Name: axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Israel Science (ISF, 561/11) y del Consejo Europeo de Investigación (ERC, 309377).

El cuidado y tratamiento de los animales en este protocolo se llevó a cabo bajo la supervisión y aprobación del Comité Universitario de Ética Animal de Tel Aviv.
1. Preparación MFC
<ol><li>Fundición PDMS en moldes primarios (Figura 1)<ol>
<li>Comprar o crear moldes primarios (wafers) siguiendo un protocolo detallado9.</li>
		<li>Utilice aire presurizado para eliminar cualquier tipo de suciedad de la plataforma de obleas antes de pr...

<ol>
	<li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitostasis+in+Neurons:+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture.">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li><li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease.">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li><li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons.">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).</li><li>Magran&#233;, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li><li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+acidic+intracellular+compartments.">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li><li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration.">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li><li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport,+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether.">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li><li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers.">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li><li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS.">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance.">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ.">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li><li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model.">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 210 (2019).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS.">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li></ol>

En este protocolo, describimos un sistema para rastrear el transporte axonal de mitocondrias y compartimentos ácidos en las neuronas motoras. Esta plataforma in vitro simplificada permite un control, monitoreo y manipulación precisos de los compartimentos neuronales subcelulares, lo que permite el análisis experimental de las funciones locales de las neuronas motoras. Este protocolo puede ser útil para el estudio de enfermedades MN como la ELA, para centrarse en la comprensión del mecanismo subyacente de la disfunci...

Las MN son células altamente polarizadas con axones largos, alcanzando hasta un metro de largo en humanos adultos. Este fenómeno crea un desafío crítico para el mantenimiento de la conectividad y la función MN. En consecuencia, los MN dependen del transporte adecuado de información, orgánulos y materiales a lo largo de los axones desde su cuerpo celular hasta la sinapsis y la espalda. Varios componentes celulares, como proteínas, ARN y orgánulos, se transportan regularmente a través de los axones. Las mitocondrias son orgánulos importantes que se transportan rutinariamente en MNs. Mitocondrias son esenciales para la actividad adecuada y el funcionamiento de los MN, responsables de la provisión de ATP, amortiguación de calcio, y procesos de señalización1,2. El transporte axonal de mitocondrias es un proceso bien estudiado3,4. Curiosamente, se informó que los defectos en el transporte mitocondrial estaban implicados en varias enfermedades neurodegenerativas y específicamente en enfermedades MN5. Los compartimentos ácidos sirven como otro ejemplo para los orgánulos intrínsecos que se mueven a lo largo de los axones MN. Los compartimentos ácidos incluyen lysososomes, endosomas, aparatos trans-Golgi, y ciertas vesículas secretoras6. Los defectos en el transporte axonal de compartimentos ácidos se encontraron en varias enfermedades neurodegenerativas, así como7,y los documentos recientes destacan su importancia en las enfermedades MN8.
Para estudiar eficientemente el transporte axonal, las cámaras microfluídicas que separan los compartimentos somáticos y axonales se utilizan con frecuencia9,10. Las dos ventajas significativas del sistema microfluídico, y la compartimentación y el aislamiento de los axons, lo hacen ideal para el estudio de procesos subcelulares11. La separación espacial entre los cuerpos celulares neuronales y los axons se puede utilizar para manipular los entornos extracelulares de diferentes compartimentos neuronales (por ejemplo, axones vs. soma). Los ensayos bioquímicos, de crecimiento/degeneración neuronal e inmunofluorescencia se benefician de esta plataforma. Las MFC también pueden ayudar a estudiar la comunicación de célula a célula cocultando neuronas con otros tipos de células, como los músculos esqueléticos12,,13,,14.
Aquí, describimos un protocolo simple pero preciso para monitorear las mitocondrias y el transporte del compartimiento ácido en las neuronas motoras. Además, mostramos el uso de este método comparando el porcentaje relativo de orgánulos en movimiento retrógrados y anterogrados, así como la distribución de la velocidad de transporte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon DU-897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARA-C (Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td>stock of 2mM in filtered DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.25mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504530</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 6mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504533</td>
			<td>For preperation of small MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 7mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504534</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane Imaris software - version 8.4.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A3311-100G</td>
			<td>5% w/v in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimetylsilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#386529-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>C-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Medium - Optiprep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>stock 10mg/mL in neurobasal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14200-067</td>
			<td>dilute 1:10 in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont fine forceps #55 0.05 &#215; 0.02 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>1125520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Hardener</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>IPE 743</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Resin</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>RP 026UV</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>G-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9:GFP mice strain</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14185-045</td>
			<td>Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, curved, 10 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 9 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-440-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep-Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8638</td>
			<td>Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>DOW Corning Corporation</td>
			<td>#3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>stock 25 mg/mL in 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU X-1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system

Las neuronas motoras (MN) son células altamente polarizadas con axones muy largos. El transporte axonal es un mecanismo crucial para la salud de la MN, contribuyendo al crecimiento neuronal, desarrollo, y la supervivencia. Describimos un método detallado para el uso de cámaras microfluídicas (MFC) para el seguimiento del transporte axonal de orgánulos etiquetados fluorescentemente en axones MN. Este método es rápido, relativamente barato, y permite el monitoreo de señales intracelulares en el espacio y el tiempo. Describimos un protocolo paso a paso para: 1) Fabricación de MFC de polidimetilsiloxano (PDMS); 2) Revestimiento de explantes de la médula espinal ventral y cultivo disociado MN en MFC; 3) Etiquetado de mitocondrias y compartimentos ácidos seguidode de imaginación confocal viva; 4) Análisis manual y semiautomatizado del transporte axonal. Por último, demostramos una diferencia en el transporte de mitocondrias y compartimentos ácidos de HB9::GFP de la médula espinal ventral explantó axons como prueba de la validez del sistema. En conjunto, este protocolo proporciona una herramienta eficaz para estudiar el transporte axonal de varios componentes axonales, así como un manual simplificado para el uso de MFC para ayudar a descubrir posibilidades experimentales espaciales.

Siguiendo el protocolo descrito, los explantes de la médula espinal embrionario de ratón HB9::GFP se cultivaron en MFC(Figura 4A). Los explantas se cultivaron durante 7 días, cuando los axons se cruzaron completamente en el compartimiento distal. Se añadieron colores rojos Mitotracker Deep Red y Lysotracker a los compartimentos distales y proximales para etiquetar las mitocondrias y los compartimentos ácidos(Figura 4...

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Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

El transporte axonal es un mecanismo crucial para la salud de las neuronas motoras. En este protocolo proporcionamos un método detallado para el seguimiento del transporte axonal de compartimentos ácidos y mitocondrias en axons de neuronas motoras utilizando cámaras microfluídicas.

Transporte axónico de organelos en cultivos de neuronas motoras utilizando el sistema de cámaras microfluídicas

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

El transporte axonal es vital para la salud neuronal y la viabilidad. Nuestro protocolo describe un método elegante para monitorear y analizar el transporte axonal. Y se puede adaptar para varios modelos de enfermedades neuronales.El uso de cámaras microfluídicas permite un control temporal espacial preciso, que es crucial para estudiar la biología axonal. Las anomalías del transporte axonal están implicadas con varias enfermedades neurodegenerativas como la ELA. La plataforma microfluídica permite el estudio de mecanismos básicos, así como terapias de prueba para reparar defectos de transporte axonal.La plataforma de cámara microfluídica se puede adaptar fácilmente para adaptarse a diferentes aspectos de la investigación axonal, incluyendo el crecimiento axonal y la degeneración de varios subtipos neuronales. Este método es complejo y generalmente se enseña práctico. La demostración visual aumentará la accesibilidad de este procedimiento a cualquier científico interesado en estudiar el transporte axonal.Comience por convertir PDMS en moldes primarios. Utilice aire presurizado para eliminar cualquier suciedad de la plataforma de la oblea, asegurándose de que las obleas se vean suaves y claras antes de continuar. A continuación, llene un recipiente con nitrógeno líquido y prepare una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 23.En una campana de humo química, coloque la placa que contiene la oblea en un recipiente sellable y llene la jeringa con dos mililitros de nitrógeno líquido por cada placa que contenga la oblea. Abra una botella de clorotrimetilsilano. Perfore la tapa de goma con la jeringa e inyecte el nitrógeno en el frasco.Sin extraer la aguja, gire la botella al revés e intence dos mililitros de clorotrimetilsilano para cada placa que contenga obleas. Esparce el clorotrimetilsilano en el recipiente, pero no directamente en la placa que contiene la oblea. Cierre el contenedor.Y incubarlo durante cinco minutos por oblea. A continuación, pese 47,05 gramos de base PDMS en un tubo de 50 mililitros y agregue un agente de curado PDMS en una proporción de 16 a 1 base al agente de curado para un total de 50 gramos. Mezcle el PDMS durante 10 minutos en un rotador de baja velocidad y, a continuación, vierta en cada placa que contenga la oblea a la altura deseada.Coloque las placas dentro de un desecador de vacío durante dos horas. Que eliminará el aire atrapado dentro del PDMS, y formará un molde uniforme claro. Después incubar las placas en un horno durante tres horas o durante la noche a 70 grados centígrados.Para crear la cámara microfluídica o MFC. Corte y retire los moldes PDMS de la placa con un bisturí, asegurándose de no forzar los moldes porque son frágiles. Siga las instrucciones del manuscrito de texto para perforar y cortar las cámaras, dependiendo de la configuración experimental.Para el cultivo de explant de la médula espinal, golpee dos pozos de siete milímetros en el lado distal de un MFC grande, asegurándose de que se superpongan con los bordes del canal. En el lado proximal, perforar un pozo de siete milímetros en el centro del canal con una superposición mínima, de modo que quede suficiente espacio para los explantes. Perforar dos agujeros adicionales de un milímetro en los dos bordes del canal proximal.Y cortar el PDMS en cámaras individuales. A continuación, gire el MFC mirando hacia arriba, y utilice una aguja de calibre 20 para tallar en tres pequeñas cuevas explantadas en el pozo perforado siete milímetros. Para el cultivo de neuronas motoras disociadas, perforar cuatro pozos de seis milímetros, en los bordes de los dos canales de un pequeño MFC y cortar el PDMS en cámaras individuales.Para esterilizar el MFC, extienda bandas de cinta adhesiva de 50 centímetros de largo en el banco. A continuación, presione ambas caras de la cámara en la cinta y tire de ella hacia atrás. Coloque las cámaras limpias en una placa nueva e incubarlas en grado analítico, de 70% etanol durante 10 minutos sobre un agitador orbital.Deseche el etanol y seque las cámaras en una campana de cultivo de tejido o en un horno a 70 grados centígrados. A continuación, coloque la cámara en el centro de una zanja inferior de vidrio de grado de cultivo de tejido y aplique una fuerza menor en los bordes para unir el PDMS al fondo del plato. Incubar el plato durante 10 minutos a 70 grados centígrados.A continuación, presione sobre las cámaras para fortalecer la adherencia. Incubar el plato bajo UV durante 10 minutos, luego proceder a la codificación del MFC. Añadir 1,5 nanogramos por mililitro OLP a ambos compartimentos.Asegurarse de que la OLP está corriendo a través de los canales. Pipeteando los medios de recubrimiento directamente en la entrada del canal. Examine el MFC bajo un microscopio de luz, para comprobar si hay burbujas.Si las burbujas de aire bloquean las micro ranuras, coloque el MFC en un desecador de vacío durante dos minutos. Elimine el exceso de aire de los canales MFC. Luego incubar durante la noche con la OLP.Reemplace la OLP por laminin e incubar el MFC para una noche adicional. Antes del enchapado, lave la laminina con un medio de cultivo. Diseccionar un ratón embarazada ICR E12.5 y separar los embriones del saco amniótico.Ponga el embrión en el plato de silicio HBSS. Retire la cabeza y la cola y voltéela sobre su vientre. Pelar suavemente la piel superficial de los embriones hacia atrás, exponiendo la médula espinal.Separe la médula espinal del cuerpo de la cabeza a la cola, usando pinzas suaves. Retire las meninges, luego retire los cuernos dorsales y corte la médula espinal en secciones transversales de un milímetro de espesor. Deseche todo el medio del compartimento proximal del MFC.Recoger una sola explant de la médula espinal con una pipeta, en un volumen total de cuatro microlitros. E inyéctalo lo más cerca posible de la cueva. Extraiga cualquier exceso de líquido del pozo proximal a través de las salidas laterales.Repita el paso anterior dos veces más y asegúrese de que los explants están incrustados en el canal proximal. Añadir lentamente 150 microlitros de medio SCEX, al pozo proximal. Un día después del enchapado.Se ha sustituido el medio SCEX en el compartimento proximal y se añade un medio SCEX rico al compartimento distal. Mantener un gradiente de volumen de al menos 15 microlitros por pozo entre los pozos distales y proximales. Después de cuatro a seis días, los axones deben cruzar al compartimiento distal y estar listos para la toma de imágenes de transporte axonal.Para etiquetar las mitocondrias y los compartimentos ácidos, prepare un medio SCEX fresco con 100 nanomolares MitoTracker Deep Red FM y 100 nanomolares LysoTracker Red. Y añádalo a las cámaras microfluídicas. Incubarlos durante 30 a 60 minutos a 37 grados centígrados.A continuación, lave tres veces con un medio SCEX cálido. Proceder con imágenes en vivo del transporte axonal. Adquirir una serie de imágenes de lapso de tiempo de 100 en tres intervalos.Con un total de cinco minutos por película. Después de siete días en cámaras microfluídicas. Explanta la médula espinal HB9 GFP embrionaria de ratón.Estamos manchados con los tintes Rojo Profundo y LysoTracker Rojo. Para etiquetar las mitocondrias y los compartimentos ácidos. Se tomaron imágenes de axones en las ranuras distales y se utilizó el análisis de kymograph para determinar la distribución general del movimiento.Esto reveló un sesgo en la dirección retrógrada sólo en compartimentos ácidos de la ciudad, pero no en el transporte mitocondrial. La densidad de partículas también se cuantificó, revelando un mayor número de partículas mitocondriales en comparación con los compartimentos ácidos en los ejes explantados de la médula espinal HB9 GFP. A continuación, se llevó a cabo un análisis de transporte de partículas únicas utilizando software semiautomático seguido de código interno.Este análisis reveló que los componentes ácidos y las mitocondrias tienen velocidades de partículas similares. Pero sólo los compartimentos ácidos muestran un sesgo hacia el movimiento retrógrado. Aislar la médula espinal embrionaria puede ser difícil al principio.Practique este procedimiento varias veces, asegurándose de utilizar la edad embrionaria correcta y las herramientas de disección adecuadas. El uso de cámaras microfluídicas cambia la forma en que estudiamos la biología axonal. Nos permite visualizar procesos axonales localizados, que una vez nos presume que ocurren sólo en el cuerpo celular.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Emparejados grabaciones patch clamp de neurona motora y el músculo esquelético de destino en el pez cebra

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Investigación

Neurociencias

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Derivación de las Culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating Co-culturas de Post-natal tejidos murinos

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Análisis de imágenes de Neuron a la interacción glía en la Plataforma Cultura Microfluidic (MCP)-basada en Axón Neuronal y Sistema Glia Co-cultura

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Imágenes en tiempo real de Axonal Transporte de Quantum Dot-etiquetado BDNF en las neuronas primarias

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Ensayo para medir el transporte nucleocitoplasmático en tiempo real dentro de las células NSC-34 similares a neuronas motoras

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Una Metodología Neuronal Simple de Lesiones Mecánicas para Estudiar<em&gt; Drosophila</em&gt; Degeneración de Neuronas Motoras

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

En Vivo Medición electrofisiológica de potencial de acción compuesto del músculo de las extremidades anteriores en modelos de ratón de la degeneración de la motoneurona

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualización y análisis del transporte intracelular de organelos y otros Cargos en astrocitos

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...