Name: axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Israel Science foundation (ISF, 561/11) og Det europeiske forskningsrådet (ERC, 309377).

Omsorg og behandling av dyr i denne protokollen ble utført under tilsyn og godkjenning av Tel Aviv University Committee for Animal Ethics.
1. MFC forberedelse
<ol><li>PDMS støping i primære former (Figur 1)<ol>
<li>Kjøp eller opprett primære former (wafers) etter en detaljert protokoll9.</li>
		<li>Bruk trykkluft for å fjerne alle typer smuss fra wafer-plattformen før du går videre til beleggtrinnet. Overflaten av wafers bør se g...

<ol>
	<li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitostasis+in+Neurons:+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture.">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li><li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease.">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li><li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons.">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).</li><li>Magran&#233;, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li><li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+acidic+intracellular+compartments.">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li><li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration.">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li><li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport,+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether.">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li><li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers.">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li><li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS.">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance.">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ.">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li><li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model.">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 210 (2019).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS.">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li></ol>

I denne protokollen beskriver vi et system for å spore aksonal transport av mitokondrier og sure rom i motoriske nevroner. Denne forenklede in vitro-plattformen tillater nøyaktig kontroll, overvåking og manipulering av subcellulære nevronale rom, noe som muliggjør eksperimentell analyse av motorneuron lokale funksjoner. Denne protokollen kan være nyttig for å studere MN sykdommer som ALS, for å fokusere på å forstå den underliggende mekanismen for aksonal transport dysfunksjon i sykdommen10</...

MN er svært polariserte celler med lange aksoner, og når opptil en meter lang hos voksne mennesker. Dette fenomenet skaper en kritisk utfordring for vedlikehold av MN-tilkobling og funksjon. Følgelig er MN-er avhengige av riktig transport av informasjon, organeller og materialer langs aksonene fra cellekroppen til synapse og tilbake. Ulike cellulære komponenter, som proteiner, RNA og organeller blir transportert regelmessig gjennom aksonene. Mitokondrier er viktige organeller som rutinemessig transporteres i MN. Mitokondrier er avgjørende for riktig aktivitet og funksjon av MN, ansvarlig for ATP-bestemmelse, kalsiumbufring og signalprosesser1,2. Aksonaltransport en mitokondrier er en godt studert prosess3,4. Interessant, feil i mitokondrietransport ble rapportert å være involvert i flere nevrodegenerative sykdommer og spesielt i MN sykdommer5. Sure rom tjener som et annet eksempel for iboende organeller som beveger seg langs MN-aksoner. Sure rom inkluderer lysosomer, endosomer, trans-Golgi apparat, og visse sekretoriske vesikler6. Defekter i aksonal transport av sure rom ble funnet i flere nevrodegenerative sykdommer samt7, og nyere papirer fremhever deres betydning i MN sykdommer8.
For å effektivt studere aksonal transport, mikrofluidiske kamre som skiller somatiske og aksonale rom er ofte brukt9,,10. De to betydelige fordelene med det mikrofluidiske systemet, og compartmentalization og isolering av aksoner, gjør det ideelt for studiet av subcellulære prosesser11. Den romlige separasjonen mellom nevronale cellelegemer og aksoner kan brukes til å manipulere de ekstracellulære miljøene i forskjellige nevronale rom (f.eks. aksoner vs. soma). Biokjemisk, nevronal vekst/degenerasjon, og immunofluorescens analyser er alle fordeler fra denne plattformen. MfCer kan også hjelpe til med å studere celle-til-celle-kommunikasjon ved å coculturing nevroner med andre celletyper, for eksempel skjelettmuskler12,,13,14.
Her beskriver vi en enkel, men presis protokoll for overvåking av mitokondrier og sur romtransport i motornevroner. Vi viser videre bruken av denne metoden ved å sammenligne den relative prosentandelen av retrograd og anterograde bevegelige organeller, samt fordelingen av transporthastighet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon DU-897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARA-C (Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td>stock of 2mM in filtered DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.25mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504530</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 6mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504533</td>
			<td>For preperation of small MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 7mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504534</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane Imaris software - version 8.4.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A3311-100G</td>
			<td>5% w/v in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimetylsilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#386529-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>C-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Medium - Optiprep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>stock 10mg/mL in neurobasal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14200-067</td>
			<td>dilute 1:10 in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont fine forceps #55 0.05 &#215; 0.02 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>1125520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Hardener</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>IPE 743</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Resin</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>RP 026UV</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>G-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9:GFP mice strain</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14185-045</td>
			<td>Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, curved, 10 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 9 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-440-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep-Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8638</td>
			<td>Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>DOW Corning Corporation</td>
			<td>#3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>stock 25 mg/mL in 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU X-1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system

Motorneuroner (MN) er svært polariserte celler med svært lange aksoner. Axonal transport er en avgjørende mekanisme for MN helse, bidrar til nevronal vekst, utvikling, og overlevelse. Vi beskriver en detaljert metode for bruk av mikrofluidiske kamre (MfCer) for sporing av aksonal transport av fluorescerende merkede organeller i MN-aksoner. Denne metoden er rask, relativt billig, og gjør det mulig å overvåke intracellulære signaler i rom og tid. Vi beskriver en trinnvis protokoll for: 1) Fabrikasjon av polydimethylsiloxane (PDMS) MfCer; 2) Plating av ventral ryggmarg eksplanter og MN dissosiert kultur i MfCer; 3) Merking av mitokondrier og sure rom etterfulgt av live confocal imagining; 4) Manuell og halvautomatisk aksonal transportanalyse. Til slutt viser vi en forskjell i transport av mitokondrier og sure rom av HB9::GFP ventral ryggmargutplante aksoner som et bevis på systemets gyldighet. Til sammen gir denne protokollen et effektivt verktøy for å studere aksonaltransport av ulike aksonale komponenter, samt en forenklet håndbok for MFC-bruk for å bidra til å oppdage romlige eksperimentelle muligheter.

Etter den beskrevne protokollen ble musembryonale HB9::GFP ryggmargsutplanter dyrket i MFC (Figur 4A). Explants ble dyrket i 7 dager, da aksoner fullt krysset inn i det distale rommet. Mitotracker Deep Red og Lysotracker Red fargestoffer ble lagt til distale og proksimale rom for å merke mitokondrier og sure rom (Figur 4C). Axons i distale spor ble avbildet, og filmene ble analysert som følger:...

Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Axonal transport er en avgjørende mekanisme for motor neuron helse. I denne protokollen gir vi en detaljert metode for sporing av aksonaltransport av sure rom og mitokondrier i motorneuronaksoner ved hjelp av mikrofluidiske kamre.

Axonal Transport av organeller i motorneuronkulturer ved hjelp av mikrofluidiske kamre system

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Aksonal transport er avgjørende for nevronal helse og levedyktighet. Vår protokoll beskriver en elegant metode for overvåking og analyse av aksonal transport. Og kan tilpasses ulike nevronale sykdomsmodeller.Bruken av mikrofluidiske kamre muliggjør presis romlig temporal kontroll, noe som er avgjørende for å studere aksonærbiologi. Axonal transport abnormiteter er innblandet med flere nevrodegenerative sykdommer som ALS. Den mikrofluidiske plattformen gjør det mulig å studere grunnleggende mekanismer samt testterapi for å reparere aksonale transportfeil.Den mikrofluidiske kammerplattformen kan enkelt tilpasses ulike aspekter ved aksonal forskning, inkludert aksonal vekst og degenerasjon av ulike nevrale undertyper. Denne metoden er kompleks og vanligvis undervist hands-on. Den visuelle demonstrasjonen vil øke tilgjengeligheten av denne prosedyren til enhver forsker som er interessert i å studere aksonal transport.Begynn med å kaste PDMS i primærformer. Bruk trykkluft til å fjerne smuss fra wafer-plattformen, og pass på at wafers ser glatt og klar ut før du fortsetter. Fyll deretter en beholder med flytende nitrogen og lag en 10 ml sprøyte med en 23 gauge nål.I en kjemisk røykhette plasserer du waferen som inneholder platen i en forseglet beholder, og fyller sprøyten med to milliliter flytende nitrogen per hver wafer som inneholder plate. Åpne en klorotrimetylilanflaske. Pierce gummihetten med sprøyten og injiser nitrogenet i flasken.Uten å trekke ut nålen, Snu flasken opp ned og trekk tilbake to milliliter klorotrimetylilan for hver wafer som inneholder plate. Spre klorotrimetylilan i beholderen, men ikke direkte på wafer inneholdende plate. Lukk beholderen.Og inkuber den i fem minutter per wafer. Deretter veier 47,05 gram PDMS-base i et 50 milliliter rør, og tilsett PDMS herdingsmiddel i forholdet 16 til 1 base til herdingsmiddel for totalt 50 gram. Bland PDMS i 10 minutter på en lav hastighet rotator, og hell den deretter i hver wafer som inneholder plate til ønsket høyde.Plasser platene inne i en vakuumdesiccator i to timer. Som vil fjerne luft fanget i PDMS, og danner en klar uniform mold. Etterpå inkuber platene i en ovn i tre timer eller over natten på 70 Celsius.For å lage mikrofluidisk kammer eller MFC. Klipp og fjern PDMS-formene fra platen med en skalpell, og pass på at du ikke tvinger formene fordi de er skjøre. Følg instruksjonene i tekstmanuskriptet for å slå og kutte kamrene, avhengig av det eksperimentelle oppsettet.For ryggmargspvelkantkultur, slå to syv millimeter brønner i den distale siden av en stor MFC, og sørg for at de vil overlappe med kanalkantene. På den proksimale siden, slå en syv millimeter godt i midten av kanalen med minimal overlapping, slik at tilstrekkelig plass er igjen for explants. Punch to ekstra en millimeter hull i de to kantene av den proksimale kanalen.Og kutt PDMS i enkeltkamre. Snu deretter MFC vendt oppover, og bruk en 20 gauge nål til å skjære på tre små explant grotter på den stansede syv millimeter godt. For dissosiert motor neuron kultur, punch fire seks millimeter brønner, i kantene av de to kanalene i en liten MFC og kutte PDMS i enkeltkamre.For å sterilisere MFC, spre 50 centimeter lange klebrig tapebånd på benken. Trykk deretter begge ansiktene på kammeret på båndet og trekk den tilbake. Legg de rene kamrene i en ny tallerken og inkuber dem i analytisk karakter, på 70% etanol i 10 minutter på en orbital shaker.Kast etanol og tørk kamrene i en vevskulturhette eller i en ovn ved 70 grader Celsius. Plasser deretter kammeret i midten av en vevskultur klasse glass bunn grøft, og bruke mindre kraft på kantene for å binde PDMS til parabolen bunnen. Inkuber parabolen i 10 minutter ved 70 grader Celsius.Trykk deretter på kamrene for å styrke tilslutning. Inkuber parabolen under UV i 10 minutter, og fortsett deretter med koding av MFC. Tilsett 1,5 nanogram per milliliter PLO i begge rom.Pass på at PLO kjører gjennom kanalene. Ved å pipetting belegget media direkte i kanalinngangen. Undersøk MFC under et lett mikroskop, for å se etter bobler.Hvis luftbobler blokkerer mikrosporene, plasserer du MFC i en vakuumtørker i to minutter. Fjern overflødig luft fra MFC-kanalene. Deretter inkubere det over natten med PLO.Erstatt PLO med laminin og inkuber MFC for en ekstra natt. Før plating, vask laminin med kulturmedium. Dissekere en ICR E12.5 gravid mus, og skille embryoene fra fostervannssekken.Sett embryoet i HBSS Silicon dish. Fjern hodet og halen og snu det på magen. Skrell forsiktig av overfladisk hud fra embryoene tilbake, og eksponer ryggmargen.Skill ryggmargen fra kroppen fra hode til hale, ved hjelp av milde pinsett. Fjern meningene, fjern deretter rygghornene og kutt ryggmargen i en millimeter tykke tverrgående seksjoner. Kast alle medier fra det proksimale rommet på MFC.Plukk opp en enkelt ryggmarg explant med en pipette, i et totalt volum på fire mikroliter. Og injisere den så nært som mulig til hulen. Trekk ut overflødig væske fra den proksimale brønnen via sideuttakene.Gjenta forrige trinn to ganger til, og kontroller at uttrøyene er innebygd i den proksimale kanalen. Tilsett sakte 150 mikroliter SCEX-medium, til proksimal brønn. En dag etter plating.Byttet ut SCEX-mediet i det proksimale rommet og tilsett rikt SCEX-medium til det distale rommet. Opprettholde en volumgradient på minst 15 mikroliter per brønn mellom de distale og proksimale brønnene. Etter fire til seks dager skal aksonene krysses til det distale rommet og være klar for aksonal transportavbildning.For å merke mitokondriene og sure rom, klargjør friskt SCEX medium med 100 nanomolar MitoTracker Deep Red FM, og 100 nanomolar LysoTracker Red. Og legg den til mikrofluidiske kamre. Inkuber dem i 30 til 60 minutter ved 37 grader Celsius.Vask deretter tre ganger med varmt SCEX-medium. Fortsett med levende avbildning av aksonær transport. Anskaffe en 100 tidsforløp bildeserie med tre andre intervaller.Med totalt fem minutter per film. Etter syv dager i mikrofluidiske kamre. Mus embryonal HB9 GFP ryggmargen explants.Vi er farget med MitoTracker Deep Red og LysoTracker Red fargestoffer. For å merke mitokondrier og sure rom. Axons i de distale sporene ble avbildet og Kymograph analyse ble brukt til å bestemme den generelle bevegelsesfordelingen.Dette avslørte en skjevhet i retrograd retning bare i sure byrom, men ikke i mitokondrietransport. Partikkeltettheten ble også kvantifisert, noe som avslørte et høyere antall mitokondriepartikler sammenlignet med sure rom i HB9 GFP ryggmargen explant aksler. Deretter ble enkeltpartikkeltransportanalyse utført ved hjelp av halvautomatisk programvare etterfulgt av internt kode.Denne analysen viste at sure komponenter og mitokondrier har lignende partikkelhastigheter. Men bare sure rom viser en skjevhet mot retrograd bevegelse. Isolere embryonale ryggmargen kan være vanskelig i begynnelsen.Øv denne prosedyren flere ganger, og sørg for å bruke riktig embryonal alder og de riktige disseksjonsverktøyene. Bruken av mikrofluidiske kamre endrer måten vi studerer aksonærbiologi på. Det tillater oss å visualisere lokaliserte aksonale prosesser, som vi en gang er hypotetisk til å forekomme bare i cellekroppen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analyse av Neuron til gliaceller samhandling i Microfluidic Kultur Platform (MCP)-baserte Neuronal Axon og gliaceller Co-kultur System

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Real-time Imaging av aksonal Transport av Quantum Dot-merket BDNF i Primær Neuroner

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Nevromuskulære krysset: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og endringer i Synaptic Protein Tetthet Bruke Confocal Fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Analyse for å måle nukleocytoplasmisk transport i sanntid innen Motor Neuron-lignende NSC-34-celler

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisering av Axonal Projeksjonsmønsteret av Embryoniske Motor Neuroner i<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

En enkel neuronal mekanisk skademetode for å studere<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

I Vivo Elektrofysiologiske måling av sammensatte muskel handling potensial fra Forelimbs i musen modeller av Motor Neuron degenerasjon

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisere og analysere intracellulære transport av organeller og andre cargos i astrocytter

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...