Name: murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology
Uploaded: 2020-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door onderzoekssubsidies van de National Health and Medical Research Council (NHMRC) van Australië (Grant No. APP1048740 en APP1142394 tot G.A.R.; APP1160323 naar J.E.E.T., J.K.O., G.A.R.). Grant A. Ramm wordt ondersteund door een Senior Research Fellowship van het NHMRC van Australië (Grant No. APP1061332). Manuel Fernandez-Rojo werd ondersteund door het TALENTO programma van Madrid, Spanje (T1-BIO-1854).

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Australische code voor de verzorging en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden op QIMR Berghofer Medical Research Institute met goedkeuring van het instituut dier ethiek comite. Mannelijke C57BL/6 muizen (15−20 weken oud) werden verkregen uit het Animal Resources Centre, WA, Australië.
OPMERKING: Alle oplossingen, media, instrumenten, hardware en buizen die contact opnemen met de monsters moeten worden gesterilis...

<ol>
	<li>Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Insight+into+the+Role+of+Fibrosis+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis-Related+Hepatocellular+Carcinoma.">Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).</li><li>Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+liver+progenitor+cells+during+liver+regeneration,+fibrogenesis,+and+carcinogenesis.">The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).</li><li>Ouchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Steatohepatitis+in+Humans+with+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoids.">Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids.</a> Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).</li><li>Vickers, A. E., Fisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+slices+for+the+evaluation+of+human+drug+toxicity.">Organ slices for the evaluation of human drug toxicity.</a> Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).</li><li>Olinga, P., Schuppan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+liver+slices:+a+tool+to+model+the+liver+ex+vivo.">Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo.</a> Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).</li><li>Paish, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bioreactor+Technology+for+Modeling+Fibrosis+in+Human+and+Rodent+Precision-Cut+Liver+Slices.">A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices.</a> Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).</li><li>Prins, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pathophysiological+Model+of+Non-Alcoholic+Fatty+Liver+Disease+Using+Precision-Cut+Liver+Slices.">A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices.</a> Nutrients. 11 (3), 507 (2019).</li><li>Ramm, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrogenesis+in+pediatric+cholestatic+liver+disease:+role+of+taurocholate+and+hepatocyte-derived+monocyte+chemotaxis+protein-1+in+hepatic+stellate+cell+recruitment.">Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment.</a> Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).</li><li>Pozniak, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taurocholate+Induces+Biliary+Differentiation+of+Liver+Progenitor+Cells+Causing+Hepatic+Stellate+Cell+Chemotaxis+in+the+Ductular+Reaction:+Role+in+Pediatric+Cystic+Fibrosis+Liver+Disease.">Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease.</a> The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).</li><li>Clouzeau-Girard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+bile+acids+on+biliary+epithelial+cell+proliferation+and+portal+fibroblast+activation+using+rat+liver+slices.">Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices.</a> Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).</li><li>Szalowska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oxygen+concentration+and+selected+protocol+factors+on+viability+and+gene+expression+of+mouse+liver+slices.">Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices.</a> Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).</li><li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+precision-cut+liver+slices+(PCLS):+a+new+tool+for+studying+tumor+microenvironments+and+cell+signaling+ex+vivo.">Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo.</a> Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).</li><li>Granitzny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+high+quality+rat+precision+cut+liver+slices+during+culture+to+study+hepatotoxic+responses:+Acetaminophen+as+a+model+compound.">Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound.</a> Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+human+liver+slice+cultures+as+an+immunological+platform.">Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform.</a> Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).</li><li>Zarybnicky, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-Individual+Variability+in+Acute+Toxicity+of+R-Pulegone+and+R-Menthofuran+in+Human+Liver+Slices+and+Their+Influence+on+miRNA+Expression+Changes+in+Comparison+to+Acetaminophen.">Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).</li><li>van de Bovenkamp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+liver+slices+as+a+new+model+to+study+toxicity-induced+hepatic+stellate+cell+activation+in+a+physiologic+milieu.">Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu.</a> Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).</li><li>Buettner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+analysis+of+hepatic+glucose+output+and+insulin+action+using+a+liver+slice+culture+system.">Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system.</a> Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).</li><li>Lagaye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-hepatitis+C+virus+potency+of+a+new+autophagy+inhibitor+using+human+liver+slices+model.">Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model.</a> World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).</li><li>Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+model+for+studying+hepatic+schistosomiasis+and+the+effect+of+released+protein+from+dying+eggs.">An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).</li><li>Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+acts+as+a+hepatoprotectant+in+carbofuran+treated+rat+liver+slices+in+vitro.">Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro.</a> Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).</li><li>Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+xenobiotic-induced+DNA+damage+by+the+comet+assay+applied+to+human+and+rat+precision-cut+liver+slices.">Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices.</a> Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).</li><li>van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+fibrotic+rat+liver+slices+as+a+new+model+to+test+the+effects+of+anti-fibrotic+drugs+in+vitro.">Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro.</a> Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).</li><li>Guyot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrogenic+cell+phenotype+modifications+during+remodelling+of+normal+and+pathological+human+liver+in+cultured+slices.">Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices.</a> Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).</li><li>Bigaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+organ-specific+features+of+fibrogenesis+using+murine+precision-cut+tissue+slices.">Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices.</a> Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).</li><li>Kiziltas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+in+pathophysiology+of+liver+diseases.">Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases.</a> World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).</li><li>Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+as+targets+in+chronic+liver+diseases.">Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases.</a> Gut. 58 (5), 704-720 (2009).</li><li>Finot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Stimulation+with+the+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+and+the+Epidermal+Growth+Factor+Promotes+the+Proliferation+of+Hepatocytes+in+Rat+Liver+Cultured+Slices.">Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices.</a> International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).</li><li>Marshall, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+between+hepatocyte+G1+arrest,+impaired+hepatic+regeneration,+and+fibrosis+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection.</a> Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).</li><li>Alpini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+feeding+increased+proliferative+activity+and+apical+bile+acid+transporter+expression+in+both+small+and+large+rat+cholangiocytes.">Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes.</a> Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).</li><li>Studer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugated+bile+acids+activate+the+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+in+primary+rodent+hepatocytes.">Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes.</a> Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).</li></ol>

Het protocol toont de toepassing van murine PCLS isolatie en weefselcultuur, en de procedures zijn ontworpen om zowel levensvatbaarheid en nut te beoordelen, evenals de effecten van exogene bemiddelaars van lever pathobiologie met behulp van biochemische testen, histologie, en qPCR te onderzoeken. Het experimentele nut van PCLS weefselcultuur bij knaagdieren en mensen is aangetoond in een breed scala van toepassingen, waaronder experimentele onderzoeken in microRNA15/RNA9/e...

De pathogenese van de meeste chronische leverziekten (d.w.z. virale hepatitis, niet-alcoholische steatohepatitis, cholestatic leverletsel en leverkanker) omvat complexe interacties tussen meerdere verschillende leverceltypen die ontstekingen, fibrogenese en kankerontwikkelingstimuleren 1,2. Om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan deze chronische leverziekten, moeten de interacties tussen meerdere leverceltypen worden onderzocht. Terwijl meerdere levercellijnen (en meer recent, organoïden) in vitro kunnen worden gekweekt, emuleren deze modellen niet nauwkeurig de complexe structuur, functie en cellulaire diversiteit van de hepatische microomgeving3. Bovendien kunnen gekweekte levercellen (met name getransformeerde cellijnen) afwijken van hun oorspronkelijke bronbiologie. Diermodellen worden experimenteel gebruikt om de interacties tussen meerdere leverceltypen te onderzoeken. Ze kunnen echter aanzienlijk worden verminderd in de ruimte voor experimentele manipulatie, als gevolg van aanzienlijke off-target effecten in extrahepatische organen (bijvoorbeeld bij het testen van potentiële therapieën).
Het gebruik van precisiegesneden leverschijfjes (PCLS) in weefselkweek is een experimentele techniek die voor het eerst wordt gebruikt in medicijnmetabolisme- en toxiciteitsstudies, en het gaat om het snijden van levensvatbare, ultradunne (ongeveer 100-250 μm dikke) leverschijfjes. Dit maakt de directe experimentele manipulatie van leverweefsel ex vivo4mogelijk. De techniek overbrugt een experimentele kloof tussen in vivo dierstudies en in vitro celkweekmethoden, waardoor vele nadelen van beide methoden worden weggenomen (d.w.z. praktische beperkingen op het scala aan experimenten die bij hele dieren kunnen worden uitgevoerd, evenals verlies van structuur/functie en cellulaire diversiteit met in vitro celkweekmethoden).
Bovendien verhoogt PCLS de experimentele capaciteit aanzienlijk in vergelijking met hele dierstudies. Aangezien één muis meer dan 48 leverschijfjes kan produceren, vergemakkelijkt dit ook het gebruik van zowel controle- als behandelingsgroepen uit dezelfde lever. Bovendien scheidt de techniek het leverweefsel fysiek van andere orgaansystemen; daarom verwijdert het potentiële off-target effecten die kunnen optreden bij hele dieren bij het testen van de effecten van exogene stimuli.
In dit protocol worden PCLS gegenereerd met behulp van een vibratoom met een lateraal trillend blad. Andere studies hebben met succes gebruik gemaakt van een Krumdieck weefselsnijmachine, zoals beschreven in Olinga en Schuppan5. In het vibratoom voorkomt laterale trilling van het blad scheuren van het ultradunne weefsel veroorzaakt door schuifspanning, omdat het blad in het weefsel wordt geduwd. Zowel de vibratoom en Krumdieck weefsel snijmachine werken effectief zonder structurele inbedding van leverweefsel, die de snijden procedure stroomlijnt. Deze techniek kan ook worden gebruikt om PCLS te maken van zieke levers, met inbegrip van die van muismodellen van fibrose/cirrose6 en hepatische steatose7.
Naast het aantonen van de technieken die nodig zijn voor de bereiding en weefselkweek van PCLS, onderzoekt dit rapport ook de levensvatbaarheid van deze ex vivo weefsels door het meten van adenosine trifosfaat (ATP) niveaus en het onderzoeken van weefselhistologie om necrose en fibrose te beoordelen. Als representatieve experimentele procedure worden PCLS behandeld met pathofysiologische concentraties van drie verschillende galzuren (glycocholic, taurocholic en choliczuren) om cholestatische leverletsel te simuleren. In de context van cholestatic leverletsel is aangetoond dat met name taurocholiczuur aanzienlijk is toegenomen in zowel het serum als de gal van kinderen met cystische fibrosegeassocieerde leverziekte8.
Levervoorlopercellen zijn ook in vitro behandeld met taurocholiczuur om de verhoogde taurocholiczuurniveaus te simuleren die bij patiënten worden waargenomen, en deze behandeling veroorzaakte verhoogde proliferatie en differentiatie van levervoorlopercellen naar een biliaire (cholangiocyte) fenotype9. Vervolgens werden PCLS ex vivo behandeld met verhoogde niveaus van taurocholiczuur, en verhoogde cholangiocyte markers werden waargenomen. Dit ondersteunt de in vitro observatie die taurocholic zuur stimuleert galproliferatie en / of differentiatie in de context van pediatrische cystische fibrose-geassocieerde leverziekte9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri Dish</td>
			<td>GREINER</td>
			<td>664160</td>
			<td>Sterile Dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol Solution (made with AR Grade)</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>EA043-20L-P</td>
			<td>Disinfection solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>AA008-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1129-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate Super Glue</td>
			<td>Parfix, DuluxGroup (Australia)</td>
			<td></td>
			<td>Other brands should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Single Edge Safety Razor Blades</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Board</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td>Sterile material over polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare Australia Pty Ltd</td>
			<td>SH30084.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps sharp point 130 mm long</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MET2115-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycocholic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2878-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOLATE II RNA Mini Kit</td>
			<td>Bioline (Aust) Pty Ltd</td>
			<td>BIO-52073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 50 ml</td>
			<td>Provet</td>
			<td>KETAI1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K3753</td>
			<td>Can also be made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hepa air filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picro Sirius Red</td>
			<td>ABCAM Australia Pty Ltd</td>
			<td>ab246832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 1000 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 10 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 200 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 20 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000669-PR240-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protractor</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td>To measure blade angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block</td>
			<td>Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Holder</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bioline (Aust) PTY LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Paintbrush with Plastic Handle</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td>Plastic handle resists ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square-Head Foreceps</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50 ml Plastic Tubes</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Clamps</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Forceps</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Pins</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurochoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-4009-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-NVSLM1</td>
			<td>With thermoelectric cooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams Medium E</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>12551032</td>
			<td>2.0 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 100 mg/mL 50 mL</td>
			<td>Provet</td>
			<td>XYLAZ4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology

Inzicht in de mechanismen van leverletsel, leverziekte en leverkanker vereist experimentele manipulatie van diermodellen en in vitro celculturen. Beide technieken hebben beperkingen, zoals de eis van grote aantallen dieren voor in vivo manipulatie. Echter, in vitro cel culturen niet reproduceren de structuur en functie van de meercellige hepatische omgeving. Het gebruik van precisiegesneden leverplakjes is een techniek waarbij uniforme plakjes levensvatbare muislever worden bewaard in laboratoriumweefselkweek voor experimentele manipulatie. Deze techniek neemt een experimentele niche in die bestaat tussen dierstudies en in vitro celkweekmethoden. Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare methode om precisiegesneden leverschijfjes van muizen te isoleren en te kweken. Als toepassing van deze techniek worden ex vivo leverschijfjes behandeld met galzuren om cholestatic leverletsel te simuleren en uiteindelijk de mechanismen van leverfibrogenese te beoordelen.

Om de levensvatbaarheid van PCLS in de loop van de tijd te bepalen, werden weefsel ATP-niveaus gemeten. ATP-niveaus zijn doorgaans evenredig aan de levensvatbaarheid. PCLS (ongeveer 15 mm2 in gebied) werden gekweekt in normale William's E medium met 10% FBS, vervolgens op specifieke tijdpunten, lever plakjes werden verwijderd uit weefselcultuur en gehomogeniseerd met zowel ATP en eiwit (voor normalisatie) concentraties<a href="https://www.jove.com/pdf-materials/60992?refresh=1" target="_blank">(Tabel m...

Watch this Scientific Journal Video about Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology at JoVE.com

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode voor de productie van levensvatbare precisiegesneden leverschijfjes van muizen. De ex vivo weefselmonsters kunnen meerdere dagen onder laboratoriumweefselkweekomstandigheden worden bewaard, wat een flexibel model biedt om leverpathobiologie te onderzoeken.

Murine Precision-Cut Lever Plakjes als een Ex Vivo Model van leverbiologie

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Deze video toont de productie en toepassing van precisie-gesneden lever plakjes als een experimenteel ex vivo model van leverweefsel biologie. Precisiegesneden leversegmenten bezetten een experimentele niche die bestaat tussen in vivo dierstudies en in vitro celkweekmethoden. Deze techniek heeft verschillende belangrijke voordelen ten opzichte van in vivo dierstudies, waaronder de mogelijkheid om controle- en behandelingsmonsters uit dezelfde lever te gebruiken, de isolatie van leverweefsel om off-target effecten uit andere orgaansystemen te verwijderen, en de mogelijkheid om reagentia te gebruiken die een negatief effect kunnen hebben als ze worden toegepast op een hele levende muis, bijvoorbeeld toxische routeremmers.De techniek omvat het gebruik van een lateraal trillend mes te snijden ultra-dunne, lever plakjes van levensvatbare leverweefsel, gevolgd door laboratoriumweefsel cultuur. De trillingen van het mes voorkomen scheuren veroorzaakt door schuinspanning. In dit voorbeeld tonen we de technieken voor preparaten van levensvatbare ex vivo leverplakjes en tonen we het nut van leversegmentcultuur in voorbeeldexperimenten waarbij dit ex vivo weefsel wordt behandeld met galzuren om cholestatische leverletsel te stimuleren om de mechanismen van leverfibrogenese te beoordelen.Steek het mes in de snijarm. Desinfecteer het mes en de snijarm met een 70% ethanoloplossing. Wees altijd voorzichtig om contact met het mes te vermijden.Desinfecteer de bufferlade met een 70% ethanoloplossing en veeg af met een steriel weefsel. Steek de bufferlade in het vibratome en draai de montageschroef aan. Stel de snijarm op de maximaal beschikbare hoogte.Controleer de bladhoek. Op onze vibratome gebruiken we een hoek van 10 graden van horizontaal, waarbij het blad naar beneden schuin naar het monster loopt. Zorg ervoor dat de bladhoek stevig vast is.Desinfecteer de monsterhouder opnieuw met een 70%ethanoloplossing. Sluit het koelwater aan voor de Peltier thermo-elektrische koeler, die zich onder de bufferlade bevindt. Sommige vibratome modellen gebruiken een ijsbad voor koeling in plaats daarvan.Bevestig de waterbuis aan een afvoer, en zet het water. Zet de koeler op vier graden Celsius. Voeg ijskoude Krebs-Henseleit buffer toe aan de bufferbak.Alle chirurgische instrumenten en materialen moeten steriel zijn. Muizen moeten diep verdoofd of geëuthanaseerd worden. Huidoppervlakken op de muizen werden gedesinfecteerd door bevochtiging met 70% ethanoloplossing.Maak een middellijn incisie in de huid van de basis van de buikholte naar het middenrif. Open met behulp van schone tangen en scharen de buikholte. Verwijder de lever snel, zonder beschadiging van de lobben.Duw de lever naar beneden, en snijd het bindweefsel aan de bovenkant van de lever. Duw de lever omhoog. Houd het centrum vasculaire gebied van de lever met de tangen en trek omhoog.Snijd bindweefsel bloedvaten. Zorg ervoor dat de leverlellen niet worden beschadigd en zorg er ook voor dat ze niet in het maag-darmkanaal snijden. Plaats de verwijderde lever in een steriele schotel van ijskoude Krebs-Henseleit buffer.Scheid de lever in individuele lobben. Selecteer een leverkwab en plaats platte kant naar beneden op een nieuwe steriele schotel. Houd andere lobben op ijs in Krebs-Henseleit buffer.Snijd de randen van de leverkwabben. Trimmen is belangrijk, met name aan de rand die het snijmes eerst zal contacteren, omdat het hebben van een weefselrand die relatief loodrecht staat op het snijblad weefselcompressie zal voorkomen die onder ondiepe hoeken kan optreden. Het snijden van het weefsel rond de andere drie randen verwijdert veel van de vezelige capsules aan de weefselrand, en meestal maakt het gemakkelijker verwijderen van de weefselschijfjes.Plaats een dunne laag cyanoacrylaatlijm op de voorkant van de monsterhouder, iets groter dan de bijgesneden leverkwabben. Verwijder eventuele resten van de buffer uit het weefsel met behulp van steriel absorberend materiaal. Plaats leverkwab op cyanoacrylaatlijm, met de grootste rand naar voren gericht.Laat een tot twee minuten in de lucht genezen. Plaats het weefsel dat aan de monsterhouder is bevestigd in het vibratome. Stel de vibratomesnelheid in.Laat het snijmes zakken tot het zich net boven de leverkwab bevindt. Voer de trillende snijarm over het monster. Trillingen van het mes op deze machine worden geactiveerd door het voetpedaal.Breng het blad naar achteren terug en verlaag de bladhoogte met 250 micrometer. Herhaal dit proces totdat de bovenste laag van weefsel is verwijderd. Gooi de eerste een of twee plakjes, omdat deze glisson's capsule bevatten, en daarom zal niet veel functioneel leverweefsel bevatten.Om leverplakjes te snijden, schuif het trillende mes langzaam vooruit in het weefsel door het handvat te draaien. Gebruik een kleine kwast om het weefsel voorzichtig te begeleiden tijdens het snijproces. Gebruik de penseel op te halen het gesneden weefsel sectie, en plaats de weefselsectie in een steriele buis met Krebs-Henseleit buffer voor opslag.Wanneer u niet in gebruik bent, houdt u deze buis op ijs. Een deel van de tijd scheurt het weefsel tijdens het snijproces, maar voor de meeste doeleinden is het weefsel nog steeds bruikbaar. Snijd de plakjes weefsel tot in de buurt van de cyanoacrylaat lijm.Snij niet in de lijm. Herhaal dit met de andere leverkwabben, die op ijs zitten, totdat het vereiste aantal weefselschijfjes is verkregen. Om de monsterhouder schoon te maken, gebruikt u een mes om het lijmweefselmengsel af te schrapen, of het mengsel kan worden verzacht met behulp van oplosmiddelen zoals aceton of dimethylsulfoxide.In een weefselkweekkap, pipet een mL van Williams'E medium met 10% foetale runder serum en antimicrobiële stoffen in een 12-put plaat. Verwijder de plakjes weefsel door zachtjes wervelen het mengsel en tip in een steriele schotel. Snijd het weefsel in een ongeveer uniforme grootte.In dit voorbeeld mikten we op weefselschijfjes met een oppervlakte van ongeveer 50 millimeter vierkant. Zorg ervoor dat de weefselschijfjes onderzoeken op consistentie. Donkere plakjes suggereren dat de weefseldikte wordt verhoogd en moet worden weggegooid.Lichtere plakjes suggereren de aanwezigheid van genezen cyanoacrylaatlijm en moeten worden weggegooid. Breng de weefselschijfjes over op de 12-putplaat met een milliliter media. Incubeer de lever plakjes onder normale weefsel kweekomstandigheden.Gebruik indien mogelijk methoden om de zuurstofbeschikbaarheid van de weefselschijfjes te verbeteren. Op de dag na, verander de media met behulp van een handmatige pipet om verlies van weefsel door zuigkracht te voorkomen. De precisiegesneden leverplakjes zijn nu klaar voor experimenteel gebruik.Voor onze toepassing hebben we de leversegmenten twee dagen met galzuren behandeld en gehomogeniseerd in lysebuffer voor messenger RNA-extractie en qPCR-analyse. Om de levensvatbaarheid van precisiegesneden leverplakjes na verloop van tijd te onderzoeken, gebruikten we ATP-niveaus als een proxy voor cel levensvatbaarheid. ATP-niveaus werden genormaliseerd tot eiwit, en werden gemeten op meerdere tijdstippen na de isolatie.Atp niveaus werden verminderd in de onmiddellijke en een uur monsters, maar dit hersteld met drie uur. Hierna werden de ATP-niveaus gedurende vijf dagen gehandhaafd, hoewel ze in de loop van de tijd naar beneden trendden. H&E-kleuring werd gebruikt om precisiegesneden leverplakjes te onderzoeken die tot vijf dagen in de cultuur werden bewaard.Weefselmorfologie was suggestief voor enige necrose die zich op dag twee voordeed, met ernstige necrose die op dag vijf plaatsvond. Vanwege de necrose die plaatsvindt tussen dag twee en vijf, raden we aan dat het experimentele nut van deze techniek beperkt is tot ongeveer drie dagen. Echter, Dit kan worden verbeterd door het gebruik van betere zuurstof levering technieken om het weefsel plakjes.Precisie-gesneden lever plakjes lijken ook te hebben verdikking van collageen vezels ten opzichte van de tijd in de cultuur. Dit is suggestief voor spontane fibrogene processen die zich voordoen. In het voorbeeldexperiment werden de precisiegesneden leverplakjes twee dagen lang behandeld met drie afzonderlijke galzuren, om levercholestasis na te bootsen.Kijkend naar de mRNA-expressie van drie cholangiocyten-specifieke genen, de twee geconjugeerde galzuren, glycocholic en taurocholic zuren, aanzienlijk toegenomen de expressie van zowel cytokeratine-19 en connexin-43. Dit komt overeen met de ontwikkeling van cholangiocyten. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe precisie gesneden lever plakjes te maken, en hoe basisweefsel cultuur uit te voeren.Precisiegesneden leversegmenten kunnen worden gebruikt voor een zeer breed scala aan toepassingen, waaronder experimentele onderzoeken in RNA-expressie, eiwitexpressie, epigenetica, DNA-binding, metabolisme, infectiemechanismen, kankerinvasie, farmacologie, celbiologie en afscheidingsstudies, om er maar een paar te noemen.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Een Menselijke<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Atherosclerotische plaque Model naar Letsel Biologie studeren

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Videomorfometrische analyse van hypoxische pulmonale vasoconstrictie van intrapulmonale slagaders met behulp van murineprecisie gesneden longschijfjes

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Techniek van Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Leverperfusie voor de opslag, Assessment, en reparatie van Marginal Lever Enten

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

De<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick chorioallantoïsmembraan (CAM) Assay als een efficiënte xenotransplantaatmodel van Hepatocellular Carcinoom

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Beoordeling van Plasma coagulatie op leverweefsel in een grote diermodel In Vivo

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Een kleine diermodel van Ex Vivo Normothermic lever perfusie

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Een Ex Vivo weefselkweek Model voor Fibrovascular complicaties in proliferatieve diabetische retinopathie

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

Vinyl chloride en vetarm dieet als een model van de interactie van de omgeving en obesitas

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Precisie gesneden longplakken als een efficiënt hulpmiddel voor ex vivo longvatstructuur en contractiliteitsstudies

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...