Name: axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (ISF, 561/11) en de European Research Council (ERC, 309377).

De verzorging en behandeling van dieren in dit protocol werd uitgevoerd onder toezicht en goedkeuring van het Universiteitscomité voor dierethiek van Tel Aviv.
1. Voorbereiding van het MFC
<ol><li>PDMS gieten in primaire mallen (Figuur 1)<ol>
<li>Koop of maak primaire mallen (wafers) volgens een gedetailleerd protocol9.</li>
		<li>Gebruik lucht onder druk om elk type vuil van het waferplatform te verwijderen voordat u overgaat tot de coa...

<ol>
	<li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitostasis+in+Neurons:+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture.">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li><li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease.">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li><li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons.">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).</li><li>Magran&#233;, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li><li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+acidic+intracellular+compartments.">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li><li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration.">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li><li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport,+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether.">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li><li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers.">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li><li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS.">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance.">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ.">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li><li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model.">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 210 (2019).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS.">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li></ol>

In dit protocol beschrijven we een systeem om axonaltransport van mitochondriën en zure compartimenten in motorneuronen te volgen. Dit vereenvoudigde in vitro platform maakt nauwkeurige controle, monitoring en manipulatie van subcellulaire neuronale compartimenten mogelijk, waardoor experimentele analyse van lokale functies van motorneuron mogelijk is. Dit protocol kan nuttig zijn voor het bestuderen van MN-ziekten zoals ALS, om zich te concentreren op het begrijpen van het onderliggende mechanisme van axonale transport...

MNs zijn sterk gepolariseerde cellen met lange axonen, die tot een meter lang zijn bij volwassen mensen. Dit fenomeen vormt een cruciale uitdaging voor het onderhoud van MN-connectiviteit en -functie. Bijgevolg zijn MN's afhankelijk van een goed transport van informatie, organellen en materialen langs de axonen van hun cellichaam naar de synaps en terug. Verschillende cellulaire componenten, zoals eiwitten, RNA en organellen worden regelmatig door de axonen geshuttled. Mitochondriën zijn belangrijke organellen die routinematig worden vervoerd in MNs. Mitochondriën zijn essentieel voor de juiste activiteit en functie van MN's, verantwoordelijk voor ATP-voorziening, calciumbuffering en signaleringsprocessen1,2. Het axonale transport van mitochondriën is een goed bestudeerd proces3,4. Interessant is dat defecten in mitochondriaal transport betrokken waren bij verschillende neurodegeneratieve ziekten en specifiek bij MN-ziekten5. Zure compartimenten dienen als een ander voorbeeld voor intrinsieke organellen die langs MN axonen bewegen. Zure compartimenten zijn lysosomen, endosomen, trans-Golgi apparaat, en bepaalde secretoire blaasjes6. Gebreken in het axonale transport van zure compartimenten werden gevonden in verschillende neurodegeneratieve ziekten en7, en recente papers benadrukken hun belang in MN ziekten8.
Om axonaal transport efficiënt te bestuderen, worden microfluïdische kamers die somatische en axonale compartimenten scheiden vaak9,10gebruikt. De twee belangrijke voordelen van het microfluïdische systeem, en de compartimentering en de isolatie van axonen, maken het ideaal voor de studie van subcellulaire processen11. De ruimtelijke scheiding tussen de neuronale cellichamen en axonen kan worden gebruikt om de extracellulaire omgevingen van verschillende neuronale compartimenten te manipuleren (bijvoorbeeld axonen versus soma). Biochemische, neuronale groei/ degeneratie, en immunofluorescentie testen profiteren allemaal van dit platform. MPC's kunnen ook helpen bij het bestuderen van cel-naar-cel communicatie door coculturing neuronen met andere celtypes, zoals skeletspieren12,13,14.
Hier beschrijven we een eenvoudig maar nauwkeurig protocol voor het monitoren van mitochondriën en zuur compartimenttransport in motorneuronen. We tonen verder het gebruik van deze methode door het relatieve percentage retrograde en anterograde bewegende organellen te vergelijken, evenals de verdeling van de transportsnelheid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon DU-897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARA-C (Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td>stock of 2mM in filtered DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.25mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504530</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 6mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504533</td>
			<td>For preperation of small MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 7mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504534</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane Imaris software - version 8.4.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A3311-100G</td>
			<td>5% w/v in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimetylsilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#386529-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>C-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Medium - Optiprep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>stock 10mg/mL in neurobasal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14200-067</td>
			<td>dilute 1:10 in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont fine forceps #55 0.05 &#215; 0.02 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>1125520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Hardener</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>IPE 743</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Resin</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>RP 026UV</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>G-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9:GFP mice strain</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14185-045</td>
			<td>Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, curved, 10 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 9 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-440-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep-Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8638</td>
			<td>Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>DOW Corning Corporation</td>
			<td>#3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>stock 25 mg/mL in 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU X-1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system

Motorneuronen (MNs) zijn sterk gepolariseerde cellen met zeer lange axonen. Axonale transport is een cruciaal mechanisme voor de gezondheid van MN, bij te dragen aan neuronale groei, ontwikkeling en overleving. We beschrijven een gedetailleerde methode voor het gebruik van microfluïdische kamers (MPC's) voor het bijhouden van axonal transport van fluorescerend gelabelde organellen in MN axons. Deze methode is snel, relatief goedkoop, en zorgt voor de monitoring van intracellulaire signalen in ruimte en tijd. We beschrijven een stapsgewijs protocol voor: 1) Fabricage van polydimethylsiloxane (PDMS) MFP's; 2) Plating van ventrale ruggenmergexplanten en MN gescheiden cultuur in MPC's; 3) Etikettering van mitochondriën en zure compartimenten, gevolgd door live confocale verbeelding; 4) Handmatige en semi-geautomatiseerde axonale transportanalyse. Ten slotte tonen we een verschil aan in het transport van mitochondriën en zure compartimenten van HB9::GFP ventrale ruggenmerg explant axonen als een bewijs van de geldigheid van het systeem. Al met al biedt dit protocol een efficiënt hulpmiddel voor het bestuderen van het axonale transport van verschillende axonale componenten, evenals een vereenvoudigde handleiding voor MFC-gebruik om ruimtelijke experimentele mogelijkheden te helpen ontdekken.

Volgens het beschreven protocol werden de embryonale HB9::GFP-ruggenmergexplanten gekweekt in MFC (figuur 4A). Explants werden gekweekt voor 7 dagen, toen axonen volledig gekruist in de distale compartiment. Mitotracker Deep Red en Lysotracker Rode kleurstoffen werden toegevoegd aan de distale en proximale compartimenten om de mitochondriën en zure compartimenten(figuur 4C)te labelen. Axonen in ...

Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Axonale transport is een cruciaal mechanisme voor de gezondheid van motorneuronen. In dit protocol bieden we een gedetailleerde methode voor het bijhouden van het axonale transport van zure compartimenten en mitochondriën in motorneuron axonen met behulp van microfluïdische kamers.

Axonal Transport van Organellen in Motor Neuron Culturen met behulp van Microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Axonaal transport is van vitaal belang voor de gezondheid en levensvatbaarheid van neuronale. Ons protocol beschrijft een elegante methode voor het monitoren en analyseren van axonaal transport. En kan worden aangepast voor verschillende neuronale ziekte modellen.Het gebruik van microfluïde kamers maakt nauwkeurige ruimtelijke temporele controle mogelijk, wat cruciaal is voor het bestuderen van de axonale biologie. Axonale transportafwijkingen zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals ALS. Het microfluïde platform maakt het mogelijk om basismechanismen en testtherapieën te bestuderen om axonale transportdefecten te herstellen.Het microfluidic chamber platform kan eenvoudig worden aangepast aan verschillende aspecten van axonale onderzoek, waaronder axonale groei en degeneratie van verschillende neurale subtypes. Deze methode is complex en meestal hands-on onderwezen. De visuele demonstratie zal de toegankelijkheid van deze procedure te verhogen voor elke wetenschapper die geïnteresseerd is in het bestuderen van axonaal vervoer.Begin met het gieten van PDMS in primaire mallen. Gebruik lucht onder druk om vuil van het waferplatform te verwijderen, zodat de wafers er glad en helder uitzien voordat u verdergaat. Vul vervolgens een container met vloeibare stikstof en bereid een spuit van 10 milliliter voor met een naald van 23 meter.Plaats in een chemische rookkap de wafer met plaat in een afsluitbare container en vul de spuit met twee milliliter vloeibare stikstof per wafer met plaat. Open een chloorprimethylsilane fles. Doorboor de rubberen dop met de spuit en injecteer de stikstof in de fles.Zonder de naald eruit te trekken, draai je de fles ondersteboven en doe twee milliliter chlooretrimethylsilane voor elke wafer met plaat. Verdeel de chlorotrimethylsilane in de container, maar niet direct op de wafer met plaat. Sluit de container.En het vijf minuten per wafer uitbroeden. Vervolgens wegen 47,05 gram PDMS basis in een 50 milliliter buis, en voeg PDMS uithardingsmiddel bij een verhouding van 16 tot 1 basis aan uithardingsmiddel voor een totaal van 50 gram. Meng de PDMS gedurende 10 minuten op een rotator met lage snelheid en giet deze vervolgens in elke wafer met plaat op de gewenste hoogte.Plaats de platen gedurende twee uur in een vacuümdesiccator. Die zal verwijderen lucht gevangen in de PDMS, en vormen een duidelijke uniforme mal. Daarna de platen drie uur of 's nachts bij 70 Graden Celsius in een oven uitbroeden.Om de microfluïde kamer of MFC te maken. Snijd en verwijder de PDMS mallen van de plaat met een scalpel, zorg ervoor dat de mallen niet te dwingen omdat ze kwetsbaar zijn. Volg de instructies in het tekstmanuscript om de kamers te slaan en te knippen, afhankelijk van de experimentele opstelling.Voor ruggenmerg explant cultuur, punch twee zeven millimeter putten in de distale kant van een grote MFC, ervoor te zorgen dat ze overlappen met de kanaalranden. Aan de proximale kant, punch een zeven millimeter goed in het midden van het kanaal met minimale overlap, zodat er voldoende ruimte overblijft voor de explants. Punch twee extra een millimeter gaten in de twee randen van het proximale kanaal.En snijd de PDMS in enkele kamers. Draai vervolgens de MFC naar boven, en gebruik een 20-meter naald te snijden op drie kleine explant grotten op de geponste zeven millimeter goed. Voor gescheiden motorneuron cultuur, punch vier zes millimeter putten, in de randen van de twee kanalen van een kleine MFC en snijd de PDMS in enkele kamers.Om de MFC te steriliseren, verspreid 50 centimeter lange plakbandbanden op de bank. Druk vervolgens op beide gezichten van de kamer op de tape en trek het terug. Plaats de schone kamers in een nieuwe plaat en broed ze in analytische kwaliteit, van 70%ethanol gedurende 10 minuten op een orbitale shaker.Gooi de ethanol en droog de kamers in een weefselkweekkap of in een oven op 70 graden Celsius. Plaats vervolgens de kamer in het midden van een weefsel cultuur rang glazen bodem sloot, en van toepassing kleine kracht op de randen om de PDMS te binden aan de schotel bodem. Incubeer de schotel gedurende 10 minuten bij 70 graden Celsius.Druk vervolgens op de kamers om de hechting te versterken. Incubeer de schotel onder UV gedurende 10 minuten, ga dan over tot het coderen van de MFC. Voeg 1,5 nanogram per milliliter PLO toe aan beide compartimenten.Ervoor zorgen dat de PLO door de kanalen loopt. Door het pipetten van de coatingmedia direct in de kanaalingang. Bestudeer het MFC onder een lichtmicroscoop, om te controleren op bubbels.Als luchtbellen de microgroeven blokkeren, plaatst u de MFC gedurende twee minuten in een vacuümdesiccators. Verwijder overtollige lucht uit de MFC-kanalen. Dan uitbroeden het 's nachts met PLO.Vervang de PLO door laminine en incubbateer het MFC voor een extra nacht. Vóór beplating, was de laminine met cultuurmedium. Ontleed een ICR E12.5 zwangere muis en scheid de embryo's van de vruchtzak.Doe het embryo in HBSS Silicon dish. Verwijder het hoofd en de staart en draai het op zijn buik. Voorzichtig afpellen oppervlakkige huid van de embryo's terug, het blootstellen van het ruggenmerg.Scheid het ruggenmerg van het lichaam van kop tot staart, met behulp van zachte pincet. Verwijder de hersenvliezen, verwijder vervolgens de rughoorns en snijd het ruggenmerg in een millimeter dikke dwarssecties. Gooi alle medium uit het proximale compartiment van het MFC.Pak een enkel ruggenmerg explant met een pipet, in een totaal volume van vier microliters. En injecteer het zo dicht mogelijk bij de grot. Trek overtollige vloeistof uit de proximale goed via de laterale uitlaten.Herhaal de vorige stap nog twee keer en zorg ervoor dat de explants zijn ingebed in het proximale kanaal. Voeg langzaam 150 microliter van SCEX medium, aan de proximale goed. Een dag na de beplating.Verving het SCEX-medium in het proximale compartiment en voeg een rijk SCEX-medium toe aan het distale compartiment. Het handhaven van een volumegradiënt van ten minste 15 microliter per put tussen de distale en proximale putten. Na vier tot zes dagen moeten de axonen naar het distale compartiment oversteken en klaar zijn voor axonale transportbeeldvorming.Om de mitochondriën en zure compartimenten te labelen, bereid je vers SCEX-medium met 100 nanomolar MitoTracker Deep Red FM en 100 nanomolar LysoTracker Red. En voeg het toe aan de microfluïde kamers. Broed ze 30 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius.Was dan drie keer met warm SCEX medium. Ga verder met live beeldvorming van axonaal vervoer. Het verwerven van een 100 time lapse beeldreeks met drie seconden intervallen.Met een totaal van vijf minuten per film. Na zeven dagen in microfluïde kamers. Muis embryonale HB9 GFP ruggenmerg explants.We zijn bevlekt met MitoTracker Deep Red en LysoTracker Red kleurstoffen. Om de mitochondriën en zure compartimenten te labelen. Axons in de distale groeven werden afgebeeld en Kymograph analyse werd gebruikt om de algemene bewegingsverdeling te bepalen.Dit toonde een bias in de retrograde richting alleen in zure stadscompartimenten, maar niet in mitochondriaal vervoer. De deeltjesdichtheid werd ook gekwantificeerd, waardoor een hoger aantal mitochondriale deeltjes werd onthuld in vergelijking met zure compartimenten in de HB9 GFP-dwarslaesie axonen. Vervolgens werd een analyse van het transport van één deeltje uitgevoerd met behulp van semi-geautomatiseerde software, gevolgd door interne code.Deze analyse toonde aan dat zure componenten en mitochondriën vergelijkbare deeltjessnelheden hebben. Maar alleen zure compartimenten vertonen een vooroordeel naar retrograde beweging. Het isoleren van het embryonale ruggenmerg kan in het begin moeilijk zijn.Oefen deze procedure meerdere malen, zorg ervoor dat de juiste embryonale leeftijd en de juiste dissectie tools te gebruiken. Het gebruik van microfluïde kamers verandert de manier waarop we axonale biologie bestuderen. Het stelt ons in staat om gelokaliseerde axonale processen te visualiseren, waarvan we ooit verondersteld zijn om alleen in het cellichaam voor te komen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Gepaarde Patch Clamp Recordings van Motor-neuron en Target Skeletal Muscle in de zebravis

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Real-time beeldvorming van Axonale Vervoer van Quantum Dot-label BDNF in primaire neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Assay voor het meten van nucleocytoplasmisch transport in realtime binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Een eenvoudige neurologische mechanische letselmethode om te bestuderen<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Elektrofysiologische meting van samengestelde spier actiepotentiaal van de voorpoten in muismodellen van Motor Neuron degeneratie

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...