Name: axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı (ISF, 561/11) ve Avrupa Araştırma Konseyi 'nin (ERC, 309377) bağışları ile desteklenmiştir.

Bu protokolde hayvanların bakımı ve tedavisi Tel Aviv Üniversitesi Hayvan Etiği Komitesi'nin gözetimi ve onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. MFC hazırlığı
<ol><li>Primer kalıplarda PDMS döküm (Şekil 1)<ol>
<li>Ayrıntılı bir protokol9'utakiben birincil kalıpları (gofretler) satın alın veya oluşturun.</li>
		<li>Kaplama adımına geçmeden önce gofret platformundan her türlü kiri temizlemek için basınçlı hava...

<ol>
	<li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitostasis+in+Neurons:+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture.">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li><li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease.">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li><li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons.">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li><li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons.">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).</li><li>Magran&#233;, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models.">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li><li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+of+acidic+intracellular+compartments.">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li><li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration.">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li><li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport,+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether.">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li><li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers.">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li><li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS.">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).</li><li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance.">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ.">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li><li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons.">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li><li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model.">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (3), 210 (2019).</li><li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions.">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li><li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS.">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li></ol>

Bu protokolde motor nöronlarda mitokondri ve asidik kompartmanların aksonal naklini takip edecek bir sistem tanımlıyoruz. Bu basitleştirilmiş in vitro platform hassas kontrol sağlar, izleme, ve subsellüler nöronal bölmelerin manipülasyon, motor nöron yerel fonksiyonların deneysel analizi sağlayan. Bu protokol, als gibi MN hastalıklarının incelenmesinde yararlı olabilir, hastalıkta aksonal taşıma disfonksiyonunun altında yatan mekanizmayı anlamaya odaklanmak için10,</su...

MN'ler uzun aksonlarla yüksek oranda polarize hücrelerdir ve yetişkin insanlarda bir metreye kadar uzundur. Bu fenomen, MN bağlantısının ve işlevinin sürdürülmesi için kritik bir sorun yaratır. Sonuç olarak, MN'ler aksonlar boyunca bilgi, organel ve malzemelerin hücre gövdesinden sinapsa ve sırta doğru şekilde taşınmasına bağlıdır. Proteinler, RNA ve organeller gibi çeşitli hücresel bileşenler aksonlar aracılığıyla düzenli olarak mekiklenir. Mitokondri rutin MNs taşınır önemli organeller vardır. Mitokondri UYGUN aktivite ve MNs fonksiyonu için gerekli olan, ATP sağlanması sorumlu, kalsiyum tamponlama, ve sinyalizasyon süreçleri1,2. Mitokondri aksonal taşıma iyi çalışılmış bir süreçtir3,4. İlginçtir, mitokondriyal taşıma kusurları çeşitli nörodejeneratif hastalıklarve özellikle MN hastalıklarında dahil olduğubildirilmiştir 5. Asidik bölmeler MN akson boyunca hareket içsel organeller için başka bir örnek olarak hizmet vermektedir. Asidik bölmeler arasında izozomlar, endozomlar, trans-Golgi cihazları ve bazı salgı vezikülleri6bulunmaktadır. Asidik kompartmanların aksonal taşıma kusurları çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda da bulundu7, ve son kağıtları MN hastalıklarında önemini vurgulamak8.
Aksonal taşımayı verimli bir şekilde incelemek için somatik ve aksonal bölmeleri birbirinden ayıran mikroakışkan bölmeler 9,10sıklıklakullanılmaktadır. Mikroakışkan sistemin iki önemli avantajı ve aksonları bölme ve izolasyon, hücre altı süreçlerin çalışması için ideal hale11. Nöronal hücre organları ve aksonları arasındaki mekansal ayrım, farklı nöronal bölmelerin hücre dışı ortamlarını (örn. aksonların soma'ya karşı) manipüle etmek için kullanılabilir. Biyokimyasal, nöronal büyüme/ dejenerasyon ve immünofloresan tsays tüm bu platformdan yarar. MFCs da diğer hücre tipleri ile nöronların koculturing hücre-hücre iletişimi çalışmalarında yardımcı olabilir, iskelet kasları gibi12,13,14.
Burada, motor nöronlarda mitokondri ve asidik kompartman naklinin izlenmesi için basit ama kesin bir protokol uyguluyoruz. Ayrıca retrograd ve anterograd hareketli organellerin göreceli yüzdesini ve taşıma hızının dağılımını karşılaştırarak bu yöntemin kullanımını da gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mm Fluodish &#8211; glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andor iXon DU-897 EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARA-C (Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1768</td>
			<td>stock of 2mM in filtered DDW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>B-250</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 1.25mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504530</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 6mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504533</td>
			<td>For preperation of small MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch 7mm</td>
			<td>World Precision Instruments WPI</td>
			<td>504534</td>
			<td>For preperation of large MFC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bitplane Imaris software - version 8.4.1</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#A3311-100G</td>
			<td>5% w/v in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimetylsilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#386529-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNTF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>C-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Medium - Optiprep</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN-25</td>
			<td>stock 10mg/mL in neurobasal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-vacuum silicone grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14200-067</td>
			<td>dilute 1:10 in ddw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont fine forceps #55 0.05 &#215; 0.02 mm</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>1125520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Hardener</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>IPE 743</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy Resin</td>
			<td>Trias Chem S.R.L</td>
			<td>RP 026UV</td>
			<td>For epoxy mold preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Alomone Labs</td>
			<td>G-240</td>
			<td>Dilute to 10 &#181;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9:GFP mice strain</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10X</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#14185-045</td>
			<td>Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ software</td>
			<td>Andor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, curved, 10 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-441-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors, straight, 9 cm</td>
			<td>AS Medizintechnik</td>
			<td>11-440-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Deep-Red FM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M22426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti micorscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-031-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithin (PLO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P8638</td>
			<td>Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>DOW Corning Corporation</td>
			<td>#3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td>stock 25 mg/mL in 1XPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yokogawa CSU X-1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system

Motor nöronlar (MNs) çok uzun aksonlar ile yüksek polarize hücrelerdir. Aksonal ulaşım MN sağlığı için önemli bir mekanizmadır, nöronal büyüme katkıda, gelişme, ve sağkalım. MN aksonları floresan etiketli organellerin aksonal naklini izlemek için mikroakışkan odaların (MFCs) kullanımı için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem hızlı, nispeten ucuz, ve uzay ve zaman hücre içi ipuçları izlenmesi için izin verir. Biz için adım protokolü bir adım açıklar: 1) Polidimethylsiloxane imalatı (PDMS) MFCs; 2) MCD'lerde ventral omurilik eksplandisi ve MN ayrıştırılmış kültürün kaplaması; 3) Mitokondri ve asidik bölmelerin etiketlenmesi ve ardından canlı konfokal hayal; 4) Manuel ve yarı otomatik aksonal taşıma analizi. Son olarak, sistem geçerliliğinin bir kanıtı olarak MITOKONDRİ ve HB9 asidik bölmelerinin taşınmasında bir fark gösteriyoruz::GFP ventral omurilik ekstrkül aksonları. Bu protokol, çeşitli aksonal bileşenlerin aksonal taşımasını incelemek için etkili bir araç ve mekansal deneysel olasılıkları keşfetmeye yardımcı olmak için MFC kullanımı için basitleştirilmiş bir kılavuz sağlar.

Açıklanan protokolütaki şekliyle fare embriyonik HB9::GFP omurilik ekslekları MFC'de kültürlenmiştir (Şekil 4A). Eksteseler 7 gün boyunca büyüdü, aksonlar tamamen distal bölmeye geçti. Mitotracker Deep Red ve Lysotracker Red boyaları distal ve proksimal bölmelere mitokondri ve asidik bölmeleri etiketlemek için eklenmiştir(Şekil 4C). Distal oluklarda akson lar görüntülendi ...

Watch this Scientific Journal Video about Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System at JoVE.com

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Aksonal taşıma motor nöron sağlığı için çok önemli bir mekanizmadır. Bu protokolde mikroakışkan odacıklar kullanılarak motor nöron aksonlarında asidik bölmelerin ve mitokondrinin aksonal naklinin izlenmesi için ayrıntılı bir yöntem sağlıyoruz.

Mikroakışkan Odacıksistemi Kullanılarak Motor Nöron Kültürlerinde Organellerin Aksonal Taşınması

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Aksonal taşıma nöronal sağlık ve canlılık için hayati önem taşımaktadır. Protokolümüz aksonal taşımayı izlemek ve analiz etmek için zarif bir yöntem tanımlar. Ve çeşitli nöronal hastalık modelleri için adapte edilebilir.Mikroakışkan odaların kullanımı aksonal biyoloji eğitimi için çok önemli olan kesin mekansal zamansal kontrol sağlar. Aksonal ulaşım anormallikleri ALS gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarile karışır. Mikroakışkan platform, aksonal taşıma kusurlarını onarmak için temel mekanizmaların incelenmesini ve terapilerin test edilmesini sağlar.Mikroakışkan oda platformu aksonal araştırmanın farklı yönlerine uyacak şekilde kolayca uyarlanabilir, aksonal büyüme ve çeşitli nöral alt tiplerin dejenerasyonu da dahil olmak üzere. Bu yöntem karmaşıktır ve genellikle uygulamalı olarak öğretilir. Görsel gösteri aksonal ulaşım eğitimi ile ilgilenen herhangi bir bilim adamı için bu prosedürün erişilebilirliğini artıracaktır.Birincil kalıplarda PDMS döküm ile başlayın. Gofret platformundaki kirleri gidermek için basınçlı hava yı kullanabilirsiniz, devam etmeden önce gofretlerin pürüzsüz ve net görünmesini sağlar. Daha sonra, sıvı nitrojen ile bir kap doldurun ve 23 gauge iğne ile 10 mililitrelik şırınga hazırlamak.Kimyasal bir duman başlığında, plaka içeren gofreti sızdırmaz bir kapta yerleştirin ve şırıngayı her gofret için iki mililitre sıvı nitrojen içeren plaka ile doldurun. Klorotrimtilsilane şişesi açın. Kauçuk kapağı şırıngayla delin ve nitrojeni şişeye enjekte edin.İğneyi çekmeden, şişeyi ters çevirin ve her gofret içeren plaka için iki mililitre klorotrimethylsilane çekin. Klorotrimethylsilane'i kapta yayın, ancak doğrudan içeren kofret üzerinde değil. Kabı kapatın.Ve gofret başına beş dakika kuluçkaya yat. Sonraki 50 mililitrelik bir tüp PDMS baz 47,05 gram tartmak ve toplam 50 gram kür ajan 16-1 baz oranında PDMS kür ajan ekleyin. DÜŞÜK hızlı bir rotatör üzerinde 10 dakika boyunca PDMS karıştırın, sonra istenilen yüksekliğe plaka içeren her gofret içine dökün.Plakaları iki saat boyunca vakum lu bir kurutucunun içine yerleştirin. Bu da PDMS'de sıkışıp kalan havayı ortadan kaldıracak ve temiz bir üniforma kalıbı oluşturacak. Daha sonra 70 Santigrat üç saat veya gece boyunca bir fırında plakaları kuluçka.Mikroakışkan hazne veya MFC oluşturmak için. PDMS kalıplarını neşterle plakadan kesin ve çıkarın, kırılgan oldukları için kalıpları zorlamamaya özen. Deneysel kuruluma bağlı olarak, odaları yumruklamak ve kesmek için metin el yazmasındaki talimatları izleyin.Omurilik ekstrüzyon kültürü için, büyük bir MFC distal tarafında iki yedi milimetrelik kuyu yumruk, onlar kanal kenarları ile örtüşecek emin olun. Proksimal tarafta, en az çakışma ile kanalın ortasında bir yedi milimetre iyi yumruk, böylece ekspertize için yeterli alan bırakılır. Proksimal kanalın iki kenarına iki ek bir milimetre delik delin.Ve PDMS'yi tek bölmeye böl. Daha sonra MFC'yi yukarı doğru çevirin ve delikli yedi milimetrelik kuyunun üzerine üç küçük ekstrüzyon mağarasına oymak için 20 kalibrelik bir iğne kullanın. Ayrık motor nöron kültürü için, küçük bir MFC iki kanal kenarlarında dört altı milimetrelik kuyuyumruk ve tek odalar halinde PDMS kesti.MFC sterilize etmek için, bankta 50 santimetre uzunluğunda yapışkan bantları yayıldı. Sonra kasetteki odanın iki yüzünü de bastırın ve geri çekin. Temiz odaları yeni bir tabağa yerleştirin ve 10 dakika boyunca orbital shaker üzerinde %70 etanol, analitik kalitede kuluçkaya yatırın.Etanol atın ve bir doku kültür başlık veya 70 santigrat derece bir fırında odaları kuru. Sonra bir doku kültürü sınıf cam alt hendek merkezine oda yerleştirin ve çanak alt PDMS bağlamak için kenarlarında küçük kuvvet uygulayın. 70 santigrat derece 10 dakika boyunca çanak kuluçka.Sonra bağlılığı güçlendirmek için odalara basın. 10 dakika UV altında çanak kuluçka, sonra MFC kodlama devam edin. Her iki bölmeye de mililitre PLO başına 1,5 nanogram ekleyin.FKÖ'nün kanallarda olduğundan emin olmak. Kaplama ortamını doğrudan kanal girişine borulayarak. Kabarcıkları kontrol etmek için MFC'yi ışık mikroskobu altında inceleyin.Hava kabarcıkları mikro olukları engelliyorsa, MFC'yi iki dakika boyunca vakumlu kurutuculara yerleştirin. MFC kanallarından fazla havayı çıkarın. Sonra plo ile bir gecede kuluçka.FKÖ'yü lamininle değiştirin ve ek bir gece için MFC'yi kuluçkaya yatırın. Kaplamadan önce laminini kültür ortamıyla yıkayın. ICR E12.5 gebe fareyi inceleyin ve embriyoları amniyotik keseden ayırın.Embriyoyu HBSS Silikon kabına koyun. Başını ve kuyruğunu çıkar ve karnına çevir. Yavaşça geri embriyolar yüzeysel deri soyma, omurilik açığa.Nazik cımbız kullanarak, kafadan kuymak için vücuttan omurilik ayırın. Menenjler çıkarın, sonra dorsal boynuzları kaldırmak ve bir milimetre kalınlığında enine bölümler halinde omurilik kesti. MFC'nin proksimal bölmesinden tüm ortamları atın.Dört mikrolitre toplam hacmi, bir pipet ile tek bir omurilik ekstrbitki pick up. Ve mağaraya mümkün olduğunca yakın enjekte edin. Lateral çıkışları ile proksimal kuyudan herhangi bir aşırı sıvı çekin.Önceki adımı iki kez daha tekrarlayın ve ekskalanların proksimal kanala yerleştirdiğinden emin olun. Yavaşça proksimal kuyuya, SCEX orta 150 mikrolitre ekleyin. Kaplamadan bir gün sonra.Proksimal bölmedeki SCEX ortamını değiştirin ve distal bölmeye zengin SCEX ortamı ekleyin. Distal ve proksimal kuyular arasında kuyu başına en az 15 mikrolitre hacim degradesi bakımı. Dört ila altı gün sonra, aksondistal bölmeye geçmek ve aksonal taşıma görüntüleme için hazır olmalıdır.Mitokondri ve asidik bölmeleri etiketlemek için, 100 nanomolar MitoTracker Deep Red FM ve 100 nanomolar LysoTracker Kırmızı ile taze SCEX orta hazırlamak. Ve mikroakışkan odalara ekleyin. 37 santigrat derecede 30-60 dakika kuluçkaya yat.Daha sonra sıcak SCEX orta ile üç kez yıkayın. Aksonal taşımanın canlı görüntülemesi ile devam edin. Üç saniye aralıklarla 100 zaman atlamalı görüntü serisi edinme.Film başına toplam beş dakika. Mikroakışkan odalarda yedi gün kaldıktan sonra. Fare embriyonik HB9 GFP omurilik eksgelentisi.Biz MitoTracker Deep Red ve LysoTracker Kırmızı boyalar ile lekeli konum. Mitokondri ve asidik bölmeleri etiketlemek için. Distal oluklarda akson lar görüntülenmiş ve genel hareket dağılımını belirlemek için Kymograph analizi kullanılmıştır.Bu sadece asidik şehir bölmelerinde retrograd yönde bir önyargı ortaya, ama mitokondriyal taşıma değil. Parçacık yoğunluğu da ölçüldü, HB9 GFP omurilik ekstrbitki akson asidik bölmeleri ile karşılaştırıldığında mitokondriyal parçacıkların daha yüksek sayıda ortaya. Daha sonra, tek parçacık taşıma analizi yarı otomatik yazılım ve ardından şirket içi kod kullanılarak yapılmıştır.Bu analiz, asidik komponentler ve mitokondribenzer parçacık hızlarına sahip olduğunu ortaya koymuştur. Ama sadece asidik bölmeler retrograd harekete karşı bir önyargı gösterir. Embriyonik omuriliği izole etmek ilk başlarda zor olabilir.Doğru embriyonik yaş ve uygun diseksiyon araçları kullandığınızdan emin olmak, bu prosedürü birkaç kez uygulayın. Mikroakışkan odaların kullanımı aksonal biyoloji çalışma şeklimizi değiştirir. Bir zamanlar sadece hücre vücudunda meydana geldiği varsayımıyla karşımıza çıkan lokalize aksonal süreçleri görselleştirmemizi sağlıyor.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Quantum Akson Ulaştırma Gerçek zamanlı Görüntüleme İlköğretim Nöronlar BDNF Dot-etiketli

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Nöron Dejenerasyonu

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Vivo Bileşik kas aksiyon potansiyeli Motor nöron hastalığı, fare modellerinde ön ayakları üzerinden elektrofizyolojik ölçümü

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...