen. Indstil vibratomhastigheden.Sænk klingen, indtil den er placeret lige over leverlappen. Den vibrerende skærearm køres over prøven. Vibrationer af klingen på denne maskine aktiveres af fodpedalen.Vend klingen bagud, og sænk klingehøjden med 250 mikrometer. Gentag denne proces, indtil det øverste lag af væv er fjernet. Kassér de første en eller to skiver, da disse vil indeholde Glissons kapsel, og derfor, vil ikke indeholde meget funktionelt levervæv.At skære lever skiver, langsomt fremme vibrerende klinge ind i vævet ved at dreje håndtaget. Brug en lille pensel til forsigtigt at styre vævet under skæreprocessen. Brug pensel til at afhente den afskårne væv sektion, og derefter placere væv sektion i et sterilt rør, der indeholder Krebs-Henseleit buffer til opbevaring.Når dette rør ikke er i brug, skal det opbevares på is. Nogle af tiden, væv ikke rive under skæreprocessen, men for de fleste formål, vævet er stadig brugbart. Skær vævsskiverne indtil i nærheden af cyanoacrylatlimen.Skær ikke i limen. Gentag med de andre leverlapper, som sidder på is, indtil det nødvendige antal vævsskiver er opnået. For at rengøre prøveholderen skal du enten bruge en kling til at skrabe limvævsblandingen af, eller blandingen kan blødgøres ved hjælp af opløsningsmidler som acetone eller dimethylsulfoxid.I en vævskulturhætte, pipette en ml Williams'E medium indeholdende 10% føtal kvæg serum og antimikrobielle stoffer i en 12-brønd plade. Fjern vævsskiverne ved forsigtigt at hvirvle blandingen og spidse til en steril skål. Skær vævet i en nogenlunde ensartet størrelse.I dette eksempel sigtede vi efter vævsskiver med et overfladeareal omkring 50 millimeter kvadrat. Pas på at undersøge vævsskiverne for konsistens. Mørkere skiver tyder på, at vævstykkelsen øges og skal kasseres.Lettere skiver tyder på tilstedeværelsen af hærdet cyanoacrylat lim, og bør kasseres. Vævsskiver overføres til den 12-brøndplade, der indeholder en milliliter medier. Inkuber leverskiverne under normale vævskulturbetingelser.Hvis det er muligt, bruge metoder til at forbedre ilt tilgængelighed til væv skiver. Dagen efter skal du skifte mediet ved hjælp af en manuel pipette for at forhindre tab af væv ved at suge. De præcisionsskårne leverskiver er nu klar til eksperimentel brug.Til vores anvendelse har vi behandlet leverskiverne med galdesyrer i to dage og homogeniseret i lysisbuffer til messenger RNA-ekstraktion og qPCR-analyse. For at undersøge levedygtigheden af præcisionsskårne leverskiver over tid brugte vi ATP-niveauer som en proxy for celle levedygtighed. ATP-niveauerne blev normaliseret til protein og blev målt på flere tidspunkter efter isolation.ATP-niveauet blev nedsat i de umiddelbare og en time prøver, men dette inddrives med tre timer. Derefter blev ATP-niveauerne opretholdt i fem dage, selv om de trendede nedad over tid. H&E farvning blev brugt til at undersøge præcisionsskårne leverskiver, der blev opretholdt i kulturen i op til fem dage.Væv morfologi var tyder på nogle nekrose forekommer på dag to, med svær nekrose sker ved dag fem. På grund af nekrose sker mellem dag to og fem, vil vi anbefale den eksperimentelle nytte af denne teknik er begrænset til omkring tre dage. Men, Dette kunne forbedres ved hjælp af bedre ilt levering teknikker til væv skiver.Præcisionsskårne leverskiver synes også at have fortykkelse af kollagenfibre i forhold til tid i kultur. Dette tyder på spontane fibrogene processer, der forekommer. I eksempel eksperimentet, den præcision-cut lever skiver blev behandlet med tre separate galdesyrer i to dage, at efterligne levercholestasis.Ser man på mRNA-ekspressionen af tre cholangiocyt-specifikke gener, øgede de to konjugerede galdesyrer, glykolsyrer og taurocholicsyre, ekspressionen af både cytokeratin-19 og connexin-43 betydeligt. Dette er i overensstemmelse med cholangiocyte udvikling. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan du opretter præcision-cut lever skiver, og hvordan man udfører grundlæggende væv kultur.Præcisionsskårne leverskiver kan bruges til en meget bred vifte af anvendelser, herunder eksperimentelle undersøgelser i RNA-ekspression, proteinudtryk, epigenetik, DNA-binding, stofskifte, infektionsmekanismer, kræftinvasion, farmakologi, cellebiologi og sekretionsundersøgelser, for blot at nævne nogle få.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

En human<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aterosklerotisk plaque Model til Studieinformationen Læsionssynligheden Biologi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Videomorfometrisk analyse af hypoxisk lungevakolonstring af intrapulmonære arterier ved hjælp af Murine Precision Cut Lung Slices

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Teknik Subnormothermic<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lever Perfusionen til opbevaring, vurdering og reparation af marginale Liver transplantater

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

Den<em&gt; I Ovo</em&gt; Kyllingechorioallantoinmembranen (CAM) Indhold som en effektiv xenograftmodel af hepatocellulært carcinom

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Vurdering af Plasma koagulation på leveren væv i en stor dyremodel In Vivo

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En lille dyremodel af Ex Vivo Normothermic lever Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

En Ex Vivo vævskultur Model for Fibrovascular komplikationer i proliferativ diabetisk retinopati

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

Vinyl klorid og højt fedtindhold kost som en model for miljø og fedme interaktion

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Precision Cut Lung Slices som et effektivt værktøj til Ex vivo Pulmonal Vessel Structure og Contractility Studies

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...