Name: axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00
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この研究は、イスラエル科学財団(ISF、561/11)と欧州研究評議会(ERC、309377)からの助成金によって支えられました。

このプロトコルでの動物のケアと治療は、テルアビブ大学動物倫理委員会の監督と承認の下で行われました.
1. MFCの準備
<ol><li>一次金型での PDMS 鋳造 (図 1)<ol>
<li>詳細なプロトコル9に従って、一次金型(ウェーハ)を購入または作成します。</li>
		<li>加圧空気を使用して、コーティングステップに進む前にウェハプラットフォームか...

<ol>
	<li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitostasis+in+Neurons:+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture.">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li><li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease.">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li><li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons.">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).</li><li>Magran&#233;, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li><li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+acidic+intracellular+compartments.">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li><li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration.">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li><li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport,+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether.">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li><li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers.">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li><li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS.">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance.">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ.">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li><li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model.">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 210 (2019).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS.">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li></ol>

本プロトコルでは、運動ニューロンにおけるミトコンドリアおよび酸性コンパートメントの軸索輸送を追跡するシステムについて述べている。この簡素化されたin vitroプラットフォームにより、細胞下の神経区画の精密な制御、監視、操作が可能になり、運動ニューロン局所機能の実験的解析が可能になります。このプロトコルは、ALSなどのMN疾患を研究するのに有用であり、疾患<sup class="xre...

MNsは長い軸索を持つ非常に偏光細胞であり、成人の人間では最大1メートルに達する。この現象は、MN 接続性と機能の維持に重要な課題を生み出します。その結果、MNsは、細胞体からシナプスおよび背中への軸索に沿った情報、オルガネラ、および材料の適切な輸送に依存しています。タンパク質、RNA、オルガネラなどの様々な細胞成分は、軸索を介して定期的にシャトルされます。ミトコンドリアは、日常的にMNsで輸送される重要なオルガネラである. ミトコンドリアは、ATPの提供、カルシウムバッファリング、およびシグナリングプロセス11、22を担当するMNsの適切な活動および機能に不可欠である。ミトコンドリアの軸索輸送は、よく研究されたプロセス33、44です。興味深いことに、ミトコンドリア輸送における欠陥は、いくつかの神経変性疾患、特にMN疾患5に関与することが報告された。酸性コンパートメントは、MN軸索に沿って移動する固有のオルガネラの別の例として機能します。酸性コンパートメントは、リソソーム、エンドーソーム、トランスゴルジ装置、および特定の分泌小胞6を含む。酸性コンパートメントの軸索輸送の欠陥は、いくつかの神経変性疾患にも7で発見され、最近の論文はMN疾患におけるその重要性を強調した8。
効率的に軸索輸送を研究するために、体性および軸索コンパートメントを分離するマイクロ流体室は、多くの場合、9、10を10使用しています。マイクロ流体システムの2つの大きな利点と、区分化と軸索の単離は、細胞内プロセス11の研究に理想的である。神経細胞体と軸索の間の空間的分離は、異なる神経区画(例えば、軸索対ソーマ)の細胞外環境を操作するために使用することができる。生化学的、神経細胞の成長/変性、免疫蛍光アッセイはすべてこのプラットフォームから恩恵を受けます。MFCはまた、骨格筋12、13、14,13,14などの他の細胞タイプとニューロンを協調させることによって、細胞間コミュニケーションの研究を支援することができる。
ここでは、運動ニューロンにおけるミトコンドリアおよび酸性コンパートメント輸送を監視するための、シンプルでありながら正確なプロトコルについて述べています。さらに、逆行性および前向き移動小器官の相対的な割合と輸送速度の分布を比較することによって、この方法の使用を示す。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon DU-897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARA-C (Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td>stock of 2mM in filtered DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.25mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504530</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 6mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504533</td>
			<td>For preperation of small MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 7mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504534</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane Imaris software - version 8.4.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A3311-100G</td>
			<td>5% w/v in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimetylsilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#386529-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>C-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Medium - Optiprep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>stock 10mg/mL in neurobasal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14200-067</td>
			<td>dilute 1:10 in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont fine forceps #55 0.05 &#215; 0.02 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>1125520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Hardener</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>IPE 743</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Resin</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>RP 026UV</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>G-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9:GFP mice strain</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14185-045</td>
			<td>Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, curved, 10 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 9 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-440-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep-Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8638</td>
			<td>Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>DOW Corning Corporation</td>
			<td>#3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>stock 25 mg/mL in 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU X-1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system

運動ニューロン(MNs)は非常に長い軸索を持つ極偏光細胞です。軸索輸送はMNの健康にとって重要なメカニズムであり、神経の成長、発達、生存に寄与する。MN軸索における蛍光標識されたオルガネラの軸索輸送を追跡するためのマイクロ流体室(MFC)の使用法について詳細に説明する。この方法は、迅速で、比較的安価であり、空間および時間における細胞内の手がかりの監視を可能にする。我々は、ステッププロトコルをステップごとに記述する:1)ポリジメチルシロキサン(PDMS)の製造;2) MFCにおける腹側脊髄外植体およびMN解心培養のめっき;3)ミトコンドリアと酸性コンパートメントの標識後に生きた共焦点想像;4)手動および半自動軸索輸送分析。最後に、HB9:::GFP腹側脊髄外型軸索の輸送におけるHB9::GFP腹側脊髄の輸送の違いをシステムの有効性の証拠として示す。全体として、このプロトコルは、様々な軸索成分の軸索輸送を研究するための効率的なツールと、空間的実験的可能性を発見するのに役立つMFCの使用のための簡略化されたマニュアルを提供します。

記載されたプロトコルに従って、マウス胚性HB9::GFP脊髄外植体をMFCで培養した(図4A)。エクスプラントは、軸索が完全に遠位コンパートメントに交差したときに、7日間成長しました。ミトトラッカーディープレッドとライソトラッカーレッド染料は、ミトコンドリアと酸性コンパートメントにラベルを付けるために遠位および近位コ?...

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Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

軸索輸送は運動ニューロンの健康にとって重要なメカニズムです。このプロトコルでは、マイクロ流体室を用いた運動ニューロン軸索における酸性コンパートメントおよびミトコンドリアの軸索輸送を追跡するための詳細な方法を提供する。

マイクロ流体室システムを用いた運動ニューロン培養におけるオルガネラの軸索輸送

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

軸索輸送は、神経の健康と生存率に不可欠です。当社のプロトコルは、軸索輸送を監視および分析するためのエレガントな方法を記述しています。そして、様々な神経疾患モデルに適応することができる。マイクロ流体室の使用は、軸索生物学を研究するために重要である正確な空間時間制御を可能にする。軸索輸送異常は、ALSなどのいくつかの神経変性疾患に関係している。マイクロ流体プラットフォームは、基本的なメカニズムの研究と、軸索輸送欠陥を修復するための試験療法を可能にします。マイクロ流体室プラットフォームは、軸索成長および様々な神経サブタイプの変性を含む軸索研究のさまざまな側面に合わせて容易に適合させることができる。この方法は複雑で、通常は実践的に教えられています。視覚的なデモンストレーションは、軸索輸送の研究に興味のある科学者にこの手順のアクセシビリティを高める。まず、PDMS を一次金型にキャストします。加圧空気を使用してウェハプラットフォームから汚れを取り除き、ウエハーが滑らかで明確に見えるようにしてから続行します。次に、液体窒素で容器を満たし、23ゲージ針で10ミリリットルの注射器を調製します。化学フュームフード内に、封止容器に封入可能な容器にウェハ含有プレートを入れ、プレートを含む各ウエハにつき2ミリリットルの液体窒素をシリンジに充填する。クロロトリメチルシランボトルを開けます。ゴムキャップに注射器を突き刺し、ボトルに窒素を注入します。針を引き出さずに、ボトルを逆さまにし、プレートを含むウエハーごとにクロロトリメチルシランを2ミリリットル引き下げる。クロロトリメチルシランを容器に広げるが、ウエハ含有プレート上に直接入っていない。コンテナーを閉じます。そして、ウエハースあたり5分間インキュベートします。次に、50ミリリットルチューブ内のPDMSベースの47.05グラムを秤量し、合計50グラムの硬化剤に対して16〜1塩基の割合でPDMS硬化剤を添加する。低速ローテーターでPDMSを10分間混ぜ、その後、プレートを含む各ウェハに所望の高さに注ぎます。真空デシケータの中にプレートを2時間置きます。これはPDMS内に閉じ込められた空気を除去し、明確な均一な型を形成する。その後、オーブンでプレートを3時間または70°Cで一晩インキュベートします。マイクロ流体室またはMFCを作成します。PDMS金型をメスでプレートから切り取り、取り外し、壊れやすいので金型を強制しないようにします。実験的なセットアップに応じて、部屋をパンチし、カットするテキスト原稿の指示に従ってください。脊髄外植培養の場合は、大きなMFCの遠位側に7ミリメートルの井戸を2つパンチし、チャネルの端と重なるようにします。近位側では、チャネルの中央に7ミリメートルを十分にパンチして、最小限の重なりを付け、外植に十分なスペースが残されるようにします。近位チャネルの 2 つのエッジに 2 つの追加の 1 ミリメートルの穴をパンチします。そして、単一のチャンバーにPDMSをカットします。その後、MFCを上向きに回し、20ゲージの針を使用して、パンチされた7ミリメートルの井戸に3つの小さな外植洞窟を彫ります。解約された運動ニューロン培養の場合、小さなMFCの2つのチャネルの端に4つの6ミリメートルの井戸をパンチし、PDMSを単一のチャンバーに切断します。MFCを殺菌するには、長さ50センチメートルの粘着テープバンドをベンチに広げます。その後、テープ上のチャンバーの両方の面を押し、それを引き戻します。クリーンチャンバーを新しいプレートに入れ、軌道シェーカーで10分間70%エタノールの分析グレードでインキュベートします。エタノールを処分し、チャンバーを組織培養フードまたはオーブンで摂氏70度で乾燥させます。次に、チャンバーを組織培養グレードのガラス底溝の中央に置き、エッジに軽微な力を加えてPDMSを皿底に結合させます。70°Cで10分間インキュベートします。その後、密着を強化するためにチャンバーを押します。皿をUVで10分間インキュベートし、MFCのコーディングに進みます。両方のコンパートメントに1ミリリットルのPLOあたり1.5ナノグラムを加えます。PLOがチャネルを通して実行されていることを確認します。チャネル入口に直接コーティング媒体をピペット化することによって。MFCを光顕微鏡で調べて、気泡がないか確認します。気泡がマイクロ溝をふさいでいる場合は、2分間真空デシケータにMFCを入れます。MFC チャンネルから余分な空気を取り除きます。その後、PLOと一晩インキュベートします。PLOをラミニンに置き換え、追加の夜のためにMFCをインキュベートします。めっきする前に、ラミニンを培養液で洗ってください。ICR E12.5妊娠マウスを解剖し、羊膜嚢から胚を分離する。胚をHBSSシリコン皿に入れます。頭と尾を取り除き、彼の腹の上にひっくり返します。胚の表面性皮膚を後ろから静かに剥がし、脊髄を露出させる。穏やかなピンセットを使用して、頭から尾に体から脊髄を分離します。髄膜を取り除き、後角を取り除き、脊髄を1ミリメートルの厚さの横切り部に切ります。MFC の近位コンパートメントからすべてのメディアを廃棄します。ピペットを用いた単一の脊髄外植を、合計4マイクロリットルで拾う。そして、洞窟にできるだけ近いそれを注入します。横出口を介して近位ウェルから余分な液体を引き出す。前の手順をさらに 2 回繰り返し、外植が近位チャネルに埋め込まれていることを確認します。近位ウェルにゆっくりと150マイクロリットルのSCEX培地を加えます。めっきの翌日。近位コンパートメントにSCEX培地を交換し、遠位コンパートメントに豊富なSCEX培地を追加します。遠位と近位の井戸の間のウェルあたり少なくとも15マイクロリットルの体積勾配を維持する。4〜6日後、軸索は遠位コンパートメントに渡り、軸索輸送イメージングの準備ができている必要があります。ミトコンドリアと酸性コンパートメントにラベルを付けるには、100ナノモルミトトラッカーディープレッドFM、および100ナノモルライソトラッカーレッドで新鮮なSCEX培地を準備します。そしてマイクロ流体室にそれを加える。37°Cで30〜60分間インキュベートします。その後、暖かいSCEX培地で3回洗います。軸索輸送のライブイメージングを進めます。3秒間隔で100時間経過画像シリーズを取得する。映画ごとに合計5分。マイクロ流体室で7日後。マウス胚性HB9 GFP脊髄外植。私たちは、ミトトラッカーディープレッドとライソトラッカーレッド染料で染色されています。ミトコンドリアと酸性コンパートメントにラベルを付ける。遠位溝の軸索を画像化し、一般的な動き分布を決定するためにキモグラフ解析を用いた。これは、酸性都市区画でのみ逆行方向のバイアスを明らかにしたが、ミトコンドリア輸送では明らかではなかった。粒子密度も定量化され、HB9 GFP脊髄外植軸索の酸性コンパートメントと比較してミトコンドリア粒子の数が多いことが明らかになった。次に、半自動ソフトウェアを用いて、社内コードを用いて単一粒子輸送解析を行った。この分析により、酸性成分とミトコンドリアは粒子速度が似ていることが明らかになった。しかし、酸性コンパートメントだけが逆行運動に偏りを示します。最初は胚性脊髄を単離することは難しい場合があります。正しい胚年齢と適切な解剖ツールを使用するように、この手順を数回練習してください。マイクロ流体室の使用は、軸索生物学の研究方法を変えます。これは、私たちがかつて細胞の体でのみ起こると仮定されている局所的な軸索プロセスを視覚化することができます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

モーターニューロンとターゲットゼブラフィッシュの骨格筋からの対のパッチクランプ記録

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

出生後のマウス組織から培養オリゴデンドロサイトと共培養Myelinatingニューロン/オリゴデンドロサイトエンリッチドの導出

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

運動ニューロン様NSC-34細胞内のリアルタイムでの核細胞質輸送を測定するアッセイ

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

研究のための単純な神経細胞学的損傷法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;運動ニューロン変性

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

生体内で運動ニューロンの変性症のマウスモデルの前肢からの複合筋活動電位の電気生理学的測定

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...