Name: axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

इस काम को इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ, 561/11) और यूरोपियन रिसर्च काउंसिल (ईआरसी, 309377) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

इस प्रोटोकॉल में जानवरों की देखभाल और उपचार तेल अवीव विश्वविद्यालय की पशु नैतिकता समिति की देखरेख और अनुमोदन के तहत किया गया था ।
1. एमएफसी तैयारी
<ol><li>प्राथमिक मोल्डों में पीडीएम कास्टिंग<strong...

<ol>
	<li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitostasis+in+Neurons:+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture.">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li><li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease.">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li><li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons.">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).</li><li>Magran&#233;, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li><li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+acidic+intracellular+compartments.">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li><li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration.">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li><li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport,+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether.">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li><li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers.">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li><li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS.">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance.">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ.">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li><li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model.">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 210 (2019).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS.">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल में, हम मोटर न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों के अक्षत परिवहन को ट्रैक करने के लिए एक प्रणाली का वर्णन करते हैं। यह सरलीकृत इन विट्रो प्लेटफ़ॉर्म मोटर न्यूरॉन स्थानीय कार...

एमएनएस लंबे अक्षों के साथ अत्यधिक ध्रुवीकृत कोशिकाएं हैं, जो वयस्क मनुष्यों में एक मीटर तक लंबी तक पहुंच ती हैं। यह घटना एमएन कनेक्टिविटी और कार्य के रखरखाव के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती पैदा करती है। नतीजतन, एमएनएस अपने सेल शरीर से सिनेप्स और बैक तक एक्सोन के साथ जानकारी, ऑर्गेनेल्स और सामग्रियों के उचित परिवहन पर निर्भर करते हैं। विभिन्न सेलुलर घटक, जैसे प्रोटीन, आरएनए और ऑर्गेनेल्स को नियमित रूप से एक्सोन के माध्यम से शटल किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया महत्वपूर्ण ऑर्गेनेल्स हैं जिन्हें नियमित रूप से एमएनएस में ले जाया जाता है। मिटोकॉन्ड्रिया एमएनएस की उचित गतिविधि और कार्य के लिए आवश्यक हैं, जो एटीपी प्रावधान, कैल्शियम बफरिंग और सिग्नलिंग प्रक्रियाओं1,,2के लिए जिम्मेदार हैं। माइटोकॉन्ड्रिया का एक्सोनल ट्रांसपोर्ट एक अच्छी तरह से अध्ययन की गई प्रक्रिया3,4है । दिलचस्प बात यह है कि माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन में दोष कई न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में और विशेष रूप से एमएनरोगों 5में शामिल होने की सूचना मिली थी । अम्लीय डिब्बे आंतरिक ऑर्गेनेल्स के लिए एक और उदाहरण के रूप में काम करते हैं जो एमएन एक्सॉन के साथ चलते हैं। अम्लीय डिब्बों में लिसोसोम्स, एंडोसोम्स, ट्रांस-गोलगी उपकरण और कुछ स्रावात्मक वेसिकल्स6शामिल हैं। अम्लीय डिब्बों के अक्षत के परिवहन में दोष कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के साथ - साथ7में पाए गए और हाल के पत्र एमएनरोगों 8में उनके महत्व को उजागर करते हैं ।
एक्सोनल परिवहन का कुशलतापूर्वक अध्ययन करने के लिए, सूक्ष्म तरल कक्ष जो अलग-अलग दैहिक और एक्सोनल डिब्बों का उपयोग अक्सर9,,10करते हैं। माइक्रोफ्लूइडिक प्रणाली के दो महत्वपूर्ण फायदे, और डिब्बेीकरण और एक्सोन का अलगाव, इसे उपसेलुलर प्रक्रियाओं11के अध्ययन के लिए आदर्श प्रदान करता है। न्यूरोनल सेल निकायों और एक्सोन के बीच स्थानिक अलगाव का उपयोग विभिन्न न्यूरोनल डिब्बों (जैसे, अक्षों बनाम सोमा) के बाह्य वातावरण में हेरफेर करने के लिए किया जा सकता है। जैव रासायनिक, न्यूरोनल विकास/पतन, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस इस मंच से सभी लाभ कहते हैं । एमएफसी अन्य सेल प्रकारों के साथ न्यूरॉन्स को कोकुल्चरिंग करके सेल-टू-सेल संचार का अध्ययन करने में भी सहायता कर सकता है, जैसे कंकाल की मांसपेशियां12,,13,,14।
यहां, हम मोटर न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बे परिवहन की निगरानी के लिए एक सरल अभी तक सटीक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम आगे प्रतिगामी और पूर्ववर्ती चलती ऑर्गेनेल्स के सापेक्ष प्रतिशत की तुलना करके इस विधि के उपयोग को दिखाते हैं, साथ ही परिवहन वेग के वितरण को भी दिखाते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon DU-897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARA-C (Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td>stock of 2mM in filtered DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.25mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504530</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 6mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504533</td>
			<td>For preperation of small MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 7mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504534</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane Imaris software - version 8.4.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A3311-100G</td>
			<td>5% w/v in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimetylsilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#386529-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>C-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Medium - Optiprep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>stock 10mg/mL in neurobasal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14200-067</td>
			<td>dilute 1:10 in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont fine forceps #55 0.05 &#215; 0.02 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>1125520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Hardener</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>IPE 743</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Resin</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>RP 026UV</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>G-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9:GFP mice strain</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14185-045</td>
			<td>Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, curved, 10 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 9 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-440-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep-Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8638</td>
			<td>Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>DOW Corning Corporation</td>
			<td>#3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>stock 25 mg/mL in 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU X-1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system

मोटर न्यूरॉन्स (एमएनएस) बहुत लंबे समय तक अक्षतके साथ अत्यधिक ध्रुवीकृत कोशिकाएं हैं। एक्सोनल परिवहन एमएन स्वास्थ्य के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र है, जो न्यूरोनल विकास, विकास और अस्तित्व में योगदान देता है। हम एमएन एक्सॉन में फ्लोरोसेंटी लेबल ऑर्गेनेल्स के एक्सोनल परिवहन पर नज़र रखने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक कक्षों (एमएफसी) के उपयोग के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं। यह विधि तेजी से, अपेक्षाकृत सस्ती है, और अंतरिक्ष और समय में इंट्रासेलुलर संकेतों की निगरानी के लिए अनुमति देती है। हम के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम का वर्णन: 1) पॉलीडिमिथाइलसिलिक्साने (पीडीएम) एमएफसी का निर्माण; 2) मेएफसी में वेंट्रल रीढ़ की हड्डी के एक्सप्लांट ्स और एमएन विसोसिएटेड संस्कृति की चढ़ाना; 3) माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों की लेबलिंग लाइव कॉन्फोकल इमेजिंग के बाद; 4) मैनुअल और अर्धस्वचालित एक्सोनल परिवहन विश्लेषण। अंत में, हम एचबी9 के माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों के परिवहन में अंतर प्रदर्शित करते हैं::GFP वेंट्रल रीढ़ की हड्डी एक्सप्लांट एक्सप्लांट एक्सोन सिस्टम वैधता के सबूत के रूप में। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल विभिन्न एक्सोनल घटकों के अक्षीय परिवहन का अध्ययन करने के साथ-साथ स्थानिक प्रयोगात्मक संभावनाओं की खोज में मदद करने के लिए एमएफसी उपयोग के लिए एक सरलीकृत मैनुअल प्रदान करता है।

वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, माउस भ्रूणीय HB9:: GFP रीढ़ की हड्डी explants एमएफसी में सुसंस्कृत थे(चित्रा 4ए)। एक्सप्लांट्स 7 दिनों के लिए उगाए गए थे, जब एक्सॉन पूरी तरह से डिस्टल डिब्बे म?...

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Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

अक्षीय परिवहन मोटर न्यूरॉन स्वास्थ्य के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र है। इस प्रोटोकॉल में हम माइक्रोफ्लूइडिक कक्षों का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन एक्सोन में अम्लीय डिब्बों और माइटोकॉन्ड्रिया के अक्षीय परिवहन को ट्रैक करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करते हैं।

माइक्रोफ्लूइडिक चैम्बर्स सिस्टम का उपयोग करके मोटर न्यूरॉन संस्कृतियों में ऑर्गेनेल्स का एक्सोनल परिवहन

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

अक्षीय परिवहन न्यूरोनल स्वास्थ्य और व्यवहार्यता के लिए महत्वपूर्ण है। हमारा प्रोटोकॉल अक्षांक परिवहन की निगरानी और विश्लेषण के लिए एक सुरुचिपूर्ण विधि का वर्णन करता है। और विभिन्न न्यूरोनल रोग मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों का उपयोग सटीक स्थानिक लौकिक नियंत्रण को सक्षम करता है, जो अक्षीय जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक्सोनल परिवहन असामान्यताओं को एएलएस जैसे कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के साथ फंसाया जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म बुनियादी तंत्रों के अध्ययन के साथ-साथ अक्षनल परिवहन दोषों की मरम्मत के लिए चिकित्सा का परीक्षण करने में सक्षम बनाता है।माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर प्लेटफॉर्म को अक्षीय अनुसंधान के विभिन्न पहलुओं के अनुरूप आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें अक्षीय विकास और विभिन्न तंत्रिका उपप्रकारों का पतन शामिल है। यह विधि जटिल है और आमतौर पर हाथ पर सिखाया है। दृश्य प्रदर्शन अक्षीय परिवहन का अध्ययन करने में रुचि रखने वाले किसी भी वैज्ञानिक के लिए इस प्रक्रिया की पहुंच में वृद्धि करेगा।प्राथमिक मोल्डों में पीडीएमएस कास्टिंग द्वारा शुरू करें। वेफर प्लेटफॉर्म से किसी भी गंदगी को हटाने के लिए दबाव वाली हवा का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करें कि आगे बढ़ने से पहले वेफर्स चिकनी और स्पष्ट दिखते हैं। इसके बाद, तरल नाइट्रोजन के साथ एक कंटेनर भरें और 23 गेज सुई के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करें।एक रासायनिक धुएं हुड में, एक सीलबंद कंटेनर में प्लेट युक्त वेफर रखें, और प्रत्येक वेफर युक्त प्लेट के प्रति तरल नाइट्रोजन के दो मिलीलीटर के साथ सिरिंज भरें। क्लोरोट्राइमेथिलसिलेन बोतल खोलें। सिरिंज के साथ रबर कैप को छेदें और बोतल में नाइट्रोजन इंजेक्ट करें।सुई को खींचने के बिना, बोतल को उल्टा करें और प्लेट युक्त प्रत्येक वेफर के लिए क्लोरोट्राइमेथिलसिलेन के दो मिलीलीटर को वापस करें। कंटेनर में क्लोरोट्राइमेथिलसिलेन फैलाएं, लेकिन सीधे वेफर युक्त प्लेट पर नहीं। कंटेनर को बंद कर दें।और इसे प्रति वेफर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। अगले एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में PDMS आधार के ४७.०५ ग्राम वजन, और ५० ग्राम की कुल के लिए इलाज एजेंट के लिए 16 से 1 आधार के अनुपात में PDMS इलाज एजेंट जोड़ें । पीडीएमएस को कम गति वाले रोटेटर पर 10 मिनट के लिए मिलाएं, फिर इसे वांछित ऊंचाई तक प्लेट युक्त प्रत्येक वेफर में डालें।प्लेटों को दो घंटे के लिए वैक्यूम डेसिकेटर के अंदर रखें। जो पीडीएमएस के भीतर फंसी हवा को हटा देगा, और एक स्पष्ट वर्दी मोल्ड बनाएगा। बाद में तीन घंटे या रात भर के लिए एक ओवन में ७० सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट ।माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर या एमएफसी बनाना। कट और एक स्केलपेल के साथ थाली से PDMS मोल्डों को हटा, यकीन है कि मोल्डों बल नहीं है क्योंकि वे नाजुक हो । प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर कक्षों को पंच और काटने के लिए पाठ पांडुलिपि में निर्देशों का पालन करें।रीढ़ की हड्डी के विस्तार संस्कृति के लिए, एक बड़े एमएफसी के डिस्टल साइड में दो सात मिलीमीटर कुओं पंच, सुनिश्चित करें कि वे चैनल किनारों के साथ ओवरलैप होगा बना । समीपस्थ पक्ष पर, न्यूनतम ओवरलैप के साथ चैनल के बीच में एक सात मिलीमीटर अच्छी तरह से पंच करें, ताकि एक्सप्लांट्स के लिए पर्याप्त जगह छोड़ी जा सके। समीपस्थ चैनल के दो किनारों में दो अतिरिक्त एक मिलीमीटर छेद पंच।और पीडीएमएस को सिंगल मैंबर्स में काट लें। फिर एमएफसी को ऊपर की ओर घुमाएं, और मुक्का मारने वाले सात मिलीमीटर अच्छी तरह से तीन छोटे एक्सप्लांट गुफाओं पर तराशने के लिए 20 गेज सुई का उपयोग करें। अलग मोटर न्यूरॉन संस्कृति के लिए, पंच चार छह मिलीमीटर कुओं, एक छोटे एमएफसी के दो चैनलों के किनारों में और एक कक्षों में पीडीएमएस काट दिया ।एमएफसी को स्टरलाइज करने के लिए बेंच पर 50 सेंटीमीटर लंबे चिपचिपे टेप बैंड फैलाएं। इसके बाद चैंबर के दोनों चेहरों को टेप पर दबाएं और वापस खींच लें। एक नई थाली में साफ कक्षों प्लेस और एक कक्षीय शेखर पर 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल की विश्लेषणात्मक ग्रेड में उन्हें इनक्यूबेट।इथेनॉल का निपटान करें और कक्षों को ऊतक संस्कृति हुड में या ओवन में 70 डिग्री सेल्सियस पर सुखाएं। फिर कक्ष को एक ऊतक संस्कृति ग्रेड ग्लास बॉटम खाई के केंद्र में रखें, और पीडीएमएस को डिश बॉटम में बांधने के लिए किनारों पर मामूली बल लागू करें। 70 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पकवान इनक्यूबेट।इसके बाद पालन को मजबूत करने के लिए कोठियों पर दबाएं। यूवी के तहत डिश को 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, फिर एमएफसी को कोडिंग करने के लिए आगे बढ़ें। दोनों डिब्बों में 1.5 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर पीएलओ जोड़ें।यह सुनिश्चित करना कि पीएलओ चैनलों के माध्यम से चल रहा है । चैनल प्रवेश द्वार में सीधे कोटिंग मीडिया को पाइप करके। बुलबुले की जांच करने के लिए, एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत एमएफसी की जांच करें।यदि हवा के बुलबुले माइक्रो खांचे को अवरुद्ध कर रहे हैं, तो एमएफसी को दो मिनट के लिए वैक्यूम डेसीकेटर में रखें। एमएफसी चैनलों से अतिरिक्त हवा निकालें। फिर इसे पीलो के साथ रातोंरात इनक्यूबेट करें ।पीएलओ को लेमिनिन से बदलें और एमएफसी को अतिरिक्त रात के लिए इनक्यूबेट करें। चढ़ाना से पहले, संस्कृति माध्यम के साथ लेमिनिन धोएं। एक आईसीआर E12.5 गर्भवती माउस विच्छेदन, और एमनियोटिक थैली से भ्रूण अलग।भ्रूण को एचबीबीएस सिलिकॉन डिश में डाल दें। सिर और पूंछ निकालें और उसके पेट पर फ्लिप करें। धीरे से भ्रूण वापस से सतही त्वचा छील, रीढ़ की हड्डी को उजागर ।कोमल चिमटी का उपयोग करते हुए रीढ़ की हड्डी को सिर से पूंछ तक शरीर से अलग करें। मेनिंग्स को हटा दें, फिर पृष्ठीय सींग निकालें और रीढ़ की हड्डी को एक मिलीमीटर मोटी ट्रांसवर्स सेक्शन में काट लें। एमएफसी के समीपस्थ डिब्बे से सभी माध्यमों का निपटान करें।चार माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में, एक पिपेट के साथ एक रीढ़ की हड्डी का एक्सप्लांट उठाएं। और इसे गुफा के जितना संभव हो उतना करीब इंजेक्ट करें। पार्श्व आउटलेट के माध्यम से अच्छी तरह से समीपस्थ से किसी भी अतिरिक्त तरल बाहर ड्रा ।पिछले चरण को दो बार दोहराएं और सुनिश्चित करें कि एक्सप्लांट समीपस्थ चैनल में एम्बेडेड हैं। धीरे-धीरे एससीईएक्स माध्यम के 150 माइक्रोलीटर को प्रोक्सीमल वेल में जोड़ें। चढ़ाना के बाद एक दिन।समीपस्थ डिब्बे में एससीईएक्स माध्यम को बदल दिया और डिस्टल डिब्बे में समृद्ध एससीईएक्स माध्यम जोड़ें। डिस्टल और समीपस्थ कुओं के बीच कम से कम 15 माइक्रोलीटर प्रति अच्छी तरह से वॉल्यूम ढाल बनाए रखना। चार से छह दिनों के बाद, अक्षतंतरों को डिस्टल डिब्बे को पार करना चाहिए और अक्षीय परिवहन इमेजिंग के लिए तैयार होना चाहिए।माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों को लेबल करने के लिए, 100 नैनोमोलर मिटोट्रैकर डीप रेड एफएम और 100 नैनोमोलर LysoTracker लाल के साथ ताजा एससीईएक्स माध्यम तैयार करें। और इसे माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में जोड़ें। उन्हें 30 से 60 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।फिर गर्म एससीईएक्स माध्यम से तीन बार धोएं। अक्षानल परिवहन की लाइव इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें। तीन सेकंड के अंतराल पर 100 समय चूक छवि श्रृंखला प्राप्त करना।प्रति फिल्म कुल पांच मिनट के साथ । माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों में सात दिनों के बाद। माउस भ्रूण एचबी9 जीएफपी रीढ़ की हड्डी के पौधे।हम MitoTracker गहरे लाल और LysoTracker लाल रंगों के साथ दाग रहे हैं । माइटोकॉन्ड्रिया और अम्लीय डिब्बों को लेबल करना। डिस्टल खांचे में एक्सॉन को चित्रित किया गया था और सामान्य आंदोलन वितरण निर्धारित करने के लिए Kymograph विश्लेषण का उपयोग किया गया था।इससे केवल अम्लीय शहर के डिब्बों में प्रतिगामी दिशा में पूर्वाग्रह का पता चला, लेकिन माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन में नहीं । कण घनत्व भी मात्रा निर्धारित किया गया था, एचबी9 जीएफपी रीढ़ की हड्डी एक्सप्लांट एक्सॉन में अम्लीय डिब्बों की तुलना में माइटोकॉन्ड्रियल कणों की एक उच्च संख्या का खुलासा । इसके बाद, एकल कण परिवहन विश्लेषण अर्ध-स्वचालित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके आयोजित किया गया था जिसके बाद इन-हाउस कोड था।इस विश्लेषण से पता चला है कि अम्लीय घटकों और माइटोकॉन्ड्रिया में समान कण वेग होते हैं। लेकिन केवल अम्लीय डिब्बे प्रतिगामी आंदोलन की ओर पूर्वाग्रह प्रदर्शित करते हैं । भ्रूण रीढ़ की हड्डी को अलग करना पहली बार में मुश्किल हो सकता है।इस प्रक्रिया को कई बार अभ्यास करें, जिससे सही भ्रूणीय आयु और उचित विच्छेदन उपकरणों का उपयोग करना सुनिश्चित किया जा सके। माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों का उपयोग हम अक्षुण्ण जीव विज्ञान का अध्ययन करने के तरीके को बदलता है। यह हमें स्थानीयकृत अक्षीय प्रक्रियाओं की कल्पना करने की अनुमति देता है, जिसे हम एक बार केवल कोशिका शरीर में होने के लिए परिकल्पना कर रहे हैं।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

मोटर न्यूरॉन से बनती पैच दबाना रिकॉर्डिंग और लक्ष्य Zebrafish में कंकाल की मांसपेशी

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Oligodendrocyte संस्कृति समृद्ध और Oligodendrocyte न्यूरॉन / डाक प्रसव murine ऊतकों से सह संस्कृतियों Myelinating की व्युत्पत्ति

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

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इमेजिंग न्यूरॉन Microfluidic संस्कृति प्लेटफार्म में Glia सहभागिता (MCP) आधारित Neuronal Axon और Glia प्रणाली सह संस्कृति विश्लेषण

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

क्वांटम के Axonal परिवहन की वास्तविक समय इमेजिंग प्राथमिक न्यूरॉन्स में BDNF डॉट लेबल

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Neuromuscular जंक्शन: माप Synapse आकार, confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग Synaptic प्रोटीन घनत्व में विखंडन और परिवर्तन

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

मोटर न्यूरॉन की तरह एनएससी -34 कक्षों के अंदर रीयल टाइम में न्यूक्लूसियोप्लास्मेक ट्रांसपोर्ट को मापने के लिए परख

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

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भ्रूण मोटर न्यूरॉन्स के एक्सोनल प्रोजेक्शन पैटर्न का विज़ुअलाइज़ेशन<em&gt; ड्रोसोफिला</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

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अध्ययन करने के लिए एक साधारण न्यूरॉनल मैकेनिकल इंजेक्शन पद्धति<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; मोटर न्यूरॉन अध: पतन

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

वीवो में Electrophysiological में Forelimbs से यौगिक मांसपेशी कार्रवाई क्षमता की माप मोटर ंयूरॉन अध कि के मॉडल

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

एस्ट्रोसाइट्स में ऑर्गेनेल्स और अन्य कार्गो के इंट्रासेल्यूलर ट्रांसपोर्ट का दृश्य और विश्लेषण करना

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...