Name: axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מקרן המדע הישראלית (קרן, 561/11) ומועצת המחקר האירופית (ERC, 309377).

טיפול בבעלי חיים בפרוטוקול זה בוצע בפיקוח ובאישור הוועדה לאתיקה בעלי חיים באוניברסיטת תל אביב.
1. הכנה MFC
<ol><li>הליהוק של PDMS בתבניות ראשיות (איור 1)<ol>
<li>לרכוש או ליצור תבניות ראשיות (וופלים) בעקבות פרוטוקול מפורט9.</li>
		<li>השתמש באוויר בלחץ כדי להסיר...

<ol>
	<li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitostasis+in+Neurons:+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture.">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li><li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease.">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li><li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons.">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).</li><li>Magran&#233;, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li><li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+acidic+intracellular+compartments.">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li><li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration.">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li><li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport,+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether.">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li><li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers.">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li><li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS.">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance.">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ.">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li><li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model.">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 210 (2019).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS.">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li></ol>

בפרוטוקול זה, אנו מתארים מערכת כדי לעקוב אחר התחבורה סיבי של תאי המיטויונים ו חומצי ב נוירונים מוטוריים. זה פשוט בפלטפורמת מבחנה מאפשר שליטה מדויקת, ניטור, ומניפולציה של תאים עצביים תת-תאית, המאפשר ניתוח ניסיוני של התפקוד המקומי בתאי עצב. פרוטוקול זה יכול להועיל ללימוד מחלות MN כגון ALS, כדי ל...

MNs הם תאים מקוטנים מאוד עם axons ארוכים, מגיע עד מטר אחד באורך של בני אדם למבוגרים. תופעה זו יוצרת אתגר קריטי לשמירה על קישוריות ותפקוד של MN. כתוצאה מכך, MNs תלויה בהובלה תקינה של מידע, אורגלים וחומרים לאורך האקסונים מהגוף הסלולארי שלהם אל הסינפסה וחזרה. רכיבים סלולאריים שונים, כגון חלבונים, RNA ואורגלים, מדילג באופן סדיר דרך האקסונים. מיטוכונמיטויום הם אורגלים חשובים אשר מועברים באופן שגרתי ב-MNs. מיטוגרם הם חיוניים לפעילות תקינה ולתפקוד של MNs, האחראי על הוראת ATP, אגירת סידן ותהליכי איתות1,2. התחבורה האקונלית של המיטו, היא תהליך לומד היטב3,4. מעניין, פגמים בתחבורה מיטוכונדריאלי דווחו להיות מעורבים במספר מחלות ניווניות ובמיוחד במחלות MN5. התאים החומציים משמשים כדוגמה נוספת לאורגלים פנימיים הזזים לאורך MN axons. תאי חומציים כוללים ליזוזומים, אנזומים, מכשירי טרנס-גולג'י ושלפוחיות מסוימות. פגמים בתחבורה סיבי של תאים חומציים נמצאו במספר מחלות ניווניות כמו גם7, העיתונים האחרונים להדגיש את חשיבותם במחלות MN8.
כדי לחקור ביעילות את התחבורה סיבי, מיקרופלואידיג צ'יימברס המפרידים בין התאים הסומונטיים והאקאליות משמשים לעתים קרובות9,10. שני היתרונות המשמעותיים של מערכת המיקרופלואידיג, והתקשורת והבידוד של האקסונים, מעבדים אותו באופן אידיאלי ללימוד תהליכים תת-תאיים11. ניתן להשתמש בהפרדה המרחבית בין גופי התאים העצביים לבין האקסונים כדי לתמרן את סביבות החילוץ של התאים העצביים השונים (לדוגמה, אקסונים vs. סומה). , והתנוונות שהכל מהווה תועלת. מפלטפורמה זו Mfcs יכול גם לסייע ללמוד תקשורת תא לתאים על ידי הנוירונים coculturing עם סוגי תאים אחרים, כגון שרירי השלד12,13,14.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט אך מדויק עבור ניטור המיטו, התחבורה תא חומצי בתוך נוירונים מוטוריים. אנו מציגים את השימוש בשיטה זו על-ידי השוואת האחוז היחסי של מארגני נסיגה וכיתות מעבר, כמו גם הפצת מהירות התחבורה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon DU-897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARA-C (Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td>stock of 2mM in filtered DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.25mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504530</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 6mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504533</td>
			<td>For preperation of small MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 7mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504534</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane Imaris software - version 8.4.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A3311-100G</td>
			<td>5% w/v in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimetylsilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#386529-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>C-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Medium - Optiprep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>stock 10mg/mL in neurobasal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14200-067</td>
			<td>dilute 1:10 in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont fine forceps #55 0.05 &#215; 0.02 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>1125520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Hardener</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>IPE 743</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Resin</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>RP 026UV</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>G-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9:GFP mice strain</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14185-045</td>
			<td>Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, curved, 10 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 9 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-440-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep-Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8638</td>
			<td>Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>DOW Corning Corporation</td>
			<td>#3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>stock 25 mg/mL in 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU X-1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system

מוטוריים נוירונים (MNs) הם תאים מקוטב מאוד עם axons ארוכים מאוד. הובלה axonal היא מנגנון מכריע עבור בריאות MN, לתרום צמיחה עצבית, פיתוח, והישרדות. אנו מתארים שיטה מפורטת לשימוש בתאי מיקרו-פלואידים (mfcs) למעקב אחר העברת אקונאליות של אורגלים בעלי תווית של מוצרים בעלי מחשב בצורת סיבי MN. שיטה זו היא מהירה, זולה יחסית, ומאפשרת ניטור של רמזים תאיים בחלל ובזמן. אנו מתארים צעד אחר צעד פרוטוקול עבור: 1) ייצור של polydiמתיל siloxane (PDMS) MFCs; 2) ציפוי של הרחבות בחוט השדרה והתרבות המונתק של MN ב-MFCs; 3) הוספת תוויות לתאי המיטומטר וחומציים בעקבות הדמיון הישיר; 4) ניתוח הובלה באופן ידני וחצי אוטומטי. לבסוף, אנו להפגין הבדל בהובלה של תאים חומציים וחומצי של HB9:: gfp ובעל חוט השדרה לחקור אקסונים כהוכחה של תוקף המערכת. לגמרי, פרוטוקול זה מספק כלי יעיל ללימוד התחבורה סיבי של רכיבי סיבי שונים, כמו גם מדריך פשוט עבור שימוש MFC כדי לעזור לגלות אפשרויות ניסיוני מרחבי.

בעקבות הפרוטוקול המתואר, עכבר עובריים HB9:: GFP בחוט השדרה האקסוצמחים היו מתורבתים ב-MFC (איור 4א). , האקסוצמחים גדלו במשך 7 ימים. כשהאקטונים הצטלבו לתוך התא המרוחק Mitotracker עמוק אדום ו Lysotracker צבעים אדום נוספו לתאי הבית הרחוק ביותר כדי לתייג את המיטוa ו חומצ...

Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

הובלה axonal היא מנגנון מכריע. לבריאות תא העצב המוטורי בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה מפורטת למעקב אחר התחבורה סיבי של תאים חומצי והמיטו, בתאי עצב מוטוריים באמצעות מיקרופלואידיג צ'יימברס.

הובלה אקונלית של אורגלות בתרביות תאי עצב מוטוריים באמצעות מערכת צ'יימברס מיקרופלואידיג

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

תחבורה אקסונאלית חיונית לבריאות וכדאיות עצבית. הפרוטוקול שלנו מתאר שיטה אלגנטית לניטור וניתוח תחבורה אקסונאלית. והוא יכול להיות מותאם עבור מודלים שונים של מחלות עצביות.השימוש בתאים מיקרופלואידיים מאפשר שליטה זמנית מרחבית מדויקת, החיונית לחקר הביולוגיה האקסונאלית. הפרעות תחבורה אקסונאליות מעורבים עם מספר מחלות ניווניות כגון ALS. הפלטפורמה המיקרופלואידית מאפשרת לימוד מנגנונים בסיסיים, כמו גם בדיקת טיפולים לתיקון פגמים בתחבורה האקסונאלית.ניתן להתאים בקלות את פלטפורמת התא המיקרופלואידית להיבטים שונים של מחקר אקסונאלי, כולל צמיחה אקסונאלית והתנוונות של תת-סוגים עצביים שונים. שיטה זו מורכבת ובדרך כלל מלמדת מעשית. ההדגמה החזותית תגדיל את הנגישות של הליך זה לכל מדען המעוניין ללמוד תחבורה אקסונאלית.התחל על ידי יציקת PDMS בתבניות ראשוניות. השתמש באוויר בלחץ כדי להסיר כל לכלוך מפלטפורמת הוופל, לוודא כי הוופלים נראים חלקים וברורים לפני שתמשיך. לאחר מכן, למלא מיכל עם חנקן נוזלי ולהכין מזרק 10 מיליליטר עם מחט 23 מד.במכסה המנוע של אדים כימיים, מניחים את הוופל המכיל צלחת במיכל אטום, וממלאים את המזרק בשני מיליליטר של חנקן נוזלי לכל רקיק המכיל צלחת. פתח בקבוק כלורוטרימיטילסיליין. לנקב את כובע הגומי עם המזרק ולהזריק את החנקן לתוך הבקבוק.מבלי לשלוף את המחט, להפוך את הבקבוק במהופך ואת החסרונות שני מיליליטר של chlorotrimethylsilane עבור כל רקיק המכיל צלחת. מורחים את הכלורוטרימתילסילן במיכל, אך לא ישירות על הוופל המכיל צלחת. סגור את הגורם המכיל.ולהדקר אותו במשך חמש דקות לכל רקיק. הבא לשקול 47.05 גרם של בסיס PDMS בצינור 50 מיליליטר, ולהוסיף סוכן ריפוי PDMS ביחס של 16 ל 1 בסיס לריפוי סוכן עבור סך של 50 גרם. מערבבים את ה- PDMS במשך 10 דקות על מסובב במהירות נמוכה, ואז יוצקים אותו לתוך כל רקיק המכיל צלחת לגובה הרצוי.מניחים את הצלחות בתוך מעבה ואקום במשך שעתיים. אשר יסיר אוויר לכוד בתוך PDMS, ו ליצור עובש אחיד ברור. לאחר מכן לה הדגירה את הצלחות בתנור במשך שלוש שעות או לילה ב 70 צלזיוס.כדי ליצור את התא המיקרופלואידי או MFC. חותכים ומסירים את תבניות ה-PDMS מהצלחת עם אזמל, ומוודאים לא לכפות את התבניות כי הן שבריריות. בצע את ההוראות בכתב היד טקסט כדי אגרוף לחתוך את התאים, בהתאם ההתקנה הניסיונית.לתרבות explant חוט השדרה, אגרוף שתי בארות שבעה מילימטר בצד הדיסטלי של MFC גדול, לוודא שהם יחפפו עם קצוות התעלה. בצד הפרוקסימלי, אגרוף אחד שבעה מילימטר גם באמצע התעלה עם חפיפה מינימלית, כך מספיק מקום נשאר עבור explants. ניקוב שני חורים נוספים מילימטר אחד בשני הקצוות של התעלה הפרוקסימלית.וחתכו את ה-PDMS לחדרים בודדים. ואז להפוך את MFC פונה כלפי מעלה, ולהשתמש מחט מד 20 כדי לגלף בשלוש מערות explant קטן על אגרוף שבעה מילימטר היטב. לתרבות נוירונים מוטוריים מנותקים, אגרוף ארבע בארות שישה מילימטר, בקצוות של שני הערוצים של MFC קטן לחתוך את PDMS לתאים בודדים.כדי לעקר את ה-MFC, פזרו על הספסל להקות קלטות דביקות באורך 50 ס"מ. ואז ללחוץ על שני הפנים של התא בקלטת ולמשוך אותו בחזרה. מניחים את התאים הנקיים בצלחת חדשה ו דגירה אותם בכיתה אנליטית, של 70% אתנול במשך 10 דקות על שייקר מסלולית.יש להשליך את האתנול ולייבש את התאים במכסה המנוע של תרבות הרקמה או בתנור בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מניחים את התא במרכז תעלת זכוכית כיתה תרבות רקמה, ולהחיל כוח קטין על הקצוות כדי לקשור את PDMS לתחתית המנה. דגירה המנה במשך 10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס.לאחר מכן לחץ על התאים כדי לחזק את הדבקות. הדגירה את המנה תחת UV במשך 10 דקות, ולאחר מכן להמשיך קידוד MFC. הוסף 1.5 ננוגרם למיליליטר אש"ף לשני התאים.לוודא כי אש"ף פועל דרך הערוצים. על ידי צינורות מדיה ציפוי ישירות בכניסה לתעלה. בדוק את MFC תחת מיקרוסקופ אור, כדי לבדוק בועות.אם בועות אוויר חוסמות את חריצים מיקרו, למקם את MFC ב desiccators ואקום במשך שתי דקות. הסר אוויר עודף מערוצי MFC. ואז לה הדגירה אותו לילה עם אש"ף.החלף את אש"ף בלמינין ודגירה של ה- MFC ללילה נוסף. לפני הציפוי, לשטוף את למינין עם מדיום תרבות. לנתח עכבר ICR E12.5 בהריון, ולהפריד את העוברים ממקום מי המפיר.שים את העובר בצלחת סיליקון HBSS. הסר את הראש והזנב והפוך אותו על בטנו. לקלף בעדינות את העור השטחי מן העוברים בחזרה, חושף את חוט השדרה.הפרד את חוט השדרה מהגוף מהראש לזנב, באמצעות פינצטה עדינה. הסר את קרום המוח, ולאחר מכן להסיר את קרני הגב לחתוך את חוט השדרה לתוך חלקים רוחביים עבים מילימטר אחד. השלך את כל המדיום מהתא הפרוקסימלי של ה- MFC.להרים explant חוט עמוד השדרה יחיד עם פיפטה, בנפח כולל של ארבעה microliters. ולהזריק אותו קרוב ככל האפשר למערה. משוך החוצה כל נוזל עודף מן הקן הפרוקסימלי דרך שקעים משניים.חזור על השלב הקודם פעמיים נוספות וודא שההתפוצצות מוטבעת בערוץ הפרוקסימלי. מוסיפים באיטיות 150 מיקרוליטרים של מדיום SCEX, לגם הפרוקסימלי. יום אחד אחרי ציפוי.החליף את מדיום SCEX בתא הפרוקסימלי והוסיף מדיום SCEX עשיר לתא הדיסטלי. שמירה על שיפוע נפח של לפחות 15 מיקרוליטרים לגם בין בארות דיסטליות ופרוקסימליות. לאחר ארבעה עד שישה ימים, האקסונים צריכים לעבור לתא הדיסטלי ויהיו מוכנים להדמיית הובלה אקסונאלית.כדי לתייג את המיטוכונדריה ואת התאים החומציים, הכינו מדיום SCEX טרי עם 100 ננומולרים MitoTracker אדום עמוק FM, ו 100 ננומולרים LysoTracker אדום. ולהוסיף אותו לחדרים המיקרופלואידיים. דגירה אותם במשך 30 עד 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם מדיום SCEX חם. המשך עם הדמיה חיה של הובלה אקסונאלית. רכישת סדרת תמונות של 100 פעמים בשלושה מרווחי זמן שניים.עם סך של חמש דקות לכל סרט. אחרי שבעה ימים בתאים מיקרופלואידיים. עכבר עוברי HB9 GFP חוט השדרה מתפוצץ.אנחנו מוכתמים בצבעי MitoTracker אדום עמוק וצבעים אדומים של LysoTracker. כדי לתייג את המיטוכונדריה ותאים חומציים. אקסונים בחורצים הדיסטליים דימוי וניתוח Kymograph שימש כדי לקבוע את התפלגות התנועה הכללית.זה חשף הטיה בכיוון הנסיגה רק בתאי העיר החומציים, אך לא בתחבורה המיטוכונדרית. צפיפות החלקיקים כומתה גם היא, וחשפה מספר גבוה יותר של חלקיקי מיטוכונדריה בהשוואה לתאים חומציים באקסונים של חוט השדרה HB9 GFP. לאחר מכן, ניתוח הובלת חלקיקים יחיד נערך באמצעות תוכנה חצי אוטומטית ואחריה קוד מקומי.ניתוח זה גילה כי רכיבים חומציים מיטוכונדריה יש מהירות חלקיקים דומים. אבל רק תאים חומציים מציגים הטיה לתנועה מדרדרת. בידוד חוט השדרה העוברי יכול להיות קשה בהתחלה.תרגל הליך זה מספר פעמים, הקפד להשתמש בגיל העוברי הנכון ובכלי הניתוח המתאימים. השימוש בתאים מיקרופלואידיים משנה את האופן שבו אנו חוקרים ביולוגיה אקסונאלית. זה מאפשר לנו לדמיין תהליכים אקסונאליים מקומיים, אשר אנו משערים פעם להתרחש רק בגוף התא.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

מותאמים הצמד תיקון הקלטות מ-מוטור נוירון שרירים יעד השלד דג הזברה

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

גזירת תרבויות Oligodendrocyte מועשר Neuron Oligodendrocyte / Myelinating משותף תרבויות מן שלאחר הלידה רקמות Murine

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

הדמיה של axonal תחבורה של Quantum בזמן אמת Dot-כותרת BDNF בנוירונים העיקרי

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; נוירון מוטון ניוון

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

אין ויוו מדידות אלקטרופיזיולוגיות של פוטנציאל הפעולה השריר מורכב מ Forelimbs העכבר דגמים של ניוון מוטורי נוירון

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...