Name: axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Israel Science foundation (ISF, 561/11) e del Consiglio europeo della ricerca (ERC, 309377).

La cura e il trattamento degli animali in questo protocollo sono stati eseguiti sotto la supervisione e l'approvazione del Comitato universitario di Tel Aviv per l'etica animale.
1. Preparazione MFC
<ol><li>Fusione PDMS negli stampi primari (Figura 1)<ol>
<li>Acquistare o creare stampi primari (wafer) seguendo un protocollo dettagliato9.</li>
		<li>Utilizzare l'aria pressurizzata per rimuovere qualsiasi tipo di sporco dalla piattaforma wa...

<ol>
	<li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitostasis+in+Neurons:+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture.">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li><li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease.">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li><li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons.">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).</li><li>Magran&#233;, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li><li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+acidic+intracellular+compartments.">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li><li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration.">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li><li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport,+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether.">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li><li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers.">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li><li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS.">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance.">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ.">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li><li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model.">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 210 (2019).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS.">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li></ol>

In questo protocollo, descriviamo un sistema per monitorare il trasporto assonale di mitocondri e compartimenti acidi nei motoneuroni. Questa piattaforma in vitro semplificata consente un controllo preciso, il monitoraggio e la manipolazione dei compartimenti neuronali subcellulari, consentendo l'analisi sperimentale delle funzioni locali dei motoneuroni. Questo protocollo può essere utile per studiare malattie MN come la SLA, per concentrarsi sulla comprensione del meccanismo sottostante di disfunzione del trasporto as...

Le MN sono cellule altamente polarizzate con lunghi assoni, che raggiungono fino a un metro di lunghezza negli esseri umani adulti. Questo fenomeno crea una sfida critica per il mantenimento della connettività e della funzione MN. Di conseguenza, le MN dipendono da un corretto trasporto di informazioni, organelli e materiali lungo gli assoni dal loro corpo cellulare alla sinapsi e alla schiena. Vari componenti cellulari, come proteine, RNA e organelli, vengono trasportati regolarmente attraverso gli assoni. I mitocondri sono organelli importanti che vengono regolarmente trasportati in MN. I mitocondri sono essenziali per la corretta attività e funzione delle MN, responsabili della fornitura ATP, del buffering del calcio e dei processi di segnalazione1,2. Il trasporto assonale dei mitocondri è un processo ben studiato3,4. È interessante notare che, difetti nel trasporto mitocondriale sono stati segnalati per essere coinvolti in diverse malattie neurodegenerative e in particolare nelle malattie MN5. I compartimenti acidi servono come un altro esempio per gli organelli intrinseci che si muovono lungo gli assoni MN. I compartimenti acidi includono lisosomi, endosomi, apparati trans-Golgi e alcune vescicle secretory6. I difetti nel trasporto assonale di compartimenti acidi sono stati riscontrati in diverse malattie neurodegenerative e7, e recenti documenti sottolineano la loro importanza nelle malattie MN8.
Per studiare in modo efficiente il trasporto assonale, le camere microfluidiche che separano i compartimenti somatici ed assonali sono spesso utilizzate9,10. I due vantaggi significativi del sistema microfluidico, e la compartimentazione e l'isolamento degli assoni, lo rendono ideale per lo studio dei processi subcellulari11. La separazione spaziale tra i corpi cellulari neuronali e gli assoni può essere utilizzata per manipolare gli ambienti extracellulari di diversi compartimenti neuronali (ad esempio, assoni contro soma). Biochimica, crescita/degenerazione neuronale e immunofluorescenza attraggono tutti i benefici di questa piattaforma. Le MFC possono anche aiutare a studiare la comunicazione tra cellule coculcolando neuroni con altri tipi di cellule, come i muscoli scheletrici12,13,14.
Qui, descriviamo un protocollo semplice ma preciso per il monitoraggio dei mitocondri e del trasporto dei compartimenti acidi nei motoneuroni. Mostriamo inoltre l'uso di questo metodo confrontando la percentuale relativa di organelli mobili retrogradi e anterogradili, nonché la distribuzione della velocità di trasporto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon DU-897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARA-C (Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td>stock of 2mM in filtered DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.25mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504530</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 6mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504533</td>
			<td>For preperation of small MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 7mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504534</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane Imaris software - version 8.4.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A3311-100G</td>
			<td>5% w/v in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimetylsilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#386529-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>C-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Medium - Optiprep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>stock 10mg/mL in neurobasal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14200-067</td>
			<td>dilute 1:10 in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont fine forceps #55 0.05 &#215; 0.02 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>1125520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Hardener</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>IPE 743</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Resin</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>RP 026UV</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>G-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9:GFP mice strain</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14185-045</td>
			<td>Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, curved, 10 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 9 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-440-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep-Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8638</td>
			<td>Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>DOW Corning Corporation</td>
			<td>#3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>stock 25 mg/mL in 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU X-1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system

I motoneuroni (MN) sono cellule altamente polarizzate con assoni molto lunghi. Il trasporto assonale è un meccanismo cruciale per la salute di MN, contribuendo alla crescita neuronale, allo sviluppo e alla sopravvivenza. Descriviamo un metodo dettagliato per l'uso di camere microfluidiche (MFC) per il monitoraggio del trasporto assonale di organelli etichettati fluorescenti negli assoni MN. Questo metodo è rapido, relativamente poco costoso, e consente il monitoraggio di segnali intracellulari nello spazio e nel tempo. Descriviamo un protocollo passo dopo passo per: 1) Fabbricazione di MFC polidimetilsiloxane (PDMS); 2) placcatura degli esanti del midollo spinale ventrale e coltura dissociata MN nelle MFC; 3) Etichettatura dei mitocondri e dei compartimenti acidi seguita dall'immaginazione confocale viva; 4) Analisi manuale e semiautomatica del trasporto assonale. Infine, dimostriamo una differenza nel trasporto di mitocondri e compartimenti acidi di HB9::GFP del midollo spinale ventrale degli assoni explant come prova della validità del sistema. Complessivamente, questo protocollo fornisce uno strumento efficiente per studiare il trasporto assonale di vari componenti assonali, nonché un manuale semplificato per l'utilizzo di MFC per aiutare a scoprire le possibilità spaziali sperimentali.

Seguendo il protocollo descritto, gli espiantati embrionali HB9::GFP del midollo spinale sono stati coltivati in MFC (Figura 4A). Gli espiantati sono stati coltivati per 7 giorni, quando gli assoni sono stati completamente attraversati nel vano distale. Mitotracker Deep Red e Lysotracker Coloranti rossi sono stati aggiunti ai compartimenti distale e prossimali al fine di etichettare i mitocondri e scomparti acidi (Figura ...

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Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Il trasporto assonale è un meccanismo cruciale per la salute dei motoneuroni. In questo protocollo forniamo un metodo dettagliato per tracciare il trasporto assonale di compartimenti acidi e mitocondri negli assoni dei motoneuroni utilizzando camere microfluidiche.

Trasporto assonale di Organanelle nelle colture del motoneurone utilizzando il sistema di camere microfluidiche

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Il trasporto assonale è vitale per la salute e la vitalità neuronale. Il nostro protocollo descrive un metodo elegante per il monitoraggio e l'analisi del trasporto assonale. E può essere adattato per vari modelli di malattie neuronali.L'uso di camere microfluidiche consente un preciso controllo temporale spaziale, che è fondamentale per lo studio della biologia assonale. Le anomalie del trasporto assonale sono implicate con diverse malattie neurodegenerative come la SLA. La piattaforma microfluidica consente lo studio dei meccanismi di base e la sperimentazione di terapie per riparare i difetti di trasporto assonale.La piattaforma a camera microfluidica può essere facilmente adattata per adattarsi a diversi aspetti della ricerca assonale, tra cui la crescita assonale e la degenerazione di vari sottotipi neurali. Questo metodo è complesso e di solito insegnato pratica. La dimostrazione visiva aumenterà l'accessibilità di questa procedura a qualsiasi scienziato interessato a studiare il trasporto assonale.Inizia lanciando PDMS in stampi primari. Utilizzare aria pressurizzata per rimuovere lo sporco dalla piattaforma del wafer, assicurandosi che i wafer appaiano lisci e chiari prima di procedere. Quindi, riempire un contenitore con azoto liquido e preparare una siringa da 10 millilitri con un ago calibro 23.In una cappa chimica, posizionare il wafer contenente la piastra in un contenitore sigillabile e riempire la siringa con due millilitri di azoto liquido per ogni wafer contenente lastra. Aprire una bottiglia di clorotrimetilsilano. Perforare il cappuccio di gomma con la siringa e iniettare l'azoto nella bottiglia.Senza estrarre l'ago, capovolgere la bottiglia e svantaggiare due millilitri di clorotrimetilsilano per ogni wafer contenente piastra. Stendere il clorotrimetilsilano nel contenitore, ma non direttamente sul wafer contenente lastra. Chiudere il contenitore.E incubarlo per cinque minuti per wafer. Quindi pesare 47,05 grammi di base PDMS in un tubo da 50 millilitri e aggiungere agente polimerizzante PDMS con un rapporto di 16 a 1 base per polimerizzante per un totale di 50 grammi. Mescolare il PDMS per 10 minuti su un rotatore a bassa velocità, quindi versarlo in ogni wafer contenente la piastra all'altezza desiderata.Posizionare le piastre all'interno di un essiccatore a vuoto per due ore. Che rimuoverà l'aria intrappolata all'interno del PDMS e formerà uno stampo uniforme chiaro. Successivamente incubare le piastre in un forno per tre ore o durante la notte a 70 Celsius.Per creare la camera microfluidica o MFC. Tagliare e rimuovere gli stampi PDMS dalla piastra con un bisturi, assicurandosi di non forzare gli stampi perché sono fragili. Seguire le istruzioni nel manoscritto di testo per punzonare e tagliare le camere, a seconda della configurazione sperimentale.Per la coltura di espianto del midollo spinale, perforare due pozzi di sette millimetri nel lato distale di un MFC di grandi dimensioni, assicurandosi che si sovrappongano ai bordi del canale. Sul lato prossimale, punzonare un pozzo di sette millimetri al centro del canale con sovrapposizione minima, in modo che sia lasciato spazio sufficiente per le espianto. Perforare altri due fori di un millimetro nei due bordi del canale prossimale.E tagliare il PDMS in camere singole. Quindi ruotare il MFC rivolto verso l'alto e utilizzare un ago calibro 20 per intagliare tre piccole grotte di espianto sul pozzo perforato di sette millimetri. Per la cultura dissociata dei motoneuroni, punzonare quattro pozzi di sei millimetri, ai bordi dei due canali di un piccolo MFC e tagliare il PDMS in singole camere.Per sterilizzare la MFC, stendere sul banco nastri appiccicosi lunghi 50 centimetri. Quindi premere entrambe le facce della camera sul nastro e tirarlo indietro. Posizionare le camere pulite in una nuova piastra e incubarle in grado analitico, del 70% di etanolo per 10 minuti su uno shaker orbitale.Smaltire l'etanolo e asciugare le camere in una cappa di coltura tissutale o in un forno a 70 gradi Celsius. Quindi posizionare la camera al centro di un fossato inferiore in vetro di grado coltura tissutale e applicare una forza minore sui bordi per legare il PDMS al fondo del piatto. Incubare il piatto per 10 minuti a 70 gradi Celsius.Quindi premere sulle camere per rafforzare l'aderenza. Incubare il piatto sotto UV per 10 minuti, quindi procedere alla codifica del MFC. Aggiungere 1,5 nanogrammi per millilitro PLO a entrambi i compartimenti.Assicurarsi che l'OLP sia in esecuzione attraverso i canali. Pipettando il supporto di rivestimento direttamente all'ingresso del canale. Esaminare MFC al microscopio a luce per verificare la presenza di bolle.Se le bolle d'aria bloccano le micro scanalature, posizionare MFC in un essiccatore di vuoto per due minuti. Rimuovere l'aria in eccesso dai canali MFC. Quindi incubarlo durante la notte con l'OLP.Sostituire l'OLP con laminina e incubare MFC per una notte aggiuntiva. Prima della placcatura, lavare la laminina con mezzo di coltura. Sezionare un topo incinta ICR E12.5 e separare gli embrioni dal sacco amniotico.Mettere l'embrione in piatto di silicio HBSS. Rimuovere la testa e la coda e capovolgerla sulla pancia. Staccare delicatamente la pelle superficiale dagli embrioni indietro, esponendo il midollo spinale.Separare il midollo spinale dal corpo dalla testa alla coda, usando una pinzetta delicata. Rimuovere le meningi, quindi rimuovere le corna dorsali e tagliare il midollo spinale in sezioni trasversali spesse un millimetro. Eliminare tutto il supporto dal compartimento prossimale della MFC.Raccogliere un singolo midollo spinale explant con una pipetta, in un volume totale di quattro microlitri. E iniettarlo il più vicino possibile alla grotta. Estraggono il liquido in eccesso dal pozzo prossimale attraverso le prese lateralmente.Ripetere il passaggio precedente altre due volte e assicurarsi che le espianto siano incorporate nel canale prossimale. Aggiungere lentamente 150 microlitri di mezzo SCEX, al pozzo prossimale. Un giorno dopo la placcatura.Sostituito il supporto SCEX nel vano prossimale e aggiungere un ricco mezzo SCEX al vano distale. Mantenimento di un gradiente di volume di almeno 15 microlitri per pozzo tra i pozzi distale e prossimale. Dopo quattro o sei giorni, gli assoni devono attraversare il compartimento distale ed essere pronti per l'imaging del trasporto assonale.Per etichettare i mitocondri e i compartimenti acidi, preparare un mezzo SCEX fresco con 100 nanomolare MitoTracker Deep Red FM e 100 nanomolari LysoTracker Red. E aggiungerlo alle camere microfluidiche. Incubarli per 30-60 minuti a 37 gradi Celsius.Quindi lavare tre volte con mezzo SCEX caldo. Procedere con l'imaging dal vivo del trasporto assonale. Acquisizione di una serie di immagini time lapse a 100 secondi a intervalli di tre secondi.Con un totale di cinque minuti per film. Dopo sette giorni in camere microfluidiche. Espianto del midollo spinale HB9 GFP embrionale del topo.Siamo macchiati di coloranti MitoTracker Deep Red e LysoTracker Red. Etichettare i mitocondri e i compartimenti acidi. Gli assoni nelle scanalature distali sono stati immagini e l'analisi kymograph è stata utilizzata per determinare la distribuzione generale del movimento.Ciò ha rivelato un pregiudizio nella direzione retrograda solo nei compartimenti acidi della città, ma non nel trasporto mitocondriale. Anche la densità delle particelle è stata quantificata, rivelando un numero maggiore di particelle mitocondriali rispetto ai compartimenti acidi negli assoni di espianto del midollo spinale HB9 GFP. Successivamente, l'analisi del trasporto di singole particelle è stata condotta utilizzando software semi-automatizzato seguito da codice interno.Questa analisi ha rivelato che i componenti acidi e i mitocondri hanno velocità delle particelle simili. Ma solo i compartimenti acidi mostrano una distorsione verso il movimento retrogrado. Isolare il midollo spinale embrionale può essere difficile all'inizio.Pratica questa procedura più volte, assicurandoti di utilizzare l'età embrionale corretta e gli strumenti di dissezione appropriati. L'uso delle camere microfluidiche cambia il modo in cui studiamo la biologia assonale. Ci permette di visualizzare processi assonali localizzati, che una volta si ipotizza avvengano solo nel corpo cellulare.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Ricerca

Neuroscienze

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