Name: axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Detta arbete stöddes av bidrag från Israel Science Foundation (ISF, 561/11) och Europeiska forskningsrådet (ERC, 309377).

Vård och behandling av djur i detta protokoll utfördes under överinseende och godkännande av Tel Aviv University Committee for Animal Ethics.
1. MFC förberedelse
<ol><li>PDMS gjutning i primära formar (figur 1)<ol>
<li>Köpa eller skapa primära formar (plattor) enligt ett detaljerat protokoll9.</li>
		<li>Använd tryckluft för att avlägsna någon typ av smuts från wafer-plattformen innan du fortsätter till beläggningssteget. Y...

<ol>
	<li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitostasis+in+Neurons:+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture.">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li><li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease.">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li><li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons.">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).</li><li>Magran&#233;, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li><li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+acidic+intracellular+compartments.">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li><li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration.">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li><li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport,+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether.">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li><li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers.">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li><li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS.">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance.">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ.">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li><li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model.">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 210 (2019).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS.">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li></ol>

I detta protokoll beskriver vi ett system för att spåra axonal transport av mitokondrierna och sura fack i motoriska nervceller. Denna förenklade in vitro-plattform möjliggör exakt kontroll, övervakning och manipulering av subcellulära neuronala fack, vilket möjliggör experimentell analys av motor neuron lokala funktioner. Detta protokoll kan vara användbart för att studera MN-sjukdomar som ALS, att fokusera på att förstå den underliggande mekanismen för axonal transport dysfunktion i sjukdomen<sup class="...

MNs är mycket polariserade celler med långa axoner, når upp till en meter lång hos vuxna människor. Detta fenomen skapar en kritisk utmaning för underhåll av MN-anslutning och funktion. Följaktligen är MNs beroende av korrekt transport av information, organeller och material längs axonerna från cellkroppen till synapsen och ryggen. Olika cellulära komponenter, såsom proteiner, RNA och organeller transporteras regelbundet genom axoner. Mitokondrierna är viktiga organeller som rutinmässigt transporteras i MNs. Mitokondrierna är nödvändiga för korrekt aktivitet och funktion av MNs, som ansvarar för ATP-tillhandahållande, kalciumbuffertning och signalprocesser1,2. Axonal transport av mitokondrierna är en väl studerad process3,4. Intressant nog rapporterades defekter i mitokondriell transport vara inblandade i flera neurodegenerativa sjukdomar och särskilt i MN-sjukdomar5. Sura fack fungerar som ett annat exempel för inneboende organeller som rör sig längs MN axoner. Sura fack inkluderar lysosomer, endosomer, trans-Golgi-apparat och vissa sekretoriska blåsor6. Defekter i axonal transport av sura avdelningar hittades i flera neurodegenerativa sjukdomar samt7, och de senaste tidningarna belysa deras betydelse i MN sjukdomar8.
För att effektivt studera axonal transport används mikrofluidiska kammare som separerar somatiska och axonala fack ofta9,,10. De två betydande fördelarna med mikrofluidiska systemet, och uppdelningen och isoleringen av axoner, gör det idealiskt för studier av subcellulära processer11. Den rumsliga separationen mellan neuronala cellkroppar och axoner kan användas för att manipulera de extracellulära miljöerna i olika neuronala fack (t.ex. axoner vs soma). Biokemiska, neuronal tillväxt/degeneration, och immunofluorescens analyser alla dra nytta av denna plattform. MBC kan också hjälpa till att studera cell-till-cell kommunikation genom att coculturing nervceller med andra celltyper, såsom skelettmuskulaturen12,13,14.
Här beskriver vi ett enkelt men exakt protokoll för övervakning mitokondrierna och sura fack transport i motor nervceller. Vi visar vidare användningen av denna metod genom att jämföra den relativa andelen bakåtsträvande och anterograde rörliga organeller, samt fördelningen av transporthastighet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon DU-897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARA-C (Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td>stock of 2mM in filtered DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.25mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504530</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 6mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504533</td>
			<td>For preperation of small MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 7mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504534</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane Imaris software - version 8.4.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A3311-100G</td>
			<td>5% w/v in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimetylsilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#386529-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>C-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Medium - Optiprep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>stock 10mg/mL in neurobasal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14200-067</td>
			<td>dilute 1:10 in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont fine forceps #55 0.05 &#215; 0.02 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>1125520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Hardener</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>IPE 743</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Resin</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>RP 026UV</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>G-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9:GFP mice strain</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14185-045</td>
			<td>Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, curved, 10 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 9 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-440-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep-Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8638</td>
			<td>Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>DOW Corning Corporation</td>
			<td>#3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>stock 25 mg/mL in 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU X-1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system

Motoriska nervceller (MNs) är mycket polariserade celler med mycket långa axoner. Axonal transport är en viktig mekanism för MN hälsa, bidrar till neuronal tillväxt, utveckling, och överlevnad. Vi beskriver en detaljerad metod för användning av mikrofluidiska kammare (MMF) för att spåra axonal transport av fluorescerande märkta organeller i MN axons. Denna metod är snabb, relativt billig, och möjliggör övervakning av intracellulära ledtrådar i tid och rum. Vi beskriver ett steg för steg protokoll för: 1) Tillverkning av polydimetylsiloxan (PDMS) MFC; 2) Plätering av ventrala ryggmärg explants och MN separerad kultur i MBC; 3) Märkning av mitokondrierna och sura fack följt av levande confocal fantasi; 4) Manuell och halvautomatisk axonal transportanalys. Slutligen visar vi en skillnad i transport av mitokondrierna och sura avdelningar av HB9::GFP ventrala ryggmärg explant axoner som ett bevis på systemets giltighet. Sammantaget ger detta protokoll ett effektivt verktyg för att studera axonal transport av olika axonalkomponenter, samt en förenklad handbok för MFC-användning för att hjälpa till att upptäcka rumsliga experimentella möjligheter.

Efter det beskrivna protokollet odlades mus embryonala HB9::GFP ryggmärgsexplants i MFC (figur 4A). Explants odlades i 7 dagar, när axoner helt korsade in i distala facket. Mitotracker Deep Red och Lysotracker Röda färgämnen tillsattes de distala och proximala facken för att märka mitokondrierna och sura facken (figur 4C). Axoner i de distala spåren avbildades, och filmerna analyserades p...

Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Axonal transport är en viktig mekanism för motor neuron hälsa. I detta protokoll ger vi en detaljerad metod för att spåra axonal transport av sura fack och mitokondrierna i motor neuron axons med mikrofluidic kammare.

Axonal Transport av organeller i motor neuron kulturer med microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Axonal transport är avgörande för neuronal hälsa och livskraft. Vårt protokoll beskriver en elegant metod för att övervaka och analysera axonal transport. Och kan anpassas för olika neuronala sjukdomsmodeller.Användningen av mikrofluidiska kammare möjliggör exakt rumslig tidsmässig kontroll, vilket är avgörande för att studera axonalbiologi. Axonal transport avvikelser är inblandad med flera neurodegenerativa sjukdom såsom ALS. Den mikrofluidiska plattformen möjliggör studier av grundläggande mekanismer samt testning av terapier för att reparera axonal transportdefekter.Den mikrofluidiska kammarplattformen kan enkelt anpassas för att passa olika aspekter av axonal forskning, inklusive axonal tillväxt och degeneration av olika neurala subtyper. Denna metod är komplex och oftast undervisade hands-on. Den visuella demonstrationen kommer att öka tillgängligheten av detta förfarande för alla forskare som är intresserade av att studera axonal transport.Börja med att gjuta PDMS i primära formar. Använd trycksatt luft för att avlägsna eventuell smuts från wafer-plattformen, varvid du ser noga ut och klar innan du fortsätter. Därefter fyller du en behållare med flytande kväve och förbereder en 10 milliliter spruta med en 23 gauge nål.I en kemisk rökhuv, placera wafer innehållande platta i en förslutningsbar behållare, och fyll sprutan med två milliliter flytande kväve per varje wafer innehållande platta. Öppna en kloritlymetylsilanflaska. Stick hål i gummilocket med sprutan och injicera kvävet i flaskan.Utan att dra ut nålen, Vänd flaskan upp och ner och nackdelen två milliliter kloritotylsilan för varje wafer innehållande platta. Sprid klortrimetylsilan i behållaren, men inte direkt på wafer innehållande platta. Stäng behållaren.Och ruva den i fem minuter per rån. Nästa väger 47.05 gram PDMS bas i en 50 milliliter rör, och lägga PDMS härdningsmedel vid ett förhållande av 16 till 1 bas till härdningsmedel för totalt 50 gram. Blanda PDMS i 10 minuter på en låg hastighetsrotator, häll den sedan i varje wafer innehållande platta till önskad höjd.Placera plattorna inuti en vakuumutsetyp i två timmar. Som kommer att ta bort luft instängd i PDMS, och bildar en tydlig enhetlig mögel. Därefter inkubera plattorna i en ugn i tre timmar eller över natten vid 70 Celsius.Att skapa den mikrofluidiska kammaren eller MFC. Skär och ta bort PDMS formar från plattan med en skalpell, se till att inte tvinga formar eftersom de är bräckliga. Följ instruktionerna i textmanuskriptet för att punscha och klippa kamrarna, beroende på experimentupplägget.För ryggmärg explant kultur, punsch två sju millimeter brunnar i den distala sidan av en stor MFC, se till att de kommer att överlappa med kanalkanterna. På den proximala sidan, stans en sju millimeter väl i mitten av kanalen med minimal överlappning, så att tillräckligt utrymme lämnas för explants. Stansa ytterligare två millimeters hål i den proximala kanalens två kanter.Och skär PDMS i enstaka kammare. Vrid sedan MFC uppåt, och använd en 20 gauge nål för att skära på tre små explant grottor på stansade sju millimeter väl. För dissocierade motor neuron kultur, punsch fyra sex millimeter brunnar, i kanterna på de två kanalerna i en liten MFC och skär PDMS i enstaka kammare.För att sterilisera MFC, sprida 50 centimeter långa tejpband på bänken. Tryck sedan på kammarens båda ansikten på bandet och dra tillbaka den. Placera de rena kamrarna i en ny platta och inkubera dem i analytisk kvalitet, av 70%etanol i 10 minuter på en orbitalskak.Kassera etanol och torka kamrarna i en vävnadskulturhuva eller i en ugn vid 70 grader Celsius. Placera sedan kammaren i mitten av en vävnad kultur grade glas botten dike, och tillämpa mindre kraft på kanterna för att binda PDMS till skålen botten. Inkubera skålen i 10 minuter vid 70 grader Celsius.Tryck sedan på kamrarna för att stärka följsamheten. Inkubera skålen under UV i 10 minuter, fortsätt sedan till kodning av MFC. Tillsätt 1,5 nanogram per milliliter PLO till båda facken.Se till att PLO körs genom kanalerna. Genom att pipettera beläggningsmediet direkt i kanalingången. Undersök MFC under ett ljusmikroskop, för att kontrollera om det finns bubblor.Om luftbubblor blockerar mikrospåren, placera MFC i en vakuumdesiccators i två minuter. Ta bort överflödig luft från MFC-kanalerna. Sedan ruva den över natten med PLO.Ersätt PLO med laminin och inkubera MFC för ytterligare en natt. Före plätering, tvätta laminin med odlingsmedium. Dissekera en ICR E12.5 gravid mus, och separera embryona från fostersäcken.Lägg embryot i HBSS Silicon-skålen. Ta bort huvudet och svansen och vänd den på magen. Skala försiktigt bort ytlig hud från embryona tillbaka, utsätta ryggmärgen.Separera ryggmärgen från kroppen från huvud till svans, med hjälp av mild pincett. Ta bort hjärnhinnorna, ta sedan bort rygghornen och skär ryggmärgen i en millimeter tjocka tvärsektioner. Kassera allt medium från det proximala facket i MFC.Plocka upp en enda ryggmärg explant med en pipett, i en total volym av fyra mikroliter. Och injicera den så nära grottan som möjligt. Dra ut eventuell överflödig vätska från den proximala brunnen via de laterala utloppen.Upprepa föregående steg ytterligare två gånger och se till att explanterna är inbäddade i den proximala kanalen. Tillsätt långsamt 150 mikroliter scex-medium, till den proximala brunnen. En dag efter plätering.Bytte ut SCEX-mediet i det proximala facket och lägg till fylligt SCEX-medium till det distala facket. Upprätthålla en volymgradient på minst 15 mikroliter per brunn mellan de distala och proximala brunnarna. Efter fyra till sex dagar, axoner bör korsa till distala facket och vara redo för axonal transport avbildning.För att märka mitokondrierna och de sura facken, tillred färskt SCEX-medium med 100 nanomolar MitoTracker Deep Red FM, och 100 nanomolar LysoTracker Red. Och lägg till det i de mikrofluidiska kamrarna. Inkubera dem i 30 till 60 minuter vid 37 grader Celsius.Tvätta sedan tre gånger med varmt SCEX medium. Fortsätt med live avbildning av axonal transport. Förvärva en 100 time lapse bildserie med tre andra intervall.Med totalt fem minuter per film. Efter sju dagar i mikrofluidiska kammare. Mus embryonala HB9 GFP ryggmärg explants.Vi är fläckade med MitoTracker Deep Red och LysoTracker Red färgämnen. Att märka mitokondrierna och sura fack. Axons i de distala spåren var avbildade och Kymograph analys användes för att bestämma den allmänna rörelsefördelningen.Detta visade en partiskhet i bakåtsträvande riktning endast i sura staden fack, men inte i mitokondriellt transporter. Partikeldensiteten kvantifierades också, avslöjar ett högre antal mitokondriellt partiklar jämfört med sura fack i HB9 GFP ryggmärg explant axoner. Därefter genomfördes enstaka partikeltransportanalys med hjälp av halvautomatisk programvara följt av in-house-kod.Denna analys visade att sura komponenter och mitokondrierna har liknande partikel hastigheter. Men bara sura fack visar en bias mot bakåtsträvande rörelse. Isolera embryonala ryggmärgen kan vara svårt i början.Öva detta förfarande flera gånger, se till att använda rätt embryonala ålder och lämpliga dissektion verktyg. Användningen av mikrofluidiska kammare förändrar vårt sätt att studera axonalbiologi. Det gör det möjligt för oss att visualisera lokaliserade axonal processer, som vi en gång är hypotetiska att endast förekomma i cellkroppen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Kopplade Patch Clamp Inspelningar från Motor-neuron och Target skelettmuskulaturen i Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Härledning av anrikat Oligodendrocyte kulturer och Oligodendrocyte / Neuron Myelinating Co-kulturer från Postnatal Murine vävnader

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Bildanalys av neuron till Glia interaktion i mikroflödessystem Kultur Platform (MCP)-baserade neuronal Axon och Glia samodlingssystemet

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Realtid avbildning av axonal transport av Quantum Dot-märkta BDNF i primära neuroner

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulära förbindelsen: Mäta Synapse Storlek, fragmentering och Förändringar i Synaptic Protein Densitet Använda Confocal fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Analys för att mäta nukleocytoplasmisk transport i realtid inom motor neuronliknande NSC-34-celler

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualisering av Axonal Projektionsmönstret av Embryonic Motor Neurons in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

En enkel neuronal mekanisk skada metodik att studera<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Elektrofysiologisk mätning av sammansatta muskel aktionspotential från frambenen i musmodeller av motorneuronen Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Visualisera och analysera intracellulär transport av organeller och andra laster i astrocyter

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...