Name: axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Israel Science Foundation (ISF, 561/11) og Det Europæiske Forskningsråd (EF, 309377).

Pasning og behandling af dyr i denne protokol blev udført under tilsyn og godkendelse af Tel Aviv University Committee for Animal Ethics.
1. MFC-forberedelse
<ol><li>PDMS støbning i primære forme (Figur 1)<ol>
<li>Køb eller skabe primære forme (vafler) efter en detaljeret protokol9.</li>
		<li>Brug trykluft til at fjerne enhver form for snavs fra waferplatformen, før du fortsætter til belægningstrinnet. Overfladen af vafler skal s...

<ol>
	<li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitostasis+in+Neurons:+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture.">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li><li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease.">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li><li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons.">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).</li><li>Magran&#233;, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li><li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+acidic+intracellular+compartments.">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li><li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration.">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li><li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport,+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether.">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li><li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers.">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li><li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS.">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance.">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ.">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li><li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model.">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 210 (2019).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS.">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li></ol>

I denne protokol beskriver vi et system til at spore axonal transport af mitokondrier og sure rum i motoriske neuroner. Denne forenklede in vitro-platform giver mulighed for præcis kontrol, overvågning og manipulation af subcellulære neuronale rum, hvilket muliggør eksperimentel analyse af motorneuronlokale funktioner. Denne protokol kan være nyttig til at studere MN sygdomme som ALS, at fokusere på at forstå den underliggende mekanisme af axonal transport dysfunktion i sygdommen10,</s...

N'er er stærkt polariserede celler med lange axoner og når op til en meter lang hos voksne mennesker. Dette fænomen skaber en kritisk udfordring for vedligeholdelsen af MN-forbindelse og -funktion. Derfor, Ncs afhænger af korrekt transport af information, organeller, og materialer langs axoner fra deres celle krop til synapsen og tilbage. Forskellige cellulære komponenter, såsom proteiner, RNA, og organeller er shuttled regelmæssigt gennem axoner. Mitokondrier er vigtige organeller, der rutinemæssigt transporteres i Menneskers Grænser. Mitokondrier er afgørende for korrekt aktivitet og funktion af Menneskers tandområder, der er ansvarlige for ATP bestemmelse, calcium buffering, og signalering processer1,2. Den axonale transport af mitokondrier er en velstuderet proces3,4. Interessant, defekter i mitokondriel transport blev rapporteret at være involveret i flere neurodegenerative sygdomme og specifikt i MN sygdomme5. Sure rum tjener som et andet eksempel for iboende organeller, der bevæger sig langs MN axoner. Sure rum omfatter lysosomer, endosomer, trans-Golgi apparater, og visse sekretoriske vesikler6. Fejl i aksonal transport af sure rum blev fundet i flere neurodegenerative sygdomme samt7, og de seneste papirer fremhæve deres betydning i MN sygdomme8.
For effektivt at kunne studere axonal transport anvendes mikrofluidiske kamre, der adskiller somatiske og axonalerum,ofte9,10. De to betydelige fordele ved mikrofluidic system, og segmentering og isolering af axoner, gør det ideelt til undersøgelse af subcellulære processer11. Den rumlige adskillelse mellem de neuronale cellelegemer og axoner kan bruges til at manipulere de ekstracellulære miljøer i forskellige neuronale rum (f.eks. axoner vs. soma). Biokemiske, neuronal vækst /degeneration, og immunofluorescens analyser alle drage fordel af denne platform. MCC'er kan også hjælpe med at studere celle-til-celle kommunikation ved at coculturing neuroner med andre celletyper, såsom skeletmuskulatur12,13,14.
Her beskriver vi en enkel, men præcis protokol til overvågning af mitokondrier og sure rumtransport er i motoriske neuroner. Vi viser endvidere brugen af denne metode ved at sammenligne den relative procentdel af retrograd og anterograd bevægelige organeller, samt fordelingen af transporthastighed.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon DU-897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARA-C (Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td>stock of 2mM in filtered DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.25mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504530</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 6mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504533</td>
			<td>For preperation of small MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 7mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504534</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane Imaris software - version 8.4.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A3311-100G</td>
			<td>5% w/v in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimetylsilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#386529-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>C-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Medium - Optiprep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>stock 10mg/mL in neurobasal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14200-067</td>
			<td>dilute 1:10 in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont fine forceps #55 0.05 &#215; 0.02 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>1125520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Hardener</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>IPE 743</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Resin</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>RP 026UV</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>G-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9:GFP mice strain</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14185-045</td>
			<td>Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, curved, 10 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 9 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-440-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep-Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8638</td>
			<td>Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>DOW Corning Corporation</td>
			<td>#3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>stock 25 mg/mL in 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU X-1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system

Motor neuroner (MNs) er stærkt polariserede celler med meget lange axoner. Axonal transport er en afgørende mekanisme for MN sundhed, der bidrager til neuronal vækst, udvikling og overlevelse. Vi beskriver en detaljeret metode til brug af mikrofluidiske kamre (MCC' er) til sporing af axonal transport af fluorescerende mærkede organeller i MN axoner. Denne metode er hurtig, relativt billig, og giver mulighed for overvågning af intracellulære signaler i tid og rum. Vi beskriver en trinvis protokol for: 1) Fremstilling af polydimethylsiloxan (PPC'er) MPC'er; 2) Plating af ventralrygmarvexplanter og MN dissocieret kultur i MPC'er; 3) Mærkning af mitokondrier og sure rum efterfulgt af levende konfokal fantasi; 4) Manuel og halvautomatisk axonal transport analyse. Endelig viser vi en forskel i transporten af mitokondrier og sure rum i HB9::GFP ventral rygmarvexplantaxoner som bevis for systemets gyldighed. Alt i alt er denne protokol et effektivt værktøj til at studere aksonal transport af forskellige aksonale komponenter, samt en forenklet manual for MFC brug for at hjælpe med at opdage rumlige eksperimentelle muligheder.

Efter den beskrevne protokol blev museembryonale HB9::GFP rygmarvseksplanter dyrket i MFC (Figur 4A). Explants blev dyrket i 7 dage, når axoner helt krydsede ind i det distale rum. Mitotracker Deep Red og Lysotracker Røde farvestoffer blev tilsat de distale og proksimale rum for at mærke mitokondrier og sure rum (Figur 4C). Axoner i de distale riller blev afbildet, og filmene blev analyseret s...

Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Axonal transport er en afgørende mekanisme for motor neuron sundhed. I denne protokol giver vi en detaljeret metode til sporing af aksonal transport af sure rum og mitokondrier i motorneuronaxoner ved hjælp af mikrofluidiske kamre.

Axonal transport af organeller i motorneuronkulturer ved hjælp af microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Axonal transport er afgørende for neuronal sundhed og levedygtighed. Vores protokol beskriver en elegant metode til overvågning og analyse af axonal transport. Og kan tilpasses til forskellige neuronal sygdom modeller.Brugen af mikrofluidiske kamre muliggør præcis rumlig tidsmæssig kontrol, hvilket er afgørende for at studere aksonal biologi. Axonal transport abnormiteter er impliceret med flere neurodegenerative sygdomme som ALS. Den mikrofluidiske platform gør det muligt at studere grundlæggende mekanismer samt testbehandlinger for at reparere axonale transportfejl.Den microfluidic kammer platform kan nemt tilpasses til forskellige aspekter af axonal forskning, herunder axonal vækst og degeneration af forskellige neurale undertyper. Denne metode er kompleks og normalt undervises hands-on. Den visuelle demonstration vil øge tilgængeligheden af denne procedure til enhver videnskabsmand interesseret i at studere axonal transport.Begynd med støbning PDMS i primære forme. Brug trykluft til at fjerne snavs fra waferplatformen, og sørg for, at wafers ser glat og klar, før du fortsætter. Dernæst fylde en beholder med flydende nitrogen og forberede en 10 milliliter sprøjte med en 23 gauge nål.I en kemisk røghætte skal waferen indeholdende pladen være i en forseglelig beholder og fylde sprøjten med to milliliter flydende nitrogen pr. wafer, der indeholder pladen. Åbn en chlorotrimethylsilane flaske. Gennembor gummihætten med sprøjten og indsprøjt nitrogenet i flasken.Uden at trække nålen ud, Vend flasken på hovedet og ulempe to milliliter chlorotrimethylsilane for hver wafer, der indeholder plade. Chlorotrimethylsilane spredes i beholderen, men ikke direkte på waferen, der indeholder pladen. Luk beholderen.Og inkuber det i fem minutter pr wafer. Næste vejer 47,05 gram PDMS base i en 50 milliliter rør, og tilsæt PDMS hærdningsmiddel i et forhold på 16 til 1 base til hærdningsmiddel for i alt 50 gram. Bland PDMS i 10 minutter på en lav hastighed rotator, derefter hældes det i hver wafer, der indeholder plade til den ønskede højde.Anbring pladerne inde i en vakuumeksiccator i to timer. Som vil fjerne luft fanget i PDMS, og danne en klar ensartet mug. Derefter inkuberes pladerne i en ovn i tre timer eller natten over ved 70 Celsius.For at oprette det mikrofluidiske kammer eller MFC. Skær og fjern PDMS forme fra pladen med en skalpel, og sørg for ikke at tvinge forme, fordi de er skrøbelige. Følg instruktionerne i tekstmanuskriptet for at slå og skære kamrene, afhængigt af den eksperimentelle opsætning.For rygmarven explant kultur, punch to syv millimeter brønde i den distale side af en stor MFC, og sørg for, at de vil overlappe med kanalen kanter. På den proksimale side, punch en syv millimeter godt i midten af kanalen med minimal overlapning, således at tilstrækkelig plads er tilbage til explants. Punch yderligere to millimeter huller i de to kanter af den proksimale kanal.Og skær PDMS i enkelte kamre. Drej derefter MFC vender opad, og brug en 20 gauge nål til at skære på tre små explant huler på den udstansede syv millimeter godt. For dissocieret motor neuron kultur, punch fire seks millimeter brønde, i kanterne af de to kanaler i en lille MFC og skær PDMS i enkelt kamre.For at sterilisere MFC, spredes 50 centimeter lange tape bånd bånd på bænken. Tryk derefter begge ansigter af kammeret på båndet og træk det tilbage. Placer de rene kamre i en ny plade og inkubere dem i analytisk kvalitet, på 70% ethanol i 10 minutter på en orbital shaker.Bortskaf ethanolen og tør kamrene i en vævskulturhætte eller i en ovn ved 70 grader Celsius. Derefter placere kammeret i midten af et væv kultur grade glas bund grøft, og anvende mindre kraft på kanterne til at binde PDMS til skålen bunden. Inkuber skålen i 10 minutter ved 70 grader Celsius.Tryk derefter på kamrene for at styrke overholdelsen. Inkuber skålen under UV i 10 minutter, og fortsæt derefter med at kode MFC. Der tilsættes 1,5 nanogram pr. milliliter PLO til begge rum.At sikre, at PLO løber gennem kanalerne. Ved at pipettere belægningsmediet direkte i kanalindgangen. Undersøg MFC under et let mikroskop for at kontrollere, om der er bobler.Hvis luftbobler blokerer mikrorillerne, skal MFC sættes i en vakuumdesiccators i to minutter. Fjern overskydende luft fra MFC-kanalerne. Derefter inkubere det natten over med PLO.Udskift PLO med laminin og inkuber MFC for en ekstra nat. Før plating, vaske laminin med kultur medium. Disseker en ICR E12.5 gravid mus, og adskille embryoner fra fostervandssækken.Sæt fosteret i HBSS Silicon skål. Fjern hoved og hale og vend det på hans mave. Forsigtigt skrælle overfladisk hud fra embryoner tilbage, udsætter rygmarven.Adskå rygmarven fra kroppen fra hoved til hale, ved hjælp af blide pincet. Fjern meninges, derefter fjerne ryghorn og skær rygmarven i en millimeter tyk tværgående sektioner. Bortskaf alle medier fra det proksimale rum i MFC.Pick up en enkelt rygmarvsudplante med en pipette, i et samlet volumen af fire mikroliter. Og indsprøjte det så tæt som muligt på hulen. Træk overskydende væske ud af den proksimale brønd via sidetagsudtag.Gentag det foregående trin to gange mere, og sørg for, at explants er indlejret i den proksimale kanal. Tilsæt langsomt 150 mikroliter SCEX-medium til den proksimale brønd. En dag efter plating.Udskiftet SCEX-mediet i det proksimale rum og tilsæt fyldig SCEX-medie til det distale rum. Opretholdelse af en volumengradient på mindst 15 mikroliter pr. brønd mellem de distale og proksimale brønde. Efter fire til seks dage skal axonerne krydse til det distale rum og være klar til axonal transport billeddannelse.For at mærke mitokondrier og sure rum, forberede frisk SCEX medium med 100 nanomolar MitoTracker Deep Red FM, og 100 nanomolar LysoTracker Red. Og tilføje det til mikrofluidic kamre. Inkuber dem i 30 til 60 minutter ved 37 grader Celsius.Derefter vaskes tre gange med varmt SCEX medium. Fortsæt med levende billeddannelse af aksonal transport. Erhvervelse af en 100 time lapse billedserie med tre sekunders mellemrum.Med i alt fem minutter pr. film. Efter syv dage i mikrofluidiske kamre. Mus embryonale HB9 GFP rygmarv explants.Vi er plettet med MitoTracker Deep Red og LysoTracker Red farvestoffer. At mærke mitokondrier og sure rum. Axoner i de distale riller blev afbildet og Kymograph analyse blev brugt til at bestemme den generelle bevægelse distribution.Dette afslørede en skævhed i tilbageskridt retning kun i sure byrum, men ikke i mitokondriel transport. Partikeltætheden blev også kvantificeret, hvilket afslørede et højere antal mitokondrielle partikler sammenlignet med sure rum i HB9 GFP rygmarvsaksoner. Dernæst blev enkelt partikeltransportanalyse udført ved hjælp af halvautomatisk software efterfulgt af in-house kode.Denne analyse viste, at sure komponenter og mitokondrier har lignende partikelhastigheder. Men kun sure rum udviser en bias mod tilbageskridt. Isolering af fosterets rygmarv kan være svært i første omgang.Praksis denne procedure flere gange, og sørg for at bruge den korrekte embryonale alder og passende dissektion værktøjer. Brugen af mikrofluidiske kamre ændrer den måde, vi studerer aksonal biologi. Det giver os mulighed for at visualisere lokaliserede axonale processer, som vi engang hypoteser til kun at forekomme i cellen kroppen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analyse af Neuron til glia Interaktion i Mikrofluid Kultur Platform (MCP)-baseret Neuronal Axon og glia Co-kultur System

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Real-time Imaging af axonal Transport af Quantum Dot-mærket BDNF i Primary neuroner

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulære forbindelse: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og ændringer i Synaptic Protein Density Brug Konfokal Fluorescens mikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Analyse til måling af nukleocytoplasmisk transport i realtid inden for motor neuronlignende NSC-34 celler

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisering af Axonal Projeksionsmønsteret af Embryoniske Motor Neuroner i<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

En simpel neurologisk mekanisk skademetode til undersøgelse<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Elektrofysiologiske målinger af sammensatte muskel aktionspotentialet fra forbens i musemodeller af Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisering og analyse af intracellulær transport af organelles og andre Cargos i astrocytter

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...