Name: axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF، 561/11) ومجلس البحوث الأوروبي (ERC، 309377).

تم تنفيذ رعاية الحيوانات وعلاجها في هذا البروتوكول تحت إشراف وموافقة لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة تل أبيب.
1- إعداد MFC
<ol><li>PDMS الصب في القوالب الأولية(الشكل 1)<ol>
<li>شراء أو إنشاء قوالب أولية (رقائق) بعد بروتوكول مفصل9.</li>
		<li>استخدام الهواء المضغوط ...

<ol>
	<li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitostasis+in+Neurons:+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture.">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li><li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease.">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li><li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons.">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).</li><li>Magran&#233;, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li><li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+acidic+intracellular+compartments.">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li><li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration.">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li><li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport,+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether.">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li><li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers.">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li><li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS.">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance.">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ.">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li><li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model.">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 210 (2019).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS.">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li></ol>

في هذا البروتوكول، ونحن نصف نظام لتتبع النقل المحوري للالميتوكوندريا والمقصورات الحمضية في الخلايا العصبية الحركية. يسمح هذا النظام المُبسّط في المختبر بالتحكم الدقيق، والمراقبة، والتلاعب بمقصورات الخلايا العصبية تحت الخلية، مما يتيح إجراء تحليل تجريبي للوظائف المحلية للخلايا العصبي...

MNs هي خلايا مستقطبة للغاية مع محاور عصبية طويلة ، تصل إلى متر واحد طويل في البشر البالغين. وتخلق هذه الظاهرة تحدياً حاسماً للحفاظ على الاتصال بالشبكة ووظيفتها. وبالتالي، تعتمد MNs على النقل السليم للمعلومات والعضيات والمواد على طول المحاور من جسم الخلية إلى المشبك والظهر. يتم نقل المكونات الخلوية المختلفة ، مثل البروتينات والحمض النووي الريبي والعضيات بانتظام من خلال المحاور. الميتوكوندريا هي العضيات الهامة التي يتم نقلها بشكل روتيني في MNs. الميتوكوندريا ضرورية للنشاط السليم ووظيفة MNs ، المسؤولة عن توفير ATP ، تخزين الكالسيوم ، وعمليات الإشارة1،2. النقل المحوري للالميتوكوندريا هو عملية مدروسة جيدا3,4. ومن المثير للاهتمام، وأفادت عيوب في نقل الميتوكوندريا أن تشارك في العديد من الأمراض العصبية وعلى وجه التحديد في الأمراض MN5. المقصورات الحمضية بمثابة مثال آخر للالعضيات الجوهرية التي تتحرك على طول محاور MN. تشمل المقصورات الحمضية الليسوسوماس والإندوسوماس وجهاز ترانس غولجي وبعض الحويصلات الإفرازية6. تم العثور على عيوب في النقل المحورلل من المقصورات الحمضية في العديد من الأمراض العصبية وكذلك7، والأوراق الأخيرة تسليط الضوء على أهميتها في الأمراض MN8.
لدراسة كفاءة النقل المحوري، وتستخدم غرف microfluidic التي تفصل بين مقصورات جسدية ومحاورية بشكل متكرر9،10. الميزتين الهامتين للنظام microfluidic ، وتجزئة وعزل محاور عصبية ، تجعلها مثالية لدراسة العمليات دون الخلوية11. يمكن استخدام الفصل المكاني بين أجسام الخلايا العصبية والمحاور للتلاعب بالبيئات خارج الخلية لمقصورات الخلايا العصبية المختلفة (على سبيل المثال، محاور عصبية مقابل سوما). البيوكيميائية, نمو الخلايا العصبية / انحطاط, والصفات الفلور المناعي ة جميع الاستفادة من هذا المنبر. MFCs يمكن أن تساعد أيضا في دراسة الاتصالات بين الخلايا والخلايا عن طريق الخلايا العصبية coculturing مع أنواع الخلايا الأخرى, مثل عضلات الهيكل العظمي12,,13,,14.
هنا، ونحن نصف بروتوكول بسيط ولكن دقيقة لرصد الميتوكوندريا ونقل المقصورة الحمضية في الخلايا العصبية الحركية. كما نبين استخدام هذه الطريقة من خلال مقارنة النسبة المئوية النسبية للالعضيات المتحركة الرجعية والسابقة، وكذلك توزيع سرعة النقل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon DU-897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARA-C (Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td>stock of 2mM in filtered DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.25mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504530</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 6mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504533</td>
			<td>For preperation of small MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 7mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504534</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane Imaris software - version 8.4.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A3311-100G</td>
			<td>5% w/v in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimetylsilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#386529-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>C-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Medium - Optiprep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>stock 10mg/mL in neurobasal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14200-067</td>
			<td>dilute 1:10 in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont fine forceps #55 0.05 &#215; 0.02 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>1125520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Hardener</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>IPE 743</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Resin</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>RP 026UV</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>G-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9:GFP mice strain</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14185-045</td>
			<td>Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, curved, 10 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 9 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-440-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep-Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8638</td>
			<td>Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>DOW Corning Corporation</td>
			<td>#3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>stock 25 mg/mL in 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU X-1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system

الخلايا العصبية الحركية (MNs) هي خلايا مستقطبة للغاية مع محاور طويلة جدا. النقل المحوري هو آلية حاسمة لصحة MN، مما يساهم في نمو الخلايا العصبية، والتنمية، والبقاء على قيد الحياة. نحن نصف طريقة مفصلة لاستخدام غرف microfluidic (MFCs) لتتبع النقل المحوري للالعضيات المسماة الفلورسنت في محاور MN. هذه الطريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا، ويسمح لرصد الإشارات داخل الخلايا في المكان والزمان. ونحن نصف بروتوكول خطوة بخطوة لما يلي: 1) تصنيع شركات التمويل الأصغر المتعددة الأبعاد؛ (1) تصنيع المواد متعددة الأبعاد؛ 1 2) طلاء النباتات الخارجية الحبل الشوكي البطني وMN الثقافة المنفصلة في MFCs؛ 3) وضع العلامات من الميتوكوندريا والمقصورات الحمضية تليها حية confocal تخيل; 4) دليل وشبه الآلي تحليل النقل المحوري. وأخيرا، نحن نظهر فرقا في نقل الميتوكوندريا والمقصورات الحمضية من HB9::GFP الحبل الشوكي البطني explant محاور عصبية كدليل على صحة النظام. وإجمالاً، يوفر هذا البروتوكول أداة فعالة لدراسة النقل المحوري لمختلف المكونات المحورية، فضلاً عن دليل مبسط لاستخدام MFC للمساعدة في اكتشاف الإمكانيات التجريبية المكانية.

بعد البروتوكول الموصوف ، تم استزراع النباتات الجنينية HB9:: GFP في MFC(الشكل 4A). ويزرع Explants لمدة 7 أيام، عندما عبرت محاور عصبية تماما في المقصورة القاصية. تمت إضافة الأصباغ الحمراء الحمراء الميثواكر والليسوراكر إلى المقصورات القاصية والقريبة من أجل ت?...

Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

النقل المحوري هو آلية حاسمة لصحة الخلايا العصبية الحركية. في هذا البروتوكول نقدم طريقة مفصلة لتتبع النقل المحوري للمقصورات الحمضية والميتوكوندريا في محاور عصبية المحرك باستخدام غرف microfluidic.

النقل المحوري للأرغنفيات في ثقافات الخلايا العصبية الحركية باستخدام نظام غرف السوائل الدقيقة

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

نقل أكسونال أمر حيوي لصحة الخلايا العصبية ومقومات البقاء. يصف بروتوكولنا طريقة أنيقة لمراقبة وتحليل النقل المحوري. ويمكن تكييفها لمختلف نماذج الأمراض العصبية.يتيح استخدام الغرف ذات الفلورويد الدقيق التحكم الزمني المكاني الدقيق، وهو أمر بالغ الأهمية لدراسة بيولوجيا المحور المحوري. وتورط تشوهات النقل المحوري مع العديد من الأمراض العصبية مثل ALS. منصة microfluidic تمكن من دراسة الآليات الأساسية، فضلا عن اختبار العلاجات لإصلاح عيوب النقل المحوري.يمكن تكييف منصة غرفة microfluidic بسهولة لتناسب جوانب مختلفة من البحوث المحورية، بما في ذلك نمو محور عصبي وانحطاط من الأنواع الفرعية العصبية المختلفة. هذه الطريقة معقدة وتدرس عادة التدريب العملي على. وسوف يزيد العرض التوضيحي المرئي من إمكانية الوصول إلى هذا الإجراء لأي عالم مهتم بدراسة النقل المحوري.تبدأ من قبل صب PDMS في القوالب الأولية. استخدام الهواء المضغوط لإزالة أي الأوساخ من منصة رقاقة، والتأكد من أن الرقائق تبدو سلسة وواضحة قبل المضي قدما. بعد ذلك، تعبئة وعاء مع النيتروجين السائل وإعداد حقنة 10 ملليلتر مع إبرة قياس 23.في غطاء الدخان الكيميائي، ضع الرقاقة التي تحتوي على لوحة في حاوية قابلة للغلق، وملء الحقنة بمليلترين من النيتروجين السائل لكل رقاقة تحتوي على لوحة. افتح زجاجة كلوروتري ميثيلسيلين. يخترق الغطاء المطاطي مع الحقنة وحقن النيتروجين في الزجاجة.دون سحب الإبرة، بدوره زجاجة رأسا على عقب والعيب مليلتر اثنين من الكلوروتريthylsilane لكل رقاقة تحتوي على لوحة. انتشار الكلوروتري ميثيلسيلين في الحاوية، ولكن ليس مباشرة على رقاقة تحتوي على لوحة. أغلق الحاوية.واحتضانه لمدة خمس دقائق لكل رقاقة. المقبل وزن 47.05 غراما من قاعدة PDMS في أنبوب 50 ملليلتر، وإضافة عامل علاج PDMS بنسبة 16 إلى 1 قاعدة وكيل علاج لمجموع 50 غراما. اخلطي جهاز الـ PDMS لمدة 10 دقائق على دوار سرعة منخفضة، ثم اسكبه في كل رقاقة تحتوي على لوحة إلى الارتفاع المطلوب.ضع اللوحات داخل جهاز افراغ لمدة ساعتين. التي سوف إزالة الهواء المحاصرين داخل PDMS، وتشكيل قالب موحد واضح. بعد ذلك احتضان الأطباق في فرن لمدة ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها في 70 درجة مئوية.لإنشاء غرفة microfluidic أو MFC. قطع وإزالة قوالب PDMS من لوحة مع مشرط، والتأكد من عدم فرض القوالب لأنها هشة. اتبع التعليمات الواردة في المخطوطة النصية لتضرب وتقطع الغرف، حسب الإعداد التجريبي.بالنسبة لثقافة النخاع الشوكي، لكمة بئرين من سبعة ملليمترات في الجانب القاصي من MFC كبيرة، مع التأكد من أنها سوف تتداخل مع حواف القناة. على الجانب القريب، لكمة واحدة سبعة ملليمتر جيدا في منتصف القناة مع الحد الأدنى من التداخل، بحيث يتم ترك مساحة كافية لاكزات. لكمة اثنين إضافية واحد الثقوب ملليمتر في حواف اثنين من القناة القريبة.وقطع PDMS إلى غرف واحدة. ثم بدوره MFC التي تواجه صعودا، واستخدام إبرة قياس 20 لنحت في ثلاثة كهوف explant الصغيرة على لكمات سبعة ملليمتر جيدا. لثقافة الخلايا العصبية الحركية المنفصلة ، لكمة أربعة آبار ستة ملليمتر ، في حواف القناتين من MFC صغيرة وقطع PDMS إلى غرف واحدة.لتعقيم MFC، انتشار 50 سنتيمترا أشرطة شريط لاصق طويلة على مقاعد البدلاء. ثم اضغط على وجهي الغرفة على الشريط واسحبه مرة أخرى. وضع الغرف النظيفة في لوحة جديدة واحتضان لهم في الصف التحليلي، من 70٪ الإيثانول لمدة 10 دقائق على شاكر المدارية.تخلص من الإيثانول وجفف الغرف في غطاء لثقافة الأنسجة أو في فرن عند درجة حرارة 70 درجة مئوية. ثم ضع الغرفة في وسط خندق أسفل الزجاج الصف ثقافة الأنسجة، وتطبيق قوة طفيفة على حواف لربط PDMS إلى أسفل الطبق. احتضان الطبق لمدة 10 دقائق في 70 درجة مئوية.ثم اضغط على الغرف لتعزيز الالتزام. احتضان الطبق تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق، ثم انتقل إلى ترميز MFC. أضف 1.5 نانوغرام لكل ملليلتر من PLO إلى كلا المقصورتين.التأكد من أن منظمة التحرير الفلسطينية تسير عبر القنوات. بواسطة الأنابيب وسائل الإعلام طلاء مباشرة في مدخل القناة. فحص MFC تحت مجهر الضوء، للتحقق من وجود فقاعات.إذا كانت فقاعات الهواء تمنع الأخاقيق الصغيرة، ضع MFC في مجففات فراغ لمدة دقيقتين. إزالة الهواء الزائد من قنوات MFC. ثم احتضانه بين عشية وضحاها مع منظمة التحرير الفلسطينية.استبدل منظمة التحرير الفلسطينية باللامينين وحضن MFC لليلة إضافية. قبل الطلاء، وغسل laminin مع ثقافة المتوسطة. تشريح الماوس الحامل ICR E12.5، وفصل الأجنة من الكيس السلوي.وضع الجنين في طبق السيليكون HBSS. إزالة الرأس والذيل والوجه على بطنه. قشر بلطف قبالة الجلد السطحي من الأجنة مرة أخرى، وفضح الحبل الشوكي.افصل الحبل الشوكي عن الجسم من الرأس إلى الذيل، باستخدام ملاقط لطيفة. إزالة السحايا، ثم إزالة قرون الظهر وقطع الحبل الشوكي إلى مقاطع عرضية سميكة ملليمتر واحد. تخلص من كافة الوسيطة من المقصورة القريبة من MFC.التقط اجمالاً من الحبل الشوكي مع ماصة، في حجم إجمالي قدره أربعة ميكرولترات. وحقنه أقرب ما يمكن إلى الكهف. سحب أي سائل الزائدة من البئر القريب عبر منافذ جانبية.كرر الخطوة السابقة مرتين أكثر وتأكد من أن explants المضمنة في القناة القريبة. إضافة ببطء 150 ميكرولترات من المتوسط SCEX، إلى البئر القريبة. بعد يوم واحد من الطلاء.استبدال الوسيط SCEX في المقصورة القريبة وإضافة منسق SCEX المتوسطة إلى مقصورة جزية. الحفاظ على تدرج حجم لا يقل عن 15 ميكرولترات في البئر بين الآبار البعيدة والقريبة. بعد أربعة إلى ستة أيام، يجب أن تعبر المحاور إلى المقصورة البعيدة وتكون جاهزة لتصوير النقل المحوري.لتسمية الميتوكوندريا والمقصورات الحمضية، وإعداد SCEX المتوسطة الطازجة مع 100 نانو مولولار الميتوكتر عميق الأحمر FM، و 100 نانومولار LysoTracker الأحمر. وإضافته إلى الغرف الصغيرة احتضانهم لمدة 30 إلى 60 دقيقة في 37 درجة مئوية.ثم يغسل ثلاث مرات مع دافئ SCEX المتوسطة. المضي قدما في التصوير الحي للنقل المحوري. الحصول على 100 مرة الفاصل سلسلة صورة في ثلاث فترات ثانية.مع ما مجموعه خمس دقائق لكل فيلم. بعد سبعة أيام في غرف microfluidic. الماوس الجنينية HB9 GFP الحبل الشوكي explants.نحن ملطخون بأصباغ MitoTracker العميقة الحمراء و LysoTracker الحمراء. لتسمية الميتوكوندريا والمقصورات الحمضية. تم تصوير أجهزة أكسون في الأخانق البعيدة واستخدم تحليل كيموغراف لتحديد التوزيع العام للحركة.وكشف هذا التحيز في الاتجاه الرجعي فقط في مقصورات المدينة الحمضية، ولكن ليس في النقل الميتوكوندريا. كما تم تحديد كمية كثافة الجسيمات، مما يكشف عن وجود عدد أكبر من جزيئات الميتوكوندريا مقارنة بالقصور الحمضية في محاور عصبية النخاع الشوكي HB9 GFP. وبعد ذلك، أجري تحليل وحيد لنقل الجسيمات باستخدام برامج حاسوبية شبه آلية متبوعة برمز داخلي.وكشف هذا التحليل أن المكونات الحمضية والميتوكوندريا لها سرعات جسيمات مماثلة. ولكن المقصورات الحمضية فقط تظهر التحيز نحو الحركة الرجعية. يمكن أن يكون عزل الحبل الشوكي الجنيني صعبًا في البداية.ممارسة هذا الإجراء عدة مرات، مع التأكد من استخدام العمر الجنيني الصحيح وأدوات التشريح المناسبة. استخدام غرف microfluidic يغير الطريقة التي ندرس الأحياء المحورية. انها تسمح لنا لتصور العمليات المحورية المترجمة، والتي نحن مرة واحدة يفترض أن تحدث إلا في جسم الخلية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

المقترنة تسجيلات المشبك من تصحيح للسيارات ، والخلايا العصبية في العضلات الهيكلية الهدف اسماك الزرد

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

الاشتقاق الثقافات Oligodendrocyte المخصب وOligodendrocyte نيورون / Myelinating المشارك من الثقافات في مرحلة ما بعد الولادة مناديل الفئران

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

تحليل التصوير من الخلايا العصبية إلى الخلايا الدبقية في التفاعل منهاج الثقافة ميكروفلويديك (MCP) على أساس الخلايا العصبية والخلايا الدبقية اكسون نظام المشاركة في الثقافة

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

التصوير في الوقت الحقيقي من محور عصبي نقل الكم دوت المسمى عامل التغذية العصبية في الخلايا العصبية الابتدائية

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

على الموصل العصبي العضلي: قياس المشبك الحجم، التغييرات تجزئة ومتشابك الكثافة البروتين عن طريق متحد البؤر مضان المجهر

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

فحص لقياس نوكلوسيتوبلاسميك النقل في الوقت الحقيقي داخل موتور الخلايا العصبية مثل نسك-34 الخلايا

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

التصور من محور الإسقاط نمط من الخلايا العصبية المحرك الجنينية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A بسيطة العصبية الميكانيكية إصابة منهجية للدراسة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; موتور العصبون التنكس

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

في فيفو القياس الكهربية من إمكانات عمل العضلات مركب من الأمامية في نماذج الماوس من ضمور الخلايا العصبية الحركية

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

تصور وتحليل النقل داخل الخلايا من العضيات وغيرها من الشحنات في الخلايا النجمية

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...