Name: axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Israel science (ISF, 561/11) e do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC, 309377).

O cuidado e tratamento dos animais neste protocolo foram realizados sob a supervisão e aprovação do Comitê de Ética Animal da Universidade de Tel Aviv.
1. Preparação do MFC
<ol><li>Fundição PDMS em moldes primários (Figura 1)<ol>
<li>Comprar ou criar moldes primários (wafers) seguindo um protocolo detalhado9.</li>
		<li>Use ar pressurizado para remover qualquer tipo de sujeira da plataforma de wafer antes de seguir para a etapa...

<ol>
	<li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitostasis+in+Neurons:+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture.">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li><li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease.">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li><li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons.">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).</li><li>Magran&#233;, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li><li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+acidic+intracellular+compartments.">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li><li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration.">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li><li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport,+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether.">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li><li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers.">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li><li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS.">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance.">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ.">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li><li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model.">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 210 (2019).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS.">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li></ol>

Neste protocolo, descrevemos um sistema para rastrear o transporte axonal de mitocôndrias e compartimentos ácidos nos neurônios motores. Esta plataforma in vitro simplificada permite o controle, o monitoramento e a manipulação precisas de compartimentos neuronais subcelulares, permitindo a análise experimental das funções locais dos neurônios motores. Este protocolo pode ser útil para o estudo de doenças de MN, como a ELA, para focar na compreensão do mecanismo subjacente da disfunção do transporte axonal n...

As Esms são células altamente polarizadas com axônios longos, alcançando até um metro de comprimento em humanos adultos. Esse fenômeno cria um desafio crítico para a manutenção da conectividade e função MN. Consequentemente, as MNs dependem do transporte adequado de informações, organelas e materiais ao longo dos axônios do corpo celular para a sinapse e para trás. Vários componentes celulares, como proteínas, RNA e organelas são transportados regularmente através dos axônses. Mitocôndrias são organelas importantes que são rotineiramente transportadas em MNs. Mitocôndrias são essenciais para a atividade e função adequada das Ems, responsáveis pelo fornecimento de ATP, tampão de cálcio e processos de sinalização1,2. O transporte axonal das mitocôndrias é um processo bem estudado3,4. Curiosamente, foram relatados defeitos no transporte mitocondrial envolvidos em diversas doenças neurodegenerativas e especificamente em doenças de MN5. Compartimentos ácidos servem como outro exemplo para organelas intrínsecas que se movem ao longo de axônios MN. Compartimentos ácidos incluem lisôsôssomos, endóssomos, aparelhos trans-Golgi e certas vesículas secretas6. Defeitos no transporte axonal de compartimentos ácidos foram encontrados em diversas doenças neurodegenerativastambém 7, e artigos recentes destacam sua importância nas doenças de MN8.
Para estudar com eficiência o transporte axonal, são utilizadas câmaras microfluidas que separam compartimentos somáticos e axonais9,,10. As duas vantagens significativas do sistema microfluido, e a compartimentação e o isolamento dos axônios, tornam-no ideal para o estudo dos processos subcelulares11. A separação espacial entre os corpos das células neuronais e os axôonos pode ser usada para manipular os ambientes extracelulares de diferentes compartimentos neuronais (por exemplo, axôns vs. soma). Ensaios bioquímicos, de crescimento/degeneração neuronais e imunofluorescência todos se beneficiam desta plataforma. Os MFCs também podem auxiliar no estudo da comunicação celular-célula, codificando neurônios com outros tipos de células, como músculos esqueléticos12,,13,14.
Aqui, descrevemos um protocolo simples, mas preciso, para monitorar mitocôndrias e o transporte de compartimentos ácidos em neurônios motores. Mostramos ainda o uso deste método comparando a porcentagem relativa de organelas móveis retrógradas e anterogradas, bem como a distribuição da velocidade de transporte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon DU-897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARA-C (Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td>stock of 2mM in filtered DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.25mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504530</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 6mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504533</td>
			<td>For preperation of small MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 7mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504534</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane Imaris software - version 8.4.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A3311-100G</td>
			<td>5% w/v in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimetylsilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#386529-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>C-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Medium - Optiprep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>stock 10mg/mL in neurobasal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14200-067</td>
			<td>dilute 1:10 in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont fine forceps #55 0.05 &#215; 0.02 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>1125520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Hardener</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>IPE 743</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Resin</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>RP 026UV</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>G-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9:GFP mice strain</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14185-045</td>
			<td>Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, curved, 10 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 9 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-440-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep-Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8638</td>
			<td>Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>DOW Corning Corporation</td>
			<td>#3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>stock 25 mg/mL in 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU X-1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system

Neurônios motores (MNs) são células altamente polarizadas com axônios muito longos. O transporte axonal é um mecanismo crucial para a saúde da MN, contribuindo para o crescimento neuronal, desenvolvimento e sobrevivência. Descrevemos um método detalhado para o uso de câmaras microfluidas (MFCs) para o rastreamento do transporte axonal de organelas fluorescentemente rotuladas em axônios MN. Este método é rápido, relativamente barato, e permite o monitoramento de pistas intracelulares no espaço e no tempo. Descrevemos um protocolo passo a passo para: 1) Fabricação de MFCs polidimetilsiloxano (PDMS); 2) Revestimento de explantas medulares ventral e cultura dissociada de MN em MFCs; 3) Rotulagem de mitocôndrias e compartimentos ácidos seguidos de imaginação confocal viva; 4) Análise manual e semiautomatizada do transporte axonal. Por último, demonstramos uma diferença no transporte de mitocôndrias e compartimentos ácidos da medula espinhal bcólmila HB9::GFP da medula espinhal explante axôns como prova da validade do sistema. Ao todo, este protocolo fornece uma ferramenta eficiente para estudar o transporte axonal de vários componentes axonais, bem como um manual simplificado para o uso de MFC para ajudar a descobrir possibilidades experimentais espaciais.

Seguindo o protocolo descrito, as explantas da medula espinhal do rato foram cultivadas em MFC (Figura 4A). Explantas foram cultivadas por 7 dias, quando os axônses se cruzaram totalmente para o compartimento distal. Os corantes vermelhos profundos mitotracker e lisotracker foram adicionados aos compartimentos distal e proximal, a fim de rotular as mitocôndrias e compartimentos ácidos(Figura 4C).</stro...

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Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

O transporte axonal é um mecanismo crucial para a saúde dos neurônios motores. Neste protocolo fornecemos um método detalhado para rastrear o transporte axonal de compartimentos ácidos e mitocôndrias em axônios de neurônios motores usando câmaras microfluidas.

Transporte Axonal de Organelas em Culturas de Neurônios Motores usando sistema de câmaras microfluidas

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

O transporte axonal é vital para a saúde neuronal e a viabilidade. Nosso protocolo descreve um método elegante para monitorar e analisar o transporte axonal. E pode ser adaptado para vários modelos de doenças neuronais.O uso de câmaras microfluidas permite um controle temporal espacial preciso, que é crucial para estudar biologia axonal. Anormalidades no transporte axonal estão implicadas com várias doenças neurodegenerativas, como a ELA. A plataforma microfluidica permite o estudo de mecanismos básicos, bem como testar terapias para reparar defeitos de transporte axonal.A plataforma de câmara microfluida pode ser facilmente adaptada para atender a diferentes aspectos da pesquisa axonal, incluindo crescimento axonal e degeneração de vários subtipos neurais. Este método é complexo e geralmente ensinado de forma prática. A demonstração visual aumentará a acessibilidade deste procedimento a qualquer cientista interessado em estudar o transporte axonal.Comece lançando PDMS em moldes primários. Use ar pressurizado para remover qualquer sujeira da plataforma de wafer, certificando-se de que os wafers pareçam suaves e claros antes de prosseguir. Em seguida, encha um recipiente com nitrogênio líquido e prepare uma seringa de 10 mililitros com uma agulha calibre 23.Em um capô de fumaça química, coloque o wafer contendo placa em um recipiente vedado, e encha a seringa com dois mililitros de nitrogênio líquido por cada wafer contendo placa. Abra uma garrafa de clorofoitilsilano. Fure a tampa de borracha com a seringa e injete o nitrogênio na garrafa.Sem puxar a agulha, vire a garrafa de cabeça para baixo e desenhe dois mililitros de clorofomilano para cada wafer contendo placa. Espalhe o clorofosilano no recipiente, mas não diretamente no wafer contendo a placa. Feche o recipiente.E incubar por cinco minutos por wafer. Em seguida, pese 47,05 gramas de base PDMS em um tubo de 50 mililitros, e adicione agente de cura PDMS a uma proporção de 16 a 1 base ao agente de cura para um total de 50 gramas. Misture o PDMS por 10 minutos em um rotador de baixa velocidade e despeje-o em cada wafer contendo placa à altura desejada.Coloque as placas dentro de um desiccator a vácuo por duas horas. Que removerá o ar preso dentro do PDMS, e formará um molde uniforme claro. Depois incubar as placas em um forno por três horas ou durante a noite a 70 Celsius.Para criar a câmara microfluidica ou MFC. Corte e remova os moldes PDMS da placa com um bisturi, certificando-se de não forçar os moldes porque eles são frágeis. Siga as instruções do manuscrito do texto para perfurar e cortar as câmaras, dependendo da configuração experimental.Para a cultura da explant medular, soque dois poços de sete milímetros no lado distal de um MFC grande, certificando-se de que eles se sobrepõem com as bordas do canal. No lado proximal, soque um poço de sete milímetros bem no meio do canal com sobreposição mínima, de modo que espaço suficiente seja deixado para as explantas. Faça dois furos adicionais de um milímetro nas duas bordas do canal proximal.E cortar o PDMS em câmaras simples. Em seguida, gire o MFC voltado para cima, e use uma agulha de calibre 20 para esculpir em três pequenas cavernas de explant no poço perfurado de sete milímetros. Para a cultura do neurônio motor dissociado, soque quatro poços de seis milímetros, nas bordas dos dois canais de um pequeno MFC e corte o PDMS em câmaras únicas.Para esterilizar o MFC, espalhe faixas de fita adesivas de 50 centímetros de comprimento no banco. Em seguida, pressione ambos os rostos da câmara na fita e puxe-a de volta. Coloque as câmaras limpas em uma nova placa e incuba-as em grau analítico, de 70% de etanol por 10 minutos em um agitador orbital.Descarte o etanol e seque as câmaras em uma capa de cultura de tecido ou em um forno a 70 graus Celsius. Em seguida, coloque a câmara no centro de uma vala de fundo de vidro de grau de cultura tecidual, e aplique uma pequena força nas bordas para ligar o PDMS ao fundo do prato. Incubar o prato por 10 minutos a 70 graus Celsius.Em seguida, pressione as câmaras para fortalecer a adesão. Incubar o prato sob UV por 10 minutos e, em seguida, proceder à codificação do MFC. Adicione 1,5 nanogramas por MILilitro OLP aos dois compartimentos.Certificando-se de que a OLP está passando pelos canais. Ao canalizar a mídia de revestimento diretamente na entrada do canal. Examine o MFC sob um microscópio leve, para verificar se há bolhas.Se as bolhas de ar estiverem bloqueando as micro ranhuras, coloque o MFC em um desiccator a vácuo por dois minutos. Remova o excesso de ar dos canais MFC. Em seguida, incuba-lo durante a noite com a OLP.Substitua a OLP por laminina e incuba o MFC por mais uma noite. Antes de emplacamento, lave o laminina com meio de cultura. Dissecar um rato grávida ICR E12.5 e separar os embriões do saco amniótico.Coloque o embrião no prato de silicone HBSS. Retire a cabeça e a cauda e vire-a para a barriga dele. Retire suavemente a pele superficial dos embriões para trás, expondo a medula espinhal.Separe a medula espinhal do corpo da cabeça à cauda, usando pinças suaves. Remova as meninges, depois remova os chifres dorsais e corte a medula espinhal em seções transversais de um milímetro de espessura. Descarte todos os meios do compartimento proximal do MFC.Pegue uma única explanta medular com uma pipeta, em um volume total de quatro microliters. E injetá-lo o mais perto possível da caverna. Retire qualquer excesso de líquido do poço proximal através das saídas laterais.Repita a etapa anterior mais duas vezes e certifique-se de que as explantas estejam incorporadas no canal proximal. Adicione lentamente 150 microliters de meio SCEX, ao poço proximal. Um dia depois do chapeamento.Substituiu o meio SCEX no compartimento proximal e adicionei o rico meio SCEX ao compartimento distal. Mantendo um gradiente de volume de pelo menos 15 microliters por poço entre os poços distal e proximal. Após quatro a seis dias, os axônios devem atravessar para o compartimento distal e estar prontos para imagens de transporte axonal.Para rotular as mitocôndrias e compartimentos ácidos, prepare o meio SCEX fresco com 100 nanomolar MitoTracker Deep Red FM e 100 nanomolar LysoTracker Red. E adicione-o às câmaras microfluídicas. Incuba-os por 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, lave três vezes com o meio SCEX quente. Prossiga com imagens ao vivo do transporte axonal. Adquirindo uma série de imagens de lapso de tempo de 100 em intervalos de três segundos.Com um total de cinco minutos por filme. Depois de sete dias em câmaras microfluídicas. Explantes da medula espinhal HB9 GFP embrionárias do rato.Estamos manchados com corantes MitoTracker Deep Red e LysoTracker Red. Para rotular as mitocôndrias e compartimentos ácidos. Axônios nas ranhuras distal foram imagens e a análise de kymógrafo foi usada para determinar a distribuição geral do movimento.Isso revelou um viés na direção retrógrada apenas em compartimentos ácidos da cidade, mas não no transporte mitocondrial. A densidade de partículas também foi quantificada, revelando um maior número de partículas mitocondriais em comparação com compartimentos ácidos nos axônios explant da medula espinhal HB9 GFP. Em seguida, a análise de transporte de partículas únicas foi realizada utilizando-se software semi-automatizado seguido de código interno.Esta análise revelou que componentes ácidos e mitocôndrias têm velocidades de partículas semelhantes. Mas apenas compartimentos ácidos mostram um viés em relação ao movimento retrógrado. Isolar a medula espinhal embrionária pode ser difícil no início.Pratique este procedimento várias vezes, certificando-se de usar a idade embrionária correta e as ferramentas de dissecção apropriadas. O uso de câmaras microfluidas muda a forma como estudamos a biologia axonal. Permite visualizar processos axonais localizados, que uma vez somos hipóteses de ocorrer apenas no corpo celular.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Neurociência

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Imagens em tempo real de axonal Transporte de Quantum Dot marcado BDNF na Primária Neurônios

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Ensaio para Medir o Transporte Nucleocitoplasmático em Tempo Real dentro de Células NSC-34 do tipo Motor-Neuron

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Uma Metodologia de Lesão Mecânica Neuronal Simples para Estudar<em&gt; Drosophila</em&gt; Degeneração do Neurônio do Motor

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Na Vivo Eletrofisiológica medição do potencial de ação muscular composto de membros dianteiros em modelos de Mouse de degeneração do neurônio Motor

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...