Name: axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Israel Science Foundation (ISF, 561/11) und des Europäischen Forschungsrates (ERC, 309377) unterstützt.

Die Pflege und Behandlung von Tieren in diesem Protokoll wurden unter der Aufsicht und Genehmigung des Tel Aviv University Committee for Animal Ethics durchgeführt.
1. MFC-Vorbereitung
<ol><li>PDMS-Guss in Primärformen (Abbildung 1)<ol>
<li>Kauf oder Erstellung von Primärformen (Wafern) nach einem detaillierten Protokoll9.</li>
		<li>Verwenden Sie Druckluft, um jede Art von Schmutz von der Waferplattform zu entfernen, bevor Sie mit dem...

<ol>
	<li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitostasis+in+Neurons:+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture.">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li><li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease.">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li><li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons.">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).</li><li>Magran&#233;, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li><li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+acidic+intracellular+compartments.">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li><li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration.">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li><li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport,+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether.">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li><li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers.">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li><li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS.">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance.">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ.">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li><li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model.">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 210 (2019).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS.">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li></ol>

In diesem Protokoll beschreiben wir ein System zur Verfolgung des axonalen Transports von Mitochondrien und sauren Kompartimenten in motorischen Neuronen. Diese vereinfachte In-vitro-Plattform ermöglicht eine präzise Steuerung, Überwachung und Manipulation subzellulärer neuronaler Kompartimente und ermöglicht eine experimentelle Analyse der lokalen Funktionen des motorischen Neurons. Dieses Protokoll kann nützlich sein, um MN-Erkrankungen wie ALS zu studieren, um sich auf das Verständnis des zugrunde liegenden Mec...

MNs sind hochpolarisierte Zellen mit langen Axonen, die bei erwachsenen Menschen bis zu einem Meter lang sind. Dieses Phänomen stellt eine kritische Herausforderung für die Aufrechterhaltung der MN-Konnektivität und -Funktion dar. Folglich sind MNs auf den richtigen Transport von Informationen, Organellen und Materialien entlang der Axone von ihrem Zellkörper zur Synapse und zurück angewiesen. Verschiedene zelluläre Komponenten, wie Proteine, RNA und Organellen werden regelmäßig durch die Axone transportiert. Mitochondrien sind wichtige Organellen, die routinemäßig in MNs transportiert werden. Mitochondrien sind essentiell für die richtige Aktivität und Funktion von MNs, verantwortlich für ATP-Versorgung, Kalziumpufferung und Signalisierungsprozesse1,2. Der axonale Transport von Mitochondrien ist ein gut untersuchter Prozess3,4. Interessanterweise wurden Defekte im mitochondrialen Transport berichtet, dass sie an mehreren neurodegenerativen Erkrankungen und speziell an MN-Erkrankungen beteiligt waren5. Saure Fächer dienen als weiteres Beispiel für intrinsische Organellen, die sich entlang von MN-Axonen bewegen. Saure Kompartimente umfassen Lysosomen, Endosomen, Trans-Golgi-Apparate und bestimmte sekretole Vesikel6. Defekte im axonalen Transport von sauren Kompartimenten wurden bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen sowie7gefunden, und neuere Papiere unterstreichen ihre Bedeutung bei MN-Erkrankungen8.
Zur effizienten Untersuchung des axonalen Transports werden häufig mikrofluidische Kammern verwendet, die somatische und axonale Kompartimente trennen9,10. Die beiden wesentlichen Vorteile des mikrofluidischen Systems und die Abschottung und Isolierung von Axonen machen es ideal für die Untersuchung subzellulärer Prozesse11. Die räumliche Trennung zwischen den neuronalen Zellkörpern und Axonen kann verwendet werden, um die extrazellulären Umgebungen verschiedener neuronaler Kompartimente (z. B. Axone vs. Soma) zu manipulieren. Biochemische, neuronale Wachstum/Degeneration und Immunfluoreszenz-Assays profitieren alle von dieser Plattform. MFCs können auch bei der Untersuchung der Zell-zu-Zell-Kommunikation helfen, indem sie Neuronen mit anderen Zelltypen kokultieren, wie Skelettmuskeln12,13,14.
Hier beschreiben wir ein einfaches, aber präzises Protokoll zur Überwachung von Mitochondrien und sauren Kompartimententransporten in motorischen Neuronen. Wir zeigen die Anwendung dieser Methode weiter, indem wir den relativen Prozentsatz der retrograden und anterogradbewegten Organellen sowie die Verteilung der Transportgeschwindigkeit vergleichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon DU-897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARA-C (Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td>stock of 2mM in filtered DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.25mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504530</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 6mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504533</td>
			<td>For preperation of small MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 7mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504534</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane Imaris software - version 8.4.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A3311-100G</td>
			<td>5% w/v in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimetylsilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#386529-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>C-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Medium - Optiprep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>stock 10mg/mL in neurobasal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14200-067</td>
			<td>dilute 1:10 in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont fine forceps #55 0.05 &#215; 0.02 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>1125520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Hardener</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>IPE 743</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Resin</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>RP 026UV</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>G-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9:GFP mice strain</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14185-045</td>
			<td>Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, curved, 10 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 9 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-440-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep-Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8638</td>
			<td>Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>DOW Corning Corporation</td>
			<td>#3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>stock 25 mg/mL in 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU X-1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system

Motorneuronen (MNs) sind hochpolarisierte Zellen mit sehr langen Axonen. Axonaler Transport ist ein entscheidender Mechanismus für die MN-Gesundheit und trägt zu neuronalen Wachstum, Entwicklung und Überleben bei. Wir beschreiben eine detaillierte Methode zur Verwendung von mikrofluidischen Kammern (MFCs) zur Verfolgung des axonalen Transports von fluoreszierend markierten Organellen in MN-Axonen. Diese Methode ist schnell, relativ kostengünstig und ermöglicht die Überwachung intrazellulärer Hinweise in Raum und Zeit. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für: 1) Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) MFCs; 2) Beschichtung von ventralen Rückenmarksexaten und MN dissoziierte Kultur in MFCs; 3) Kennzeichnung von Mitochondrien und sauren Kompartimenten, gefolgt von einer lebendigen konfokalen Vorstellung; 4) Manuelle und halbautomatische axonale Transportanalyse. Schließlich zeigen wir einen Unterschied im Transport von Mitochondrien und sauren Kompartimenten von HB9::GFP ventrale Rückenmarks-Explantationsaxone als Beweis für die Systemgültigkeit. Insgesamt bietet dieses Protokoll ein effizientes Werkzeug zur Untersuchung des axonalen Transports verschiedener axonaler Komponenten sowie ein vereinfachtes Handbuch für die MFC-Nutzung, um räumliche experimentelle Möglichkeiten zu entdecken.

Nach dem beschriebenen Protokoll wurden Mausembryonale HB9::GFP Rückenmarksexplantationen in MFC kultiviert (Abbildung 4A). Die Explants wurden 7 Tage lang angebaut, als Axone vollständig in das distale Fach gelangten. Mitotracker Deep Red und Lysotracker Rote Farbstoffe wurden den distalen und proximalen Fächern hinzugefügt, um die Mitochondrien und sauren Fächer zu kennzeichnen (Abbildung 4C</stron...

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Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Der axonale Transport ist ein entscheidender Mechanismus für die Gesundheit des motorischen Neurons. In diesem Protokoll bieten wir eine detaillierte Methode zur Verfolgung des axonalen Transports von sauren Kompartimenten und Mitochondrien in motorischen Neuronaxonen mit mikrofluidischen Kammern.

Axonaler Transport von Organellen in Motorneuronenkulturen mit Mikrofluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Der axonale Transport ist entscheidend für die neuronale Gesundheit und Lebensfähigkeit. Unser Protokoll beschreibt eine elegante Methode zur Überwachung und Analyse des axonalen Transports. Und kann für verschiedene neuronale Krankheitsmodelle angepasst werden.Der Einsatz mikrofluidischer Kammern ermöglicht eine präzise räumliche zeitliche Kontrolle, die für das Studium der Axonalbiologie von entscheidender Bedeutung ist. Axonale Transportanomalien sind mit mehreren neurodegenerativen Erkrankungen wie ALS involviert. Die mikrofluidische Plattform ermöglicht das Studium grundlegender Mechanismen sowie das Testen von Therapien zur Reparatur axonaler Transportfehler.Die mikrofluidische Kammerplattform kann leicht an verschiedene Aspekte der axonalen Forschung angepasst werden, einschließlich axonalem Wachstum und Degeneration verschiedener neuronaler Subtypen. Diese Methode ist komplex und wird in der Regel praxisaufbereitet. Die visuelle Demonstration wird die Zugänglichkeit dieses Verfahrens für jeden Wissenschaftler verbessern, der an der Untersuchung des axonalen Transports interessiert ist.Beginnen Sie mit dem Gießen von PDMS in Primärformen. Verwenden Sie Druckluft, um Schmutz von der Wafer-Plattform zu entfernen, um sicherzustellen, dass die Wafer glatt und klar aussehen, bevor Sie fortfahren. Als nächstes füllen Sie einen Behälter mit flüssigem Stickstoff und bereiten Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 23-Spur-Nadel vor.In eine chemische Rauchhaube geben Sie die Wafermitbleche in einen verschließbaren Behälter und füllen Sie die Spritze mit zwei Milliliterflüssigstickstoff pro Wafer, der Platte enthält. Öffnen Sie eine Chlorotrimethylsilanflasche. Pierce die Gummikappe mit der Spritze und injizieren Sie den Stickstoff in die Flasche.Ohne die Nadel herauszuziehen, drehen Sie die Flasche auf den Kopf und ziehen Sie zwei Milliliter Chlorotrimethylsilan für jeden Wafer, der Platte enthält. Das Chlortrimethylsilan im Behälter verteilen, jedoch nicht direkt auf dem Wafer, der die Platte enthält. Schließen Sie den Container.Und inkubieren Sie es für fünf Minuten pro Wafer. Als nächstes wiegen 47,05 Gramm PDMS-Basis in einem 50-Milliliter-Rohr, und fügen Sie PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 16 zu 1 Basis zu Härtungsmittel für insgesamt 50 Gramm. Mischen Sie das PDMS für 10 Minuten auf einem Low-Speed-Rotator, dann gießen Sie es in jeden Wafer mit Platte auf die gewünschte Höhe.Legen Sie die Platten für zwei Stunden in einen Vakuumaustrocknungsor. Die Luft im PDMS eingeschlossen wird, und bilden eine klare einheitliche Form. Danach die Teller im Ofen für drei Stunden oder über Nacht bei 70 Grad Celsius bebrüten.So erstellen Sie die mikrofluidische Kammer oder MFC. Schneiden und entfernen Sie die PDMS-Formen von der Platte mit einem Skalpell, um sicherzustellen, dass die Formen nicht zu zwingen, weil sie zerbrechlich sind. Folgen Sie den Anweisungen im Textmanuskript, um die Kammern je nach Versuchsaufbau zu stanzen und zu schneiden.Für die Rückenmarks-Explantationskultur zwei Sieben-Millimeter-Bohrungen in die distale Seite eines großen MFC schlagen, um sicherzustellen, dass sie sich mit den Kanalkanten überlappen. Auf der proximalen Seite einen Sieben-Millimeter-Gut in die Mitte des Kanals mit minimaler Überlappung stanzen, so dass genügend Platz für die Explants bleibt. Stanzen Sie zwei zusätzliche ein Millimeter Löcher in die beiden Kanten des proximalen Kanals.Und schneiden Sie das PDMS in Einzelkammern. Drehen Sie dann den MFC nach oben und schnitzen Sie mit einer 20-Meter-Nadel an drei kleinen Explant-Höhlen auf dem gestanzten Sieben-Millimeter-Brunnen. Für die dissoziierte motorische Neuronenkultur vier Sechs-Millimeter-Bohrungen in die Ränder der beiden Kanäle eines kleinen MFC schlagen und das PDMS in Einzelkammern schneiden.Um den MFC zu sterilisieren, verteilen Sie 50 Zentimeter lange Klebebandbänder auf der Bank. Drücken Sie dann beide Gesichter der Kammer auf das Band und ziehen Sie es zurück. Legen Sie die sauberen Kammern in eine neue Platte und inkubieren Sie sie in analytischer Qualität, von 70% Ethanol für 10 Minuten auf einem Orbital-Shaker.Das Ethanol entsorgen und die Kammern in einer Gewebekulturhaube oder im Ofen bei 70 Grad Celsius trocknen. Legen Sie dann die Kammer in der Mitte eines Gewebekultur Grade Glasboden graben, und wenden Sie geringfügige Kraft auf die Kanten, um das PDMS an den Tellerboden zu binden. Inkubieren Sie das Gericht für 10 Minuten bei 70 Grad Celsius.Drücken Sie dann auf die Kammern, um die Haftung zu stärken. Inkubieren Sie die Schale unter UV für 10 Minuten, dann gehen Sie mit der Codierung der MFC. Fügen Sie 1,5 Nanogramm pro Milliliter PLO in beide Fächer.Stellen Sie sicher, dass die PLO durch die Kanäle läuft. Durch Pipettieren der Beschichtungsmedien direkt im Kanaleingang. Untersuchen Sie die MFC unter einem Lichtmikroskop, um nach Blasen zu suchen.Wenn Luftblasen die Mikrorillen blockieren, legen Sie den MFC für zwei Minuten in einen Vakuumaustrocknungsgeräte. Entfernen Sie überschüssige Luft aus den MFC-Kanälen. Dann inkubieren Sie es über Nacht mit PLO.Ersetzen Sie die PLO durch Laminin und inkubieren Sie den MFC für eine zusätzliche Nacht. Waschen Sie das Laminin vor der Beschichtung mit dem Kulturmedium. Sezieren Sie eine schwangere ICR E12.5-Maus und trennen Sie die Embryonen vom Fruchtwassersack.Den Embryo in HBSS-Silikonschale geben. Entfernen Sie den Kopf und Schwanz und kippen Sie es auf seinen Bauch. Abziehen Sie die oberflächliche Haut vorsichtig von den Embryonen zurück und entblößen Sie das Rückenmark.Trennen Sie das Rückenmark vom Körper von Kopf zu Schwanz, mit sanfter Pinzette. Entfernen Sie die Meningen, entfernen Sie dann die Dorsalhörner und schneiden Sie das Rückenmark in einen Millimeter dicken Querprofilen. Entsorgen Sie das gesamte Medium aus dem proximalen Fach des MFC.Nehmen Sie eine einzelne Rückenmarksexplantation mit einer Pipette in einem Gesamtvolumen von vier Mikrolitern auf. Und injizieren Sie es so nah wie möglich an die Höhle. Zeichnen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem proximalen Brunnen über die seitlichen Auslässe.Wiederholen Sie den vorherigen Schritt zwei weitere Male, und stellen Sie sicher, dass die Explants in den proximalen Kanal eingebettet sind. Langsam 150 Mikroliter SCEX-Medium zum proximalen Brunnen hinzufügen. Einen Tag nach der Beschichtung.Das SCEX-Medium im proximalen Fach ersetzt und das distale Fach mit einem reichhaltigen SCEX-Medium ergänzt. Aufrechterhaltung eines Volumengradienten von mindestens 15 Mikroliter pro Brunnen zwischen den distalen und proximalen Brunnen. Nach vier bis sechs Tagen sollten die Axone in das distale Fach gelangen und für die axonale Transport-Bildgebung bereit sein.Um die Mitochondrien und sauren Fächer zu kennzeichnen, bereiten Sie frisches SCEX-Medium mit 100 Nanomolar MitoTracker Deep Red FM und 100 Nanomolar LysoTracker Red vor. Und fügen Sie es zu den mikrofluidischen Kammern hinzu. Inkubieren Sie sie für 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius.Dann dreimal mit warmem SCEX-Medium waschen. Fahren Sie mit der Live-Bildgebung des axonalen Transports fort. Erfassen einer 100-Zeitraffer-Bildserie in drei Sekundenintervallen.Mit insgesamt fünf Minuten pro Film. Nach sieben Tagen in mikrofluidischen Kammern. Maus embryonale HB9 GFP Rückenmarksexplanten.Wir sind mit MitoTracker Deep Red und LysoTracker Red Farbstoffen gefärbt. Zur Kennzeichnung der Mitochondrien und sauren Fächer. Axone in den distalen Rillen wurden abgebildet und Kymographenanalyse wurde verwendet, um die allgemeine Bewegungsverteilung zu bestimmen.Dies offenbarte eine Verzerrung in der rückwärtsgerichteten Richtung nur in sauren Stadtteilen, aber nicht im mitochondrialen Transport. Die Partikeldichte wurde ebenfalls quantifiziert, was eine höhere Anzahl von mitochondrialen Partikeln im Vergleich zu sauren Kompartimenten in den HB9 GFP Rückenmarks-Explantaxonen aufwies. Als nächstes wurde eine Einzelpartikeltransportanalyse mit halbautomatischer Software und anschließendem inhouse-Code durchgeführt.Diese Analyse ergab, dass saure Komponenten und Mitochondrien ähnliche Partikelgeschwindigkeiten aufweisen. Aber nur saure Fächer zeigen eine Neigung zur retrograden Bewegung. Die Isolierung des embryonalen Rückenmarks kann zunächst schwierig sein.Üben Sie dieses Verfahren mehrmals, um sicherzustellen, dass das richtige embryonale Alter und die entsprechenden Sezierwerkzeuge verwendet werden. Der Einsatz von mikrofluidischen Kammern verändert die Art und Weise, wie wir axonale Biologie studieren. Es ermöglicht uns, lokalisierte axonale Prozesse zu visualisieren, von denen wir einmal vermuten, dass sie nur im Zellkörper auftreten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Forschung

Neurowissenschaften

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Eine einfache neuronale mechanische Verletzungsmethodik zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Elektrophysiologische Messungen der zusammengesetzten Muskel Aktionspotential aus die Vorderbeine in Maus-Modellen der Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...