Name: murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology
Uploaded: 2020-03-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology at JoVE.com

この研究は、オーストラリアの国家保健医療研究評議会(NHMRC)からの研究助成金(グラントNo.)APP1048740およびAPP1142394からG.A.R.へ;APP1160323 から J.E.E.T.、J.K.O.、G.A.R.へ。グラント・A・ラムは、オーストラリアのNHMRC(グラントNo.)のシニア・リサーチ・フェローシップによってサポートされています。APP1061332)。マヌエル・フェルナンデス=ロホは、スペインのマドリード(T1-BIO-1854)のTALENTOプログラムによってサポートされました。

すべての動物実験は、機関動物倫理委員会の承認を得て、QIMRベルクホーファー医学研究所で科学的目的のための動物のケアと使用のためのオーストラリアのコードに従って行われました。雄のC57BL/6マウス(生後15~20週齢)は、オーストラリアのワシントン州動物資源センターから得られた。
注:サンプルに接触するすべてのソリューション、メディア、器具、ハードウェア?...

<ol>
	<li>Sircana, A., Paschetta, E., Saba, F., Molinaro, F., Musso, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Insight+into+the+Role+of+Fibrosis+in+Nonalcoholic+Steatohepatitis-Related+Hepatocellular+Carcinoma.">Recent Insight into the Role of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis-Related Hepatocellular Carcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1745 (2019).</li><li>Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+liver+progenitor+cells+during+liver+regeneration,+fibrogenesis,+and+carcinogenesis.">The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology. 310 (3), 143-154 (2016).</li><li>Ouchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Steatohepatitis+in+Humans+with+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoids.">Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids.</a> Cell Metabolism. 30 (2), 374-384 (2019).</li><li>Vickers, A. E., Fisher, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+slices+for+the+evaluation+of+human+drug+toxicity.">Organ slices for the evaluation of human drug toxicity.</a> Chemico-Biological Interactions. 150 (1), 87-96 (2004).</li><li>Olinga, P., Schuppan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+liver+slices:+a+tool+to+model+the+liver+ex+vivo.">Precision-cut liver slices: a tool to model the liver ex vivo.</a> Journal of Hepatology. 58 (6), 1252-1253 (2013).</li><li>Paish, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bioreactor+Technology+for+Modeling+Fibrosis+in+Human+and+Rodent+Precision-Cut+Liver+Slices.">A Bioreactor Technology for Modeling Fibrosis in Human and Rodent Precision-Cut Liver Slices.</a> Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).</li><li>Prins, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pathophysiological+Model+of+Non-Alcoholic+Fatty+Liver+Disease+Using+Precision-Cut+Liver+Slices.">A Pathophysiological Model of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Using Precision-Cut Liver Slices.</a> Nutrients. 11 (3), 507 (2019).</li><li>Ramm, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrogenesis+in+pediatric+cholestatic+liver+disease:+role+of+taurocholate+and+hepatocyte-derived+monocyte+chemotaxis+protein-1+in+hepatic+stellate+cell+recruitment.">Fibrogenesis in pediatric cholestatic liver disease: role of taurocholate and hepatocyte-derived monocyte chemotaxis protein-1 in hepatic stellate cell recruitment.</a> Hepatology. 49 (2), 533-544 (2009).</li><li>Pozniak, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taurocholate+Induces+Biliary+Differentiation+of+Liver+Progenitor+Cells+Causing+Hepatic+Stellate+Cell+Chemotaxis+in+the+Ductular+Reaction:+Role+in+Pediatric+Cystic+Fibrosis+Liver+Disease.">Taurocholate Induces Biliary Differentiation of Liver Progenitor Cells Causing Hepatic Stellate Cell Chemotaxis in the Ductular Reaction: Role in Pediatric Cystic Fibrosis Liver Disease.</a> The American Journal of Pathology. 187 (12), 2744-2757 (2017).</li><li>Clouzeau-Girard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+bile+acids+on+biliary+epithelial+cell+proliferation+and+portal+fibroblast+activation+using+rat+liver+slices.">Effects of bile acids on biliary epithelial cell proliferation and portal fibroblast activation using rat liver slices.</a> Lab Investigation. 86 (3), 275-285 (2006).</li><li>Szalowska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oxygen+concentration+and+selected+protocol+factors+on+viability+and+gene+expression+of+mouse+liver+slices.">Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices.</a> Toxicology in Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).</li><li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+precision-cut+liver+slices+(PCLS):+a+new+tool+for+studying+tumor+microenvironments+and+cell+signaling+ex+vivo.">Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo.</a> Cell Communication and Signaling. 12, 73 (2014).</li><li>Granitzny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+high+quality+rat+precision+cut+liver+slices+during+culture+to+study+hepatotoxic+responses:+Acetaminophen+as+a+model+compound.">Maintenance of high quality rat precision cut liver slices during culture to study hepatotoxic responses: Acetaminophen as a model compound.</a> Toxicology in Vitro. 42, 200-213 (2017).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+human+liver+slice+cultures+as+an+immunological+platform.">Precision-cut human liver slice cultures as an immunological platform.</a> Journal of Immunological Methods. 455, 71-79 (2018).</li><li>Zarybnicky, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-Individual+Variability+in+Acute+Toxicity+of+R-Pulegone+and+R-Menthofuran+in+Human+Liver+Slices+and+Their+Influence+on+miRNA+Expression+Changes+in+Comparison+to+Acetaminophen.">Inter-Individual Variability in Acute Toxicity of R-Pulegone and R-Menthofuran in Human Liver Slices and Their Influence on miRNA Expression Changes in Comparison to Acetaminophen.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1805 (2018).</li><li>van de Bovenkamp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+liver+slices+as+a+new+model+to+study+toxicity-induced+hepatic+stellate+cell+activation+in+a+physiologic+milieu.">Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu.</a> Toxicology Sciences. 85 (1), 632-638 (2005).</li><li>Buettner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+analysis+of+hepatic+glucose+output+and+insulin+action+using+a+liver+slice+culture+system.">Efficient analysis of hepatic glucose output and insulin action using a liver slice culture system.</a> Hormone and Metabolic Research. 37 (3), 127-132 (2005).</li><li>Lagaye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-hepatitis+C+virus+potency+of+a+new+autophagy+inhibitor+using+human+liver+slices+model.">Anti-hepatitis C virus potency of a new autophagy inhibitor using human liver slices model.</a> World Journal of Hepatology. 8 (21), 902-914 (2016).</li><li>Gobert, G. N., Nawaratna, S. K., Harvie, M., Ramm, G. A., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+model+for+studying+hepatic+schistosomiasis+and+the+effect+of+released+protein+from+dying+eggs.">An ex vivo model for studying hepatic schistosomiasis and the effect of released protein from dying eggs.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (5), 0003760 (2015).</li><li>Jaiswal, S. K., Gupta, V. K., Ansari, M. D., Siddiqi, N. J., Sharma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+C+acts+as+a+hepatoprotectant+in+carbofuran+treated+rat+liver+slices+in+vitro.">Vitamin C acts as a hepatoprotectant in carbofuran treated rat liver slices in vitro.</a> Toxicology Reports. 4, 265-273 (2017).</li><li>Plazar, J., Hreljac, I., Pirih, P., Filipic, M., Groothuis, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+xenobiotic-induced+DNA+damage+by+the+comet+assay+applied+to+human+and+rat+precision-cut+liver+slices.">Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices.</a> Toxicology in Vitro. 21 (6), 1134-1142 (2007).</li><li>van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Meijer, D. K., Olinga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision-cut+fibrotic+rat+liver+slices+as+a+new+model+to+test+the+effects+of+anti-fibrotic+drugs+in+vitro.">Precision-cut fibrotic rat liver slices as a new model to test the effects of anti-fibrotic drugs in vitro.</a> Journal of Hepatology. 45 (5), 696-703 (2006).</li><li>Guyot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrogenic+cell+phenotype+modifications+during+remodelling+of+normal+and+pathological+human+liver+in+cultured+slices.">Fibrogenic cell phenotype modifications during remodelling of normal and pathological human liver in cultured slices.</a> Liver International. 30 (10), 1529-1540 (2010).</li><li>Bigaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+organ-specific+features+of+fibrogenesis+using+murine+precision-cut+tissue+slices.">Exploring organ-specific features of fibrogenesis using murine precision-cut tissue slices.</a> Biochim Biophys Acta - Molecular Basis Disease. 1866 (1), 165582 (2020).</li><li>Kiziltas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+in+pathophysiology+of+liver+diseases.">Toll-like receptors in pathophysiology of liver diseases.</a> World Journal of Hepatology. 8 (32), 1354-1369 (2016).</li><li>Mencin, A., Kluwe, J., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+as+targets+in+chronic+liver+diseases.">Toll-like receptors as targets in chronic liver diseases.</a> Gut. 58 (5), 704-720 (2009).</li><li>Finot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Stimulation+with+the+Tumor+Necrosis+Factor+alpha+and+the+Epidermal+Growth+Factor+Promotes+the+Proliferation+of+Hepatocytes+in+Rat+Liver+Cultured+Slices.">Combined Stimulation with the Tumor Necrosis Factor alpha and the Epidermal Growth Factor Promotes the Proliferation of Hepatocytes in Rat Liver Cultured Slices.</a> International Journal of Hepatology. 2012, 785786 (2012).</li><li>Marshall, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+between+hepatocyte+G1+arrest,+impaired+hepatic+regeneration,+and+fibrosis+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Relation between hepatocyte G1 arrest, impaired hepatic regeneration, and fibrosis in chronic hepatitis C virus infection.</a> Gastroenterology. 128 (1), 33-42 (2005).</li><li>Alpini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acid+feeding+increased+proliferative+activity+and+apical+bile+acid+transporter+expression+in+both+small+and+large+rat+cholangiocytes.">Bile acid feeding increased proliferative activity and apical bile acid transporter expression in both small and large rat cholangiocytes.</a> Hepatology. 34 (5), 868-876 (2001).</li><li>Studer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugated+bile+acids+activate+the+sphingosine-1-phosphate+receptor+2+in+primary+rodent+hepatocytes.">Conjugated bile acids activate the sphingosine-1-phosphate receptor 2 in primary rodent hepatocytes.</a> Hepatology. 55 (1), 267-276 (2012).</li></ol>

このプロトコルは、マウスPCLSの分離および組織培養の適用を実証し、この手順は、生化学的アッセイ、組織学、およびqPCRを使用して、肝病理生物学の外因性メディエーターの影響を評価するとともに、生存率と有用性の両方を評価するように設計されています。齧歯類およびヒトにおけるPCLS組織培養の実験的有用性は、microRNA 15 /RNA9/タンパク発現16、代?...

ほとんどの慢性肝疾患の病因(すなわち、ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、胆管内肝障害および肝臓癌)は、炎症、線維形成、および癌の発症を促進する複数の異なる肝細胞タイプ間の複雑な相互作用を伴う1、2。2これらの慢性肝系疾患の根底にある分子メカニズムを理解するためには、複数の肝細胞タイプ間の相互作用を調べる必要があります。複数の肝細胞株(そして最近ではオルガノイド)はインビトロで培養することができるが、これらのモデルは肝微小環境3の複雑な構造、機能、および細胞多様性を正確にエミュレートしない。さらに、培養した肝細胞(特に形質転換細胞株)は、元の発生源生物学から逸脱する可能性がある。動物モデルは、複数の肝細胞タイプ間の相互作用を調べる実験に使用される。しかし、それらは、肝外器官(例えば、潜在的な治療薬をテストするとき)の有意なオフターゲット効果のために、実験的操作の範囲が有意に減少する可能性がある。
組織培養における精密カット肝スライス(PCLS)の使用は、薬物代謝および毒性研究で最初に使用される実験的技術であり、生き生きと超薄(厚さ約100〜250μm)の肝臓スライスの切断を含む。これは、肝臓組織ex vivo4の直接実験的操作を可能にする。この技術は、生体内動物実験とインビトロ細胞培養法との間の実験的なギャップを埋め、両方の方法の多くの欠点(すなわち、全動物で行うことができる実験の範囲の実用的な限界、ならびにインビトロ細胞培養法による構造/機能および細胞多様性の喪失)を克服する。
さらに、PCLSは、動物実験全体に比べて実験能力を大幅に増加させます。1つのマウスは48以上の肝臓スライスを産生することができるので、これはまた同じ肝臓からの対照群および処置群の両方の使用を促進する。さらに, この技術は、物理的に他の臓器系から肝臓組織を分離します;;したがって、外因性刺激の影響をテストする際に動物全体で起こり得る潜在的なオフターゲット効果を除去する。
このプロトコルでは、PCLSは横振動ブレードを備えたビブラートメを使用して生成されます。他の研究は、正常にクリンガとシュパン5に記載されているように、クルミエック組織スライサーを使用しています。ビブラートメでは、ブレードの横振動は、ブレードが組織に押し込まれるように、せん断応力によって引き起こされる超薄組織の引き裂きを防ぎます。ビブラートームとクルミエック組織スライサーの両方が肝臓組織の構造的な埋め込みなしで効果的に働き、スライス手順を合理化する。この技術はまた、疾患を有する肝臓からPCLSを作成するために使用することができる、 線維症/肝硬変6および肝性ステアトーシス7のマウスモデルからのものを含む。
PCLSの調製および組織培養に必要な技術を実証することに加えて、この報告書は、アデノシン三リン酸(ATP)レベルを測定し、壊死および線維症を評価するために組織組織組織を調べることによって、これらの生体組織の生存率を調べる。代表的な実験手順として、PCLSは、胆汁性肝損傷をシミュレートするために、3つの異なる胆汁酸(グリコリック、タウロコリック、および胆汁酸)の病態生理学的濃度で処理される。胆汁性肝障害の文脈において、特にタウロコリン酸は、嚢胞性線維症関連肝疾患8を有する小児の血清および胆汁の両方において有意に増加することが示されている。
肝臓前駆細胞は、患者において観察されたタウロチョル酸レベルの上昇をシミュレートするためにタウロチョル酸でインビトロで治療されており、この治療は胆管(胆管支面)表現型9に対する肝前駆細胞の増殖および分化の増加を引き起こした。続いて、PCLSは、タウロチョル酸の上昇したレベルでex vivoを処理し、コリンギオサイトマーカーの増加が観察された。これは、タウロチョル酸が小児嚢胞性線維症関連肝疾患の文脈における胆道増殖および/または分化を駆動するというインビトロ観察を支持する9。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm Petri Dish</td>
			<td>GREINER</td>
			<td>664160</td>
			<td>Sterile Dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well Tissue Culture Plate Flat Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol Solution (made with AR Grade)</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>EA043-20L-P</td>
			<td>Disinfection solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply Pty Ltd</td>
			<td>AA008-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1129-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate Super Glue</td>
			<td>Parfix, DuluxGroup (Australia)</td>
			<td></td>
			<td>Other brands should work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Single Edge Safety Razor Blades</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Board</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td></td>
			<td>Sterile material over polystyrene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare Australia Pty Ltd</td>
			<td>SH30084.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps sharp point 130 mm long</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MET2115-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycocholic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2878-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOLATE II RNA Mini Kit</td>
			<td>Bioline (Aust) Pty Ltd</td>
			<td>BIO-52073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 50 ml</td>
			<td>Provet</td>
			<td>KETAI1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs-Henseleit Buffer with Added Glucose 2000 mg/L</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K3753</td>
			<td>Can also be made in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hepa air filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, Liq 100 ml</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picro Sirius Red</td>
			<td>ABCAM Australia Pty Ltd</td>
			<td>ab246832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 1000 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 10 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 200 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips Abt 20 &#181;l Filter Interpath</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>24500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys Homogeniser</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>P000669-PR240-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protractor</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td>To measure blade angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantstudio 5 QPCR Fixed 384 Block</td>
			<td>Applied Biosystems/ ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Holder</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiFAST cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bioline (Aust) PTY LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Paintbrush with Plastic Handle</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td>Plastic handle resists ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square-Head Foreceps</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50 ml Plastic Tubes</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Clamps</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Forceps</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Pins</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Mixed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurochoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-4009-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome SYS-NVSLM1 Motorized Vibroslice</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-NVSLM1</td>
			<td>With thermoelectric cooling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams Medium E</td>
			<td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td>
			<td>12551032</td>
			<td>2.0 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 100 mg/mL 50 mL</td>
			<td>Provet</td>
			<td>XYLAZ4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology

慢性肝疾患(ウイルス性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、代謝性肝疾患、肝臓がんなど)の根源となる肝障害、肝線維症、肝硬変のメカニズムを理解するには、実験的な操作が必要です。動物モデルとインビトロ細胞培養.両方の技術には、生体内操作のための多数の動物の要件などの制限があります。しかし、インビトロ細胞培養は多細胞性肝環境の構造や機能を再現しない。精密カット肝スライスの使用は、実験操作のために実験室組織培養で生き生きとしているマウス肝臓の均一なスライスを維持する技術である。この技術は、動物実験とインビトロ細胞培養法の間に存在する実験的ニッチを占めています。提示されたプロトコルは、マウスから精密カットされた肝臓スライスを分離し、培養するための簡単で信頼性の高い方法を記述しています。この技術の応用として、ex vivo肝スライスは胆汁酸で処理され、胆汁性肝損傷をシミュレートし、最終的には肝線維形成のメカニズムを評価する。

時間の経過に関するPCLSの細胞生存率を決定するために、組織ATPレベルを測定した。ATP レベルは、通常、実行可能性に比例します。PCLS(面積約15mm2)を10%FBSで通常のウィリアムのE培地で培養し、次いで特定の時点で、肝臓スライスを組織培養から除去し、ATPおよびタンパク質(正規化用)濃度(<a href="https://www.jove.com/pdf-materials/60992?refresh=1" target="_blank">材料表</a>)の両方を測定し...

Watch this Scientific Journal Video about Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology at JoVE.com

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

このプロトコルは、マウスから実行可能な精密カット肝スライスを製造するための簡単で信頼性の高い方法を提供します。このエクスビボ組織サンプルは、ラボ組織培養条件下で複数回維持することができ、肝臓病理生物学を調べる柔軟なモデルを提供する。

肝臓生物学のEx Vivoモデルとしてのマウス精密カット肝臓スライス

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

このビデオは、肝臓組織生物学の実験的なex vivoモデルとしての精密カット肝臓スライスの生産と応用を示しています。精密カットの肝臓スライスは、生体内動物実験とインビトロ細胞培養法の間に存在する実験的ニッチを占めています。この技術は、同じ肝臓からの制御および治療サンプルを使用する能力、肝臓組織の単離によって他の臓器系からの標的外効果を除去する能力、および生きているマウス全体に適用された場合に悪影響を及ぼす可能性のある試薬を使用する能力、例えば毒性経路阻害剤など、生体内動物研究におけるいくつかの重要な利点を有する。この技術は、横振動ブレードを使用して、生存可能な肝臓組織の超薄い肝臓スライスを切断し、続いて実験室組織培養を行うことを含む。刃の振動はせん断の圧力によって引き裂くことを防ぐ。この例では、生き生きとしたエビボ肝スライスの調製方法を示し、このex vivo組織を胆汁酸で処理して胆汁性肝損傷を刺激して肝線維形成のメカニズムを評価する実験例で肝臓スライス培養の有用性を示す。刃を切断アームに挿入します。刃と切断アームを70%エタノール溶液で消毒します。ブレードとの接触を避けるように常に注意してください。70%エタノール溶液でバッファートレイを消毒し、滅菌組織で拭きます。バッファートレイをビブラートメに挿入し、取り付けネジを締めます。切断アームを最大の高さに設定します。ブレードの角度を確認します。ビブラートオームでは、水平から10度の角度を使用し、ブレードはサンプルに向かって傾斜しています。ブレードの角度がしっかりと固定されていることを確認します。検体ホルダーを消毒し、再び、70%エタノール溶液で。バッファートレイの下にあるペルチェ熱電冷却器の冷却水を接続します。ビブラートメモデルの中には、冷却用の氷浴を使用するものもあります。水管を排水管に固定し、水をオンにします。クーラーを摂氏4度に設定します。冷たいクレブス-ヘンセレイトバッファーをバッファートレイに追加します。すべての手術器具および材料は無菌でなければなりません。マウスは深く麻酔または安楽死させるべきです。マウス上の皮膚表面は70%エタノール溶液で湿潤することにより、解毒した。腹腔の基部から横隔膜まで、皮膚に中線切開を行います。きれいな鉗子とはさみを使用して、腹腔を開きます。葉を傷つけることなく、肝臓を素早く取り除きます。肝臓を下に押し、肝臓の上部にある結合組織を切断します。肝臓を上に押します。鉗子で肝臓の中央血管領域を保持し、上方に引っ張ります.結合組織の血管を切断します。肝臓の葉に損傷を与えないように注意し、また、胃腸管に切り込まないように注意してください。取り出した肝臓を氷冷クレブス-ヘンセレイトバッファーの無菌皿に入れます。肝臓を個々の葉に分ける。1つの肝臓葉を選択し、新しい滅菌皿の上に平らな側面を置きます。クレブス・ヘンセレイトバッファーの氷の上に他のローブを保管します。肝臓の葉の縁をトリミングします。トリミングは、切断刃に対して比較的垂直な組織エッジを有するように、切断刃を最初に接触させる縁部において特に重要であり、浅い角度で起こり得る組織の圧縮を防ぐ。他の3つの縁の周りの組織を切断すると、組織エッジで繊維状のカプセルの多くを取り除き、通常は組織スライスをより簡単に除去することができます。シアノアクリル酸接着剤の薄い層を標本ホルダーの前端に置き、トリミングされた肝臓葉よりもわずかに大きくする。滅菌吸収物質を使用して組織から緩衝液の任意の残留物を除去する。シアノアクリル酸接着剤の上に肝臓の葉を置き、最大のエッジを前面に向けて配置します。空気中で1〜2分間治癒させます。標本ホルダーに取り付けられた組織をビブラートメに入れる。ビブラートの速度を設定します。切断ブレードを下げて、肝臓の葉のすぐ上に位置します。振動する切断アームをサンプルの上に実行します。この機械の刃の振動はフィートのペダルによって作動する。ブレードを後方に戻し、ブレードの高さを 250 マイクロメートル下げます。組織の最上層が取り除かれるまで、このプロセスを繰り返します。これらはグリソンのカプセルを含むので、最初の1つまたは2つのスライスを捨てるので、あまり機能的な肝臓組織が含まれていません。肝臓のスライスを切断するには、ハンドルを回すことによってゆっくりと振動ブレードを組織に進めます。小さなペイントブラシを使用して、切断プロセス中に組織を優しく導きます。ペイントブラシを使用して切断された組織セクションを拾い、保管のためにクレブス・ヘンセレイトバッファーを含む滅菌チューブに組織セクションを入れます。使用しない場合は、氷の上にこのチューブを保管してください。いくつかの時間は、組織が切断プロセス中に裂け目を行いますが、ほとんどの目的のために、組織はまだ使用できます。シアノクリレート接着剤の近くまで組織スライスを切ります。接着剤に切り込むな。必要な数の組織スライスが得られるまで、氷の上に座っている他の肝臓葉と一緒に繰り返します。検体ホルダを洗浄するには、ブレードを使用して接着剤と組織の混合物を削り取るか、または混合物をアセトンまたはジメチルスルホキシドなどの溶媒を使用して軟化させることができる。組織培養フードでは、10%のウシ胎児血清と抗菌剤を12ウェルプレートに含むウィリアムズE培地のピペット1mLを12ウェルプレートに入す。混合物をそっと渦巻いて組織スライスを取り除き、無菌皿にチップを入れます。組織をほぼ均一なサイズに切ります。この例では、50ミリメートル平方メートル前後の表面積を有する組織スライスを目指した。一貫性のために組織のスライスを調べるのに注意してください。暗いスライスは、組織の厚さが増加していることを示唆し、廃棄する必要があります。軽いスライスは、硬化シアノクリレート接着剤の存在を示唆し、廃棄する必要があります。1ミリリットルの培地を含む12ウェルプレートに組織スライスを移します。正常な組織培養条件下で肝臓スライスをインキュベートする。可能であれば、組織スライスへの酸素の可用性を高める方法を使用します。翌日、吸引による組織の損失を防ぐために手動ピペットを使用して培地を交換する。精密カットの肝臓スライスは、実験的な使用の準備が整いました。我々のアプリケーションでは、2日間胆汁酸で肝臓スライスを処理し、メッセンジャーRNA抽出およびqPCR分析のためにリシス緩衝液で均質化しました。時間の経過に応じて精密カットされた肝臓スライスの生存率を調べるために、細胞生存率の代理としてATPレベルを使用しました。ATPレベルをタンパク質に正規化し、分離後の複数の時点で測定した。ATPレベルは、即時および1時間のサンプルで減少したが、これは3時間回復した。その後、ATPレベルは5日間維持されましたが、時間の経過とともに下降傾向にあります。H&E染色は、培養で最長5日間維持された精密カット肝スライスを調べるために使用された。組織形態は、2日目に発生するいくつかの壊死を示唆し、5日目までに重度の壊死が起こった。壊死は2日目から5日目の間に起こっているので、この技術の実験的有用性は約3日に制限することをお勧めします。しかし、これは組織スライスに対するより良い酸素送達技術を使用することによって増強することができる。精密カットの肝臓スライスは、培養時間に対してコラーゲン繊維の肥厚を有するようにも見える。これは、発生する自発的な線維形成過程の示唆である。実験例では、精密カットされた肝臓スライスを3つの別々の胆汁酸で2日間処理し、肝胆汁胆汁を模倣した。3つの胆管球特異的遺伝子のmRNA発現を見ると、コンジュゲート胆汁酸、グリコチル酸およびタウロコリン酸の2種は、サイトケラチン-19およびコネキシン-43の両方の発現を有意に増加させた。これは、胆管球の開発と一致しています.このビデオを見た後、あなたは精密カット肝臓スライスを作成する方法、および基本的な組織培養を行う方法をよく理解する必要があります。精密カットの肝スライスは、RNA発現、タンパク質発現、エピジェネティクス、DNA結合、代謝、感染メカニズム、がん侵入、薬理学、細胞生物学、分泌研究などの非常に幅広い用途に使用できます。

Research

JoVE Journal

Medicine

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

ヒューマン<em&gt;生体外</em&gt;動脈硬化性プラークのモデルは、病変生物学を研究する

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

マウス精密切り出肺スライスを用いた低酸素肺血管収縮のビデオモルフォメトリクス解析

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Subnormothermicのテクニック<em&gt;生体外</em&gt;肝臓ストレージ、評価のための灌流、およびマージナル肝移植片の修復

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

ザ・<em&gt;卵内</em肝細胞癌の効率的な異種移植モデルとして&gt;ニワトリ絨毛尿膜（CAM）アッセイ

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

プラズマ凝固体内大動物モデルの肝臓組織の評価

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Ex Vivo常温肝灌流の小さな動物モデル

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

増殖糖尿病網膜症における線合併症の体外培養モデル

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

環境と肥満相互作用のモデルとしての塩化ビニルと高脂肪食

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

前生体肺の構造と収縮性研究のための効率的なツールとしての精密切断肺スライス

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...